电泳拖尾原因

1、 可以考虑是不是样品不纯，目的产物与杂带相差不大，所以要多跑一段时间 才有尾巴。参考 marker,marker 应该不会有。如果有的话说明配胶有问题。2 、琼脂糖检测 DNA 一般去 15 微升原液，加 2 微升溴酚蓝便可，注意上样浓度；3、可能是原液浓度太大造成的；4、可能 DNA 已降解。5、在提取前对样品进行一定的脱腐处理呀。很简单。有一种TENP buffer，文 献中查的到的。6、DNA 降解避免核酸酶污染。7、DNA 上样量过多?减少凝胶中 DNA 上样量。8、所用电泳条件不合适?？电泳时电压不应超过20V/cm，温度V30C,巨大DNA链，温度应V15C，核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力。9、DNA 样含盐过高?电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。10、有蛋白污染?电泳前酚抽提去除蛋白。11、DNA变性，？电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。12、电泳缓冲液的PH根据片段的大小选择合适的胶浓度和电压，胶要完全凝好 再用（微微发白）13、根据目的条带大小，选作不同浓度的胶，这个很重要，浓度通常在0.52% 之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。一 般是1%的。煮胶时，沸腾3次以上，煮胶一定要均匀，加入尽量少的EB或核酸 染料。14、点样前，先把胶放在槽里，空跑 10 分钟，预电泳，让电泳液均匀。15、预电泳后，先冲洗胶孔，点样时样品要被垂直点如，在胶孔中来回移动，使 样品均匀进入。16、电泳的电压根据电泳槽选定，别太大，不然会出现微笑型条带注：凝胶回收DNA实验的关键在哪里?参考见解：最关键的是切胶之后,溶胶的那一步.切胶的时候要尽量把多余的琼脂糖凝胶切干 净,按照实验步骤,第一步应该是将胶充分的溶化.这以后步一定要做 充分,保证凝胶已经完全 溶解了.加乙醇这步也很关键，当凝胶溶解后最好多过几次柱子。还有就是洗脱的那一步。 洗脱的时候最好用加热到60 度 的洗脱液洗脱，如果实在效果不好可以分两次洗脱。 注：琼脂糖凝胶电泳相关知识琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳 的最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻 力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数 量，而且还取决 于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子 筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不 同，根据这个原理可将其分开。电泳缓冲液的pH在69之间，离子强度0.020.05为最适。 常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率 虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为 0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达10A7bp的DNA片段。操作流程准备干净的配胶板和电泳槽注意DNA酶污染的仪器可能会降解DNA，造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象。 选择电泳方法一般的核酸检测只需要琼脂糖凝胶电泳就可以；如果需要分辨率高的电泳，特别是只有 几个bp的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳；用普通电泳不合适的巨大DNA链应该使用脉 冲凝胶电泳。注意巨大的DNA链用普通电泳可能跑不出胶孔导致缺带。 正确选择凝胶浓度对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.52%之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳， 高浓度的用来进行小片段分析。