抗体效价的Elisa测定

实验五 酶联免疫吸附测定 BSA抗体效价 1.目的要求 (1)学习酶联免疫吸附测定 的基本 原理 。 (2)掌握酶联免疫吸附测定技术，抗体的效价测定及 酶联免疫测定仪的使用。 2.基本原理 免疫酶技术 :酶标 Ab/Ag,酶结合物的酶在免疫反应后 ， 作用于厎物后显色 ， 根据颜色的有无和深浅 ， 定量测定 Ab/Ag。 免疫反应：一次或数次 具 Ag,Ab特异的免疫学反应 酶促反应：只进行一次 显示出生物放大作用 ， 灵敏度 ng,pg 60年代初期， Averameas & Ram等 建立了免疫酶技术 (immunoenzymatic techniques) 利用特殊的交联剂研制出辣根过氧化物酶 -人血清白 蛋白及酸性磷酸酯酶 -抗体，统称为酶标记物或酶结 合物，用于抗原或抗体的示踪、定位或定量测定 酶联免疫吸附测定 (enzyme-linked immunosorbent assay 简称为 Elisa)-是在免疫酶技术 (immunoenzymatic techniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技 术。本法兼有灵敏度高和特异性强两方面的优点。 1974年 Voller等 用聚苯乙烯微量反应板作为免疫吸附剂吸附抗体 (抗 原 )， 再与相应的酶标记物结合 操作更方便 ， 易重复 灵敏度可高达 ng（ 10-9g） 至 pg(10-12g)， (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 免疫标记技术 应用各种液相和固相免疫 分析方法，对体液中的半 抗原、抗原或抗体进行定 性和定量测定 标记抗体或抗原 荧光素、放射性同位素、酶、 铁蛋白、胶体金及化学 (或生 物 )发光剂 镜检观察或进行自 动化测定 荧光显微镜，射线测量仪，酶标 检测仪，电子显微镜和发光免疫 测定仪等 直接在细胞、亚细胞、 超微结构及分子水平上 , 对抗原抗体反应进行定 性和定位研究 酶 -性能稳定 、 经济易得 、 底物无色 、 产物显色 ， 便于检测 常用的酶 :碱性磷酸酯酶 、 辣根过氧化物酶 (horserad peroxidase简称 HRP)、 葡萄糖氧化酶 、 半乳糖苷酶等 。 酶标技术 戊二醛法， 过碘酸氧化法 将酶与 Ab交联在一起 Ag-Ab-抗 Ab-HRP TMB+H2O2 产物（黄色， OD450)+H2O 图一 直接型 Elisa 图二 间接型 Elisa 图三 双抗体夹心型 ELISA 图四 固相抗体竞争型 ELISA 未知抗原量 =A（ 1） -A（ 2） 每次反应后都要反复洗涤？ 1. 保证反应的定量反应 2. 防止重叠反应，引起非特异现象。 Partially purified, inactivated HIV antigens antigens pre-coated onto an ELISA plate 部分纯化，灭活病毒抗原 抗原涂到酶标板 Patient serum which contains antibodies. If the patient is HIV+, then this serum will contain antibodies to HIV, and those antibodies will bind to the HIV antigens on the plate.病人血清中含有抗体。如果病人是艾滋病毒 +，那么这个血清含有 艾滋病毒抗体，这些抗体可以绑定到病毒抗原板 Anti-human immunoglobulin coupled to an enzyme. This is the second antibody, and it binds to human antibodies.抗人免疫球蛋白耦合酶。这是继抗体，并结合人类抗体 substrate which changes color when cleaved by the enzyme attached to the second antibody. 基板而改变颜色，当裂解酶附二抗体 HIV (human immunodeficiency virus) detection positive negative P o s it iv e C o n t r o l N e g a t iv e C o n t r o l P a t ie n t A P a t ie n t B P a t ie n t C A s s a y C o n t r o l 1 . 6 8 9 0 . 1 5 3 O . 0 5 5 0 . 4 1 2 1 . 9 9 9 0 . 1 2 3 Protein protein interaction-ELISA 1. Direct elisa different epitope Coat with prey protein Incubate with bait protein Pimary Ab anti bait protein - 直接酶联免疫吸附试验不同表位 外套与猎物蛋白 孵化与诱饵蛋白 原发性抗体抗诱饵蛋白 2.Competitive elisa same epitope Coat with bait pr Incubate with primary antibody anti bait pr and various concentration prey protein(竞争同一表位。 