第17章液相色谱法S

第十七章第十七章高效液相色谱法高效液相色谱法17.1 概述概述17.2 高效液相高效液相色谱色谱仪仪17.3 高效液相高效液相色谱色谱法法 的分类的分类17.4 高效液相高效液相色谱色谱法法 的应用的应用1 17-1 概述概述高效液相色谱法的特点：高效液相色谱法的特点：高压、高效、高速、高灵敏度。适用于高沸高压、高效、高速、高灵敏度。适用于高沸点、热不稳定及生化试样的分析。点、热不稳定及生化试样的分析。217-2 高效液相色谱仪高效液相色谱仪液相色谱仪（液相色谱仪（1 1）3一、流程及主要部件一、流程及主要部件1.1.流程流程HPLC与与GC的原理相同，只因的原理相同，只因HPLC流动相为液体，流动相为液体，Van.Deemter方程中，组分的纵向扩散可忽略。方程中，组分的纵向扩散可忽略。45GC和和HPLC在分离上的主要区别：在分离上的主要区别：GC：流动相为惰性气体，分离主要取决于：流动相为惰性气体，分离主要取决于 组分分子与固定相间的作用力，主要组分分子与固定相间的作用力，主要 通过改变固定相来改变对组分的选择通过改变固定相来改变对组分的选择 性。性。GLC中，流动相对组分作用极弱，一定柱温中，流动相对组分作用极弱，一定柱温 下，固定液流失主要由高柱温造成其下，固定液流失主要由高柱温造成其 自身挥发，所以，在应用中主要采用自身挥发，所以，在应用中主要采用 涂渍的方法制备柱子。涂渍的方法制备柱子。GSC中，无固定液流失现象。中，无固定液流失现象。6HPLC：流动相与组分分子间有一定的亲和流动相与组分分子间有一定的亲和 力；分离是由组分、流动相和固定力；分离是由组分、流动相和固定 相三者相互作用的结果。流动相是相三者相互作用的结果。流动相是 极性不同的有机溶剂或缓冲水溶极性不同的有机溶剂或缓冲水溶 液，溶解能力强。在液，溶解能力强。在HPLC中，固中，固 定液分子必须键合在填料上，否则，定液分子必须键合在填料上，否则，流失严重。另外，填料的颗粒流失严重。另外，填料的颗粒 直径一般为直径一般为35m，柱子制备复，柱子制备复 杂。因此，在应用中，主要以改变杂。因此，在应用中，主要以改变 流动相来调节分离的选择性。流动相来调节分离的选择性。7 高效液相色谱仪一般可分为高效液相色谱仪一般可分为4 4个主要部分：个主要部分：高压输液系统高压输液系统 进样系统进样系统 分离系统分离系统 检测系统检测系统 还配有辅助装置：还配有辅助装置：梯度淋洗梯度淋洗 自动进样自动进样 数据处理等数据处理等82.2.主要部件主要部件(1)(1)高压输液泵高压输液泵压力：压力：150350105 Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的为了获得高柱效而使用粒度很小的 固定相（固定相（10m，常用常用35m），），液体的流动相高速通过时，将产生液体的流动相高速通过时，将产生 很高的压力，因此高压、高速是高很高的压力，因此高压、高速是高 效液相色谱的特点之一。效液相色谱的特点之一。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可 调、耐腐蚀等特性。调、耐腐蚀等特性。9高压输液泵的种类：高压输液泵的种类：恒压泵恒压泵液压隔膜泵和气动放大泵。液压隔膜泵和气动放大泵。恒流泵恒流泵螺旋注射泵和往返柱塞泵。螺旋注射泵和往返柱塞泵。10（2 2）梯度淋洗装置）梯度淋洗装置 HPLC有等梯度洗脱和梯度洗脱两种。有等梯度洗脱和梯度洗脱两种。前者保持流动相组成、配比恒定。前者保持流动相组成、配比恒定。后者采用两种或多种不同极性的溶剂，在分离后者采用两种或多种不同极性的溶剂，在分离过程中按照程序连续改变流动相的浓度配比过程中按照程序连续改变流动相的浓度配比及极性。及极性。梯度淋洗的作用：梯度淋洗的作用：提高分离度提高分离度 缩短分析时间缩短分析时间 提高分析精度提高分析精度11梯度淋洗的方式：梯度淋洗的方式：内梯度内梯度高压梯度装置（目前广泛采用）高压梯度装置（目前广泛采用）利用两台高压输液泵，将两种不同极性的利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。（进入色谱柱。（先加压后混合先加压后混合）12外梯度外梯度 低压梯度装置低压梯度装置 通过比例调节阀通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例混合后，再用一台高压泵溶剂按一定的比例混合后，再用一台高压泵输入色谱柱中。（输入色谱柱中。（先混合后加压先混合后加压）HPLC梯度淋洗改变的是流动相的配比和极，梯度淋洗改变的是流动相的配比和极，提高分离效果，缩短分离时间，改善峰形。提高分离效果，缩短分离时间，改善峰形。通过改变流动相的配比和流速是通过改变流动相的配比和流速是HPLC中中 改进分离效果重要手段。改进分离效果重要手段。GC 程序升温，改变的是分析过程中的柱温。程序升温，改变的是分析过程中的柱温。13(3)进样装置进样装置 分为手动进样（进样器进样和阀进样）和分为手动进样（进样器进样和阀进样）和自动进样（自动进样器进样）两种。自动进样（自动进样器进样）两种。