低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。 注意高浓度的胶可能使分子大小相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。 适合的电泳缓冲液常用的缓冲液有TAE和TBE,而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。电泳时使用新制的缓 冲液可以明显提高电泳效果。注意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低， pH 值上升，缓 冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。电泳的合适电压和温度电泳时电压不应该超过20V/cm,电泳温度应该低于30C,对于巨大的DNA电泳，温度 应该低于15C。注意如果电泳时电压和温度过高，可能导致出现条带模糊和不规则的DNA 带迁移的现象。特别是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象DNA样品的纯度和状态是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象DNA样品的纯度和状态注意样品中 含盐量太高和含杂质蛋白均可以产生条带模糊和条带缺失的现象。乙醇沉 淀可以去除多余 的盐，用酚可以去除蛋白。注意变性的DNA样品可能导致条带模糊和缺失，也可能出现不 规则的DNA条带迁移。在上样前不要对DNA样品加热，用20mM NaCl缓冲液稀释可以防 止 DNA 变性。DNA 的上样正确的DNA上样量是条带清晰的保证。注意太多的DNA上样量可能导致DNA带型模糊， 而太小的DNA上样量则导致带信号弱甚至缺失TIANGEN公司DNA分子量标准每次上样6ul 即可得到清晰均匀的条带。Marker 的选择DNA电泳一定要使用DNA Marker或已知大小的正对照DNA来估计DNA片段大小。Marker应该选择在目标片段大小附近ladder较密的，这样对目标片段大小的估计才比较准 确。TIANGEN公司的DNA Marker条带清晰，亮度均匀，质量稳定，是您实验的首选。需要 注意的是Marker的电泳同样也要符合DNA电泳的操作标准。如果选择入DNA/Hindlll或者 入DNA/EcoRI的酶切Marker，需要预先65C加热5min,冰上冷却后使用。从而避免Hindlll 或EcoRI酶切造成的粘性接头导致的片段连接不规则或条带信号弱等现象。凝胶的染色和观察实验室常用的核酸染色剂是溴化乙啶(EB),染色效果好，操作方便，但是稳定性差， 具有毒性。而其他系列例如SYBR Green，GelRed，虽然毒性小，但价格昂贵。TIANGEN公司 的GeneGreen相比则是性价比高的低毒替代染料，其灵敏度比传统EB染料高10倍以上。 注意观察凝胶时应根据染料不同使用合适的光源和激发波长，如果激发波长不对，条带则不 易观察，出现条带模糊的现象。注：琼脂糖凝胶电泳注意事项和常见问题核酸分子是两性解离分子，在高于其等电点的电泳缓冲液中，其碱基不解离，而 磷酸基团全部解离，核酸分子因而带负电荷，电泳时向正极迁移。琼脂糖主要从 海洋 植物琼脂中提取而来并经糖基化修饰，为一种聚合链线性分子，使用琼脂 糖凝胶作为电泳支持介质，发挥分子筛功能，使得大小和构象不同的核酸分子的 迁移率出现 较大差异，从而达到分离的目的。琼脂糖凝胶电泳操作简单、快速， 通过调整其使用浓度，使得分辨率达到大多数实验的要求，因此成为分离、鉴定、 纯化核酸分子 的常用方法。但操作过程中仍有不少要注意的问题。1 凝胶制作1. 1凝胶浓度 配制凝胶的浓度据实验需要而变，一般在0. 8%2. 0%之 间，如果一次配制凝胶100 ml，没用完的凝胶可以再次融化，但随着融化次数 的增加，水分丢失也越多，凝胶浓度则会越来越高，导致实验结果不稳定，补水 办法：一是在容器上标记煮胶前 的刻度，煮胶后补充相应的水分至原刻度；二 是在煮胶前称重，煮胶后补充水至原重量。粗略一点的方法是通过多次较恒定的 煮胶条件得出一个经验补水值。以保证 凝胶浓度基本维持在原浓度。核酸染色 剂溴化乙锭(ethidium bromide)可加在融化的琼脂糖中，终浓度为0. 5 t*g / ml；也可在电泳结束后染色。