外套与诱饵蛋白 培养初级抗体抗诱饵蛋白及不同浓度的猎物蛋白 ) 4. 操作方法 4.1 包被特异性抗原 :固体抗原 (如蛋白质 )用包被液稀释至 10O g/ml， 每凹孔加 100 L， 加盖置 4 过夜 (37 2h)， 次日倾去凹孔内液体 ， 用滴管取洗涤液在每孔中加 3 4滴 ， 静置 3min后倾去 ， 重复 3次 ， 将反 应板扣放在滤纸上 ， 以除净液体 。 4.2 封闭 : 每孔中加入 200 400 L封闭液 ， 加盖或用封口膜封板 ， 置 37 恒温箱 60min， 倾去孔内液体 ， 按上法洗涤 3次 。 4.3 加待测血清 (内含抗体 )、阴性血清 (无抗体 )及稀释液 (PBS/Tween): 待测血清按倍比法用稀释液稀释 (1:100、 1:200等 )，阴性血清也稀释 成 1:100，取不同稀释度的待测血清，阴性血清及稀释液 (PBS/Tween) 各 1OO L加至相应的凹孔中，加盖或封板，置 37 恒温箱 1h， 使抗体 与固相抗原进行特异性结合，反复洗涤 3次。 1 2 3 4 5 6 7 8 PBS/Tween 1:100阴性血清 1:1,000 1:5,000 1:10,000 1:20,000 1:50,000 1:100,000 阳 性血清 4.4 加酶标抗体 :按说明书要求用稀释液稀释 HRP-抗体 (抗抗体 )， 每 孔加 l00 L， 封板后置 37 温育 lh， 按上法至少洗涤 5次 ， 最后 用蒸馏水洗涤 2次 ， 扣在滤纸上吸干水分 。 4.5 显色 : 每孔加入 OPD应用液 1OOuL、 反应板置室温暗处 5 30min。 当显示橙色时应及时终止反应 。 4.6 终止反应 :每孔加入 5O L 2mol/L H2SO4。 稳定 3 5min即可比 色测定 。 4.7 检测 : 用酶联免疫测定仪，以 PBS/Tween孔为对照、测波长为 49Onm时各孔光吸收（ A） 。 1. 计算阳性血清与阴性血清 A值之比 (Positive/negative， P/N)， 当 P/N2.1 时为阳性， P/N2.1而 1.5 为可疑， P/N1.5为阴性。用目测法则以较阴性对照深色的最高稀释度 作为抗体效价。 2. 用“”“”表示，超过规定吸收值（ 0.2 0.4）的标本均 属阳性。 注意事项 (1)聚苯乙烯微量反应板应选择高质量 、 非特异性吸附小的产品 。 包 被物应具有较高的纯度 ， 其浓度一般在 1 100 g之间 ， 在偏碱条件下易吸 附于反应板的凹孔中 ， 4 放置过夜较理想 ， 若暂时不用 ， 可加入终浓度为 0.02% NaN3， 4 贮存 ， 也可倾去包被液 ， 干燥后置硅胶干燥器中 ， 室温存 放 3个月以上不影响测定效果 。 (2)反应各步均应充分洗涤 ， 以除去残留物 ， 减少非特异性吸附 。 为使 结果重复应固定洗涤次数及放置时间 ， 切忌相互污染 。 (3)为使显色反应便于比较 ， 显色后置室温暗处的时间应一致 ， 终止反 应 3 5min后应立即比色 。 必要时可设阳性对照 ， 以固定显色及终止时间 。 (4)待测抗体或抗原与酶标抗体应具有相同的免疫特异性 ， 否则无法结 合 。 自动酶标仪（ Elx800UV） 使用程序 1 开机 ， 进行 System self-test 2 按 “ DEFINE”键 ， 进入 “ SELECT ASSAY NUMBER”， 用 “ NUMERIC”或 “ OPTION”键输入测试号 （ 注： assay 01 为 quick read， 最大测试号为 55） ；按 “ ENTER”键修改测试 的 “ NAME”； 再按 “ ENTER”键进入下列菜单： 按 “ METHOD”键选择测试的波长类型 （ Single或 Dual） 、 波长大小 (340、 405、 450、 490或 630nm)、 微孔板类型 (96 孔 、 48孔或 24孔 )。 按 “ MAP”键选择阅读方式 (Auto或 Manual) 、 阅读方向 （ Down或 Across） 、 重复方向 （ Down或 Across） 、 阅读起 始位置 （ 输入编号 ） 、 空白 Map（ Air、 Full、 Const、 Column、 P-Down、 P-Across） 。 3 按 “ READ”键 ， 酶标板推进入仪器 ， 开始读数并 计数 ， 打印机输出数据 。 4 按 “ MAIN MENU”键回到主菜单，关闭电源。 