流路中为高压力工作状态，通常使用耐高流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置。压的六通阀进样装置。14(4)(4)高效分离柱高效分离柱 柱体为直型不锈钢管，内径柱体为直型不锈钢管，内径16 mm，柱长柱长540 cm。发展趋势是减发展趋势是减 小填料粒度和柱径以提高柱效。小填料粒度和柱径以提高柱效。常用：常用：长度为长度为10 25cm，内径为，内径为4 5mm。15(5)(5)高效液相色谱检测器高效液相色谱检测器紫外光度检测器（紫外光度检测器（UV）最常用的检测器，可用于梯度洗脱。如固定波长型最常用的检测器，可用于梯度洗脱。如固定波长型的汞灯的汞灯254nm或或280nm的紫外检测器、可调波长的的紫外检测器、可调波长的氘灯或氢灯氘灯或氢灯(200-400nm)。不锈钢池。不锈钢池10L。对对UV无吸收的组分不响应；对无吸收的组分不响应；对UV吸收较大，如苯不吸收较大，如苯不可作流动相。可作流动相。16光电二极管阵列检测器（光电二极管阵列检测器（DAD）为新型的紫外吸收检测器。以氘灯为光源，绘制出为新型的紫外吸收检测器。以氘灯为光源，绘制出随时间变化的光谱吸收曲线（随时间变化的光谱吸收曲线（A）计算机快速处）计算机快速处理，可获得分离组分的三维彩色谱图，得到更多信理，可获得分离组分的三维彩色谱图，得到更多信息。息。1718示差折光率检测器（示差折光率检测器（RID）通用型。通用型。每种物质具有不同的折光指数，可连续检测参比池每种物质具有不同的折光指数，可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值，差值与浓和样品池中流动相之间的折光指数差值，差值与浓度呈正比。灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度度呈正比。灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱。洗脱。19荧光检测器荧光检测器（FD）选择性检测器选择性检测器高灵敏度、高选高灵敏度、高选择性；择性；对多环芳对多环芳烃，维生素烃，维生素B B、黄、黄曲霉素、卟啉类曲霉素、卟啉类化合物、农药、化合物、农药、药物、氨基酸等药物、氨基酸等化合物有响应。化合物有响应。20 17-3 高效液相色谱法的类型高效液相色谱法的类型一、影响液相色谱分离的因素一、影响液相色谱分离的因素 高效液相色谱中高效液相色谱中,速率方程中的分子速率方程中的分子扩散项扩散项B/u较小，可以忽略不计。较小，可以忽略不计。H=A+C u Dm10-410-5Dg21 影响分离的主要因素有流动相的流量、影响分离的主要因素有流动相的流量、性质和极性。性质和极性。无随无随u降低降低H升高的现象升高的现象（B/u）u降低，降低，H降低，但无降低，但无Hmin u升高，升高，H平缓升高。因平缓升高。因Dm10-410-5Dg221.流速流速流速大于流速大于0.5 cm/s时时,Hu曲线是一段斜率曲线是一段斜率不大的直线。不大的直线。降低流速，柱效提高不是很大。降低流速，柱效提高不是很大。但在实际操作中，流量仍是一个调整分离度但在实际操作中，流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重要可选择参数。和出峰时间的重要可选择参数。232.固定相及分离柱固定相及分离柱气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。色谱，其选用原则与气相色谱一样。选择合适的固定相，降低填料粒度可显著提选择合适的固定相，降低填料粒度可显著提高柱效，但在高效液相色谱中，分离柱的制高柱效，但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。自行制备。选择短柱、细内径提高分析速度。研制高效选择短柱、细内径提高分析速度。研制高效柱填料是一活跃领域。柱填料是一活跃领域。243.流动相及流动相的极性流动相及流动相的极性可显著改变组分分离状况的流动相选可显著改变组分分离状况的流动相选 择在液相色谱中显得特别重要。择在液相色谱中显得特别重要。液相色谱的流动相又称为：液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。淋洗液，洗脱剂。亲水性固定液常采用疏水性流动相，亲水性固定液常采用疏水性流动相，即即流动相的极性小于固定相的极性，流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，称为正相液液色谱法，极性柱也称极性柱也称正相柱正相柱。适合极性化合物分离。适合极性化合物分离。25若流动相的极性大于固定液的极性，则称为若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，反相液液色谱，非极性柱也称为非极性柱也称为反相柱反相柱。适合非极性化合物分离。适合非极性化合物分离。4.4.流动相组成流动相组成流动相按组成不同：分为单组分和多组分。流动相按组成不同：分为单组分和多组分。按极性不同：分为极性、弱极性、非极性。按极性不同：分为极性、弱极性、非极性。