1、2 梳板的选用 一般每个制胶模具均配有多个齿型不同的梳板，梳齿宽厚，形 成的点样孑 L 容积较大，用于 DNA 片段回收实验等；相反，梳齿窄而薄，形成 的点样孑L容积就较小，用于PCR产物、酶切产物鉴定等。梳板的选择主要是看 上样量的多少而定，一般来说，上样量 小时尽量选择薄的梳板制胶，此时电泳 条带致密清晰，便于结果分析。另外，每次制胶时都要注意梳齿与底板的距离至 少要1mm，否则，拔梳板时易损坏凝胶孑L底层，导致点样后样品渗漏。当然， 点样孑 L 的破坏还与拔梳板的时间和方法有关，一般凝胶需冷却 30 min 以上方 可拔梳板，应急的情况下可以将成型的凝胶块放 4C 冰箱中冷却 15 min 左右， 拔梳板的方法是将制胶槽放置在电泳槽中的电泳缓冲液中，然后垂直向上慢慢用 力，因为有液体的润滑作用，梳板易拔出且不易损坏点样孑 L。2 点样 点样需加上样缓冲液，因为上样缓冲液中加了甘油或蔗糖增加密度，使样品沉入 孑L底；指示样品的迁移过程，上样缓冲液中一般加了两种指示剂，溴酚兰和二 甲苯 青(值得注意的是指示剂并非染色剂， DNA 染色剂是溴化乙锭，而且要在紫 外光的激发下才能看见桔红色荧光)。上样缓冲液储存液一般为6X (10X),表 示其浓度为工作浓度的六倍。使用时上样缓冲液应稀释到一倍浓度。点样方法是 将移液器基本垂直点样孑L,用另一只手帮助固定移液器下端，移液器枪头(Tip) 尖端进入点样孑L即可将样品注入孑L内，千万不可将Tip尖插至孑L底，并点 上适合的DNA分子量标准，所谓适合是指样品DNA分子量大 小应基本在DNA分 子量标准范围之内。3 电泳 将电泳仪的正极与电泳槽的正极相连，负极与负极相连，核酸带负电荷，从负极 向正极移动。电泳槽中电泳缓冲液与制胶用电泳缓冲液应相同，电泳缓冲液刚好 没过 凝胶 1 mm 为好，电泳缓冲液太多则电流加大，凝胶发热。电泳时凝胶上 所加电压一般不超过5 v / cm(指的是正负电极之间的距离，而不是凝胶的长度)， 电泳时间一般为3O60 min，根据实验需要也可作适当调整，电压增高，电泳 时间缩短，核酸条带相对来说不够整齐，不够清晰；相反，电压降低，电泳时间 较长，核酸条带整齐清晰。 另外，如果电泳后样品泳动很慢或者没泳动，请检 查胶模两端的封口胶条是否已去掉。4 结果分析 较成功的电泳结果是分子量标准条带整齐清晰，样品条带也整齐清晰，如果条带 模糊暗淡，单从琼脂糖凝胶电泳角度来说，可能的原因：溴化乙锭的质和量怎样? 溴 化乙锭见光易分解，母液配制时间过长或保存不当(一般4C避光保存一年 内有效)，或者终浓度没达到0. 5 vg/ml；电泳槽中缓冲液使用次数过多，缓 冲能力下降。特别是 TAE 缓冲液，一般用 23 次就要更换， TBE 缓冲液则可使 用 10 次左右。实际工作中经常发现 DNA 分子量标准小片段模糊不清，那足因为琼脂糖凝胶浓 度一般不会超过 2 0 ，较小的核酸片段 在它的分辨范围之内，并且 EB 带正 电荷，电泳时会向负傲移动，如果将凝胶置含EB(0. 5#g/m 1)的水溶液中30 min， 较小的片段则可重新染色：另外，溴化乙锭(EB)是一种中等强度诱变剂，操作过 程中要戴手套，并将加有EB的染色液作好标记、妥善保存.对滋时稱輕实进过程避先核酸飜得芻电泳耀冲潼陈旧电冰體冲漫多秋悭用后，翼子强度降低，pH直上升，缓冲能 力减弱，从而影响电泳效臬。建谊经启更换电泳燈冲渡所用电泳杀件K脊适电咏时电压不施超过加V/口，温度30,巨大D也捷电诙. 魁度应1521核査所用电咏鑑种液是否我足皑的蝶冲能力叫上.样童过宇减少礙蔗屮小佥上样琶风A样舎岂过电电泳前通过乙陣沉进去除过爭的盐有蛋白得染电泳前胡抽提去除蛋口DNA变性电泳前勿加热，舟2世血aC燎帥进稀韩DM对亍X/Hind I二片凰 cos位点复性电泳箭于鮎乜拥热刚5分钟，救启在冰上豁却5分钟迥泳毎件K脊适电泳电压不超过知kcm 3nx：i经常更换电沐缓冲潼mA塑性SOmH HaC Buff orUA,电冰前舸 111 热叫的上禅量不毬增加DKA的上样童聚丙烯趣観胶电咏比琼脂憶电林灵敬度 稍毎，上样量可适当隆低风A澤載避免跡人的核徴陽诃奥齢走出凝胶懈短电泳匿间，陪條电压，增再最腔浓蜃对于閱錨色的DNA,所 用曲S爭音适应用短泼长（25）的幫蚪龙馮小閃：诘辻吕凝腔懈短电泳匿间，陪條电压，增再最腔浓蜃理子大小相近的皿A带不崩分辨冷加电泳芒间，樓唯王嗨的整茨恠度DNA翌性电泳前请勿高掘加热DMA樹 民2血【W Buffer稀释DXAIKA链巨圮常规翻症电 泳K脊适在溶冲醍咬电泳上分桁