酶标板的清洗： 采用 ELx50TM型微孔板洗板机，注 射泵驱动的液体输送，条状单排清洗或全板清洗 了解转膜电泳原理的应用及操作 Western Blotting or immunoblotting a specific primary antibody 1979, Towbin 1975, Southern, Southern blotting 1977, Alwine, Northern blotting 1979, Towbin, Western Blotting 1982, Reihart, Eastern blotting ,双向蛋白质印记 Western blotting: Antibodies can be used to detect specific proteins Alternate detection method Secondary antibodies Memebrane: 吸附生命大分子的固体材料 NC, nitrocellulose 硝酸纤维素膜 0.45um 结合率： 80 ug Pr/cm2 便宜，可简单快速封闭非特异性抗体的结合 NDM, nylon-densed membrane 尼龙膜 结合率： 480 ug Pr/cm2 DBM, diazobenzyloxymethyl 重氮苄氧甲基膜 湿法转移蛋白质：将 gel 和 membrane 夹在 blotter paper 中，浸在转移装置的 buffer中，通电 45min 或 over night 可完成。 Transfer Buffer (500 ml, pH 8.3) glycine 1.450 g (39 mM) Tris base 2.900 g (48 mM) SDS 0.185 g (0.037%) Using the Semi-Dry Transfer Unit 1.Remove the stacking gel from the gel. 去除堆积凝胶的凝胶。 2.Cut pieces of blotter paper to the size of the gel. note: the blotter paper (and the membrane) not be larger than the gel. Larger pieces may make contact around the gel, and allow the current an alternate route, thereby making transfer inefficient. 裁片的记事簿纸张的大小的凝胶。 注：本记事簿纸（和膜）不大于凝胶。大块的可能使接触周围的凝胶，并允许目前的替 代路线，从而使传输效率。 3. Wearing gloves rinsed of powder, cut a piece of membrane to the size of the gel. Mark the lower right- hand corner to allow for orientation. Pre-wet the membrane in transfer buffer for 2 to 5 minutes. 戴手套清洗粉，剪下一块膜大小的凝胶。标记右下角以便方向。湿膜转移缓冲液为 2到 5 分钟。 4. sandwich blotter paper membrane- gel- blotter paper make sure no air bubbles are trapped The membrane must therefore be positioned correctly the first time. Do not try to adjust. 三明治 吸墨纸纸 膜凝胶 -记事簿纸 确保没有气泡被困 膜因此必须正确定位第一时间。不要试图调整。 5. Hold the cover level and slide it gently down onto the stack. 持有的封面和滑动它轻轻地放到堆栈 6. weigh down the lid in order to ensure even contact with the stack.权衡下来的盖子，以确保即使接触堆栈。 7. Connect the unit to a suitable power supply. Turn the power supply to zero before turning on. Turn on the power supply and set to approximately 0.8 mA/cm2 of gel. Larger gels must be limited to 0.8 mA/cm2 to avoid excessive heat build up. 。 连接到一个合适的电源供应装置。 打开电源供应零之前打开。打开电源并设定约 0.8毫安 / 厘米 2凝胶。 较大的凝胶必须被限制在 0.8毫安 /厘米 2避免过度生 热。 8 mm x 7 mm mini-gels at 100 mA. Molecular Weight Transfer Period 80,000 45 minutes Problem： 蛋白质转移效率低？ （转移后对凝胶或膜染色进行观 察） 1. transfer buffer中加入 20甲醇或加入终浓度为 0.1%SDS, 可增加膜结合蛋白质的能力； 2. 使用小孔径的硝酸纤维素膜 3. 转移后的膜在含 0.2%戊二醛的 TBS中浸泡 45min。 丽春红 S， 染色后可继续进行免疫检测 灵敏度低 氨基黑 印度墨水 生物素 增强胶体金 膜总蛋白质染色 1 2泳道进行膜总蛋白质染色检测转移效率 免疫检测 灵敏度 辣根过氧化物酶： 10 20pg 碱性磷酸酶： 10 50pg 免疫金： 1 25pg 125I: 50 100pg 放射自显影术：将含放射性同位素置 X感光胶片上 感光，随后经显影，定影，即可呈现出斑点或谱带