按使用方式不同：按使用方式不同：分为固定组成淋洗和梯度淋洗。分为固定组成淋洗和梯度淋洗。26常用溶剂常用溶剂:己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。乙醇、乙腈、水。采用二元或多元组合溶剂作为流动相采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。性，以改进分离或调整出峰时间。275.选择流动相时应注意的几个问题选择流动相时应注意的几个问题尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子或损坏柱子试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。生沉淀并在柱中沉积。流动相同时还应满足检测器的要求。当使用流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。28二、二、高效液相色谱法的类型高效液相色谱法的类型1.1.吸附色谱（液吸附色谱（液-固吸附色谱固吸附色谱LSC）以固体吸附剂为固定相，如硅胶、氧化铝以固体吸附剂为固定相，如硅胶、氧化铝等。较常使用的是等。较常使用的是5 510m的硅胶吸附剂。流的硅胶吸附剂。流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。常用于农药成分分离、植物色素的分离等。常用于农药成分分离、植物色素的分离等。但不适合强极性离子型样品或同系物的分离。但不适合强极性离子型样品或同系物的分离。292.2.分配色谱（液分配色谱（液-液分配色谱液分配色谱 LLPC）通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定相相,通过组分在固定液和固定相中的多次分配通过组分在固定液和固定相中的多次分配平衡进行分离。平衡进行分离。分为分为正相色谱和反相色谱正相色谱和反相色谱。正相色谱：极性固定相、弱极性或非极性流正相色谱：极性固定相、弱极性或非极性流 动相动相 分离中等极性化合物。分离中等极性化合物。反相色谱：非极性固定相、以水为底剂加入反相色谱：非极性固定相、以水为底剂加入 少量有机溶剂的极性流动相少量有机溶剂的极性流动相 分离极性小的样品。分离极性小的样品。30表面多孔型表面多孔型(球形玻珠球形玻珠)：孔浅、孔层厚度小、出峰孔浅、孔层厚度小、出峰 快、柱效高，快、柱效高，但允许进样量小。但允许进样量小。全多孔型全多孔型(硅胶硅胶)：颗粒细、孔浅、传质颗粒细、孔浅、传质快、柱效高，允许进样量大，为前者的快、柱效高，允许进样量大，为前者的5倍。倍。3.3.化学键合相色谱化学键合相色谱（CBPC）用化学反应的方法通过化学键将固定液结合在担体用化学反应的方法通过化学键将固定液结合在担体表面。表面。反相反相CBPC：非极性固定相、极性流动相。非极性固定相、极性流动相。如：如：ODS(C18)，甲醇甲醇-水。水。正相正相CBPC：极性固定相、非极性或弱极性流动相。：极性固定相、非极性或弱极性流动相。如：氨基柱，正己烷。如：氨基柱，正己烷。3118烷基键合固定相的形成烷基键合固定相的形成ODS(C18)32化学键合固定相类型：化学键合固定相类型：化学键合固定相是目前应用最广、性能最佳化学键合固定相是目前应用最广、性能最佳的固定相。的固定相。（1 1）硅氧碳键型：）硅氧碳键型：SiOC （2 2）硅氧硅碳键型：）硅氧硅碳键型：SiOSi C 稳定，耐水、耐光、耐稳定，耐水、耐光、耐 有机溶剂，应用最广。有机溶剂，应用最广。（3 3）硅碳键型：）硅碳键型：SiC （4 4）硅氮键型：）硅氮键型：SiN334.离子交换色谱（离子交换色谱（IEC）固固定定相相为为离离子子交交换换树树脂脂，流流动动相相为为无无机机酸酸或或无无机机碱碱的的水水溶溶液液。各各种种离离子子根根据据它它们们与与树树脂脂上的交换基团的交换能力的不同而得到分离。上的交换基团的交换能力的不同而得到分离。345.5.凝胶色谱（空间排阻色谱）凝胶色谱（空间排阻色谱）SEC（1）以凝胶为固定相。以凝胶为固定相。（2）凝胶是一种经过交联的、具有立体网凝胶是一种经过交联的、具有立体网 状结构和不同孔径的多聚体的通称。状结构和不同孔径的多聚体的通称。如葡聚糖凝胶、琼脂糖等软质凝胶；如葡聚糖凝胶、琼脂糖等软质凝胶；多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶。多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶。（3）利用凝胶的孔径与被分离组分分子间利用凝胶的孔径与被分离组分分子间 的相对大小关系进行分离、分析，与的相对大小关系进行分离、分析，与 流动相性质无关。流动相性质无关。35（4 4）凝胶具有许多尺寸的孔径。）凝胶具有许多尺寸的孔径。KD=Cs/Cm 当当KD=1时，为凝胶的渗透极限；时，为凝胶的渗透极限；当当KD=0时，为凝胶的排阻极限。时，为凝胶的排阻极限。不同尺寸样品分子的分布系数不同尺寸样品分子的分布系数KD总保持总保持 在在0-1.0之间。之间。3637