发酵种子制备与发酵机制

本章内容： 种子制备原理与技术 影响种子质量的因素 种子质量的控制措施 种子制备的放大原理与技术 概念： 种子的制备 ， 即 菌种的扩大 培养 就是把保藏的菌种，即砂土管， 冷冻干燥管中处于休眠状态的生产 菌种接入试管斜面活化，再经过扁 瓶或摇瓶和种子罐，逐级扩大培养 后达到一定的数量和质量的纯种培 养过程。这些纯种的培养物称为种 子。 种子扩培的 目的 接种量的需要 菌种的驯化 缩短发酵时间、保证生产水平 生长活力强，延迟期短； (接种后在发酵罐 中能迅速生长 ) 生理状态稳定； 浓度及总量能满足大容量发酵罐接种量的要求； 无杂菌污染 ， 保证纯种发酵； 适应性强，生产能力稳定 优良种子 应具备的 条件 /种子的 要求： 一 .发酵级数的确定 种子扩大的级数 ：制备种子需逐级扩 大培养的次数 级数愈少 ， 愈利于简化工艺及控制 ， 并可减少种子罐污染杂菌的机会 ， 减 少消毒及值班工作量 ， 减少因种子罐 生长异常而造成的发酵波动 。 种子制备原理与技术： 谷氨酸 ：三级发酵 （ 谷氨酸棒杆菌 ） 一级种子（摇瓶） 二级种子 （小罐） 发酵 青霉素 ：三级发酵 一级种子 （ 小罐 ） 二级种子（ 中罐 ） 发酵 一般由 菌丝体培养 开始计算发酵级数，但有时， 工厂从 第一级种子罐 开始计算发酵级数 发酵级数确定的依据 级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响 级数大，难控制、易染菌 、易变异，管理困难，一 般 2-4级 。 在发酵产品的 放大 中，反应级数的确定是非常重要 的一个方面 发酵级数确定方法 菌种的性质 (如菌种传代后的稳定性 ) 瓶中的孢子数 ， 孢子发芽及菌丝繁殖速度 发酵罐中种子培养液的最低接种量 种子罐与发酵罐的容积比 生产规模 随工艺条件的改变作适当的调整 二 .种子质量的判断方法 通常检测的培养液中参数 pH是否在种子要求的范围之内 糖、氨基氮、磷酸盐的含量 菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观 有无杂菌污染 其他参数，如接种前酶活、种子罐的 溶氧和尾气等 种子制备 步骤： 斜面培养基中活化； 扁瓶固体培养基或摇瓶培养基中扩大培 养，完成实验室种子制备 一级种子罐，制备生产用种子；视情况 确定扩大级数，完成生产车间种子制备； 种子转种至发酵罐 三 .种子制备过程 实验室 种子制备阶段：琼脂斜面至 固体培养基扩大培养（如茄子瓶斜 面培养等或液体摇瓶培养 生产车间 种子制备阶段：种子罐扩 大培养 种子制备过程概览 实验室阶段： 不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验 室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在 菌种室 完成，因 此现象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。 生产车间阶段 ： 种子培养在 种子罐 里面进行，一般在工程归为 发酵车间 管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。 (一 )实验室种子制备 无菌方式接保藏的菌种至斜面培养基上，成 熟后挑选正常菌落至试管斜面和摇瓶。 菌种产孢子能力强及孢子发芽、生长繁殖迅 速，可用 固体培养基 培养孢子 菌种产孢子能力不强或孢子发芽慢，可用 摇 瓶液体培养 法 不产孢子的菌种，保藏基础上，在一定温度 下 活化 即可 两个过程：在固体培养基上生产大量 孢子的 孢子制备 过程和在液体培养基上 生产大量菌丝的 种子制备 过程 孢子的产生条件？ I. 孢子制备 （ 1）放线菌孢子的制备 A .工艺过程 菌 种 母 斜 面 摇 瓶 种 子 种 子 罐 发 酵 罐 子 斜 面 B. 注意事项 限制碳源 (约 1%)和氮源 (不超过 0.5%) 培养温度多为 28 ，少数为 37 ，培 养时间为 514天 采用孢子进罐：工艺简单，批间差异小， 便于控制孢子质量；采用菌丝进罐：可 缩短种子罐内的培养时间 (尤适生长缓慢 的菌种 ) 2.霉菌孢子的制备 注意 事项 天然农产品 因具有独特的营养成分 和较大表面积而适合作霉菌的培养基 培养温度多为 2528 ，培养时间为 414天 3. 细菌孢子的制备 注意事项 适合采用碳源限量而 氮源丰富 的培 养基 培养温度多为 37 ，少数为 28 ，培养时 间细菌菌体为 12天， 产芽孢的细菌为 510天 II.种子制备 概念：指将固体培养基上培养出的 孢 子或菌体 转入到液体培养基种培养， 使其繁殖成大量 菌丝或菌体 的过程。 摇瓶种子 种子罐种子 1. 摇瓶种子制备 A. 孢子发芽或 菌丝繁殖缓慢 的菌种需将孢 子经摇瓶培养成菌丝后再进入种子罐， 摇瓶具有 浓缩种子罐 的作用，其培养基 配方和培养条件与种子罐相似。 B. 种子培养基营养应丰富完全，易被菌体 利用，浓度不宜过高 2 .种子罐种子制备 A. 孢子或摇瓶菌丝被接入体积较小的种子罐中，培养 后形成的大量菌丝，这种种子称为 一级种子 B. 把一级种子转入发酵罐中发酵，称为二级发酵 种子扩大培养阶段 液体培养法：液体试管、三角瓶摇床 振荡或回旋式培养。 表面培养法：茄子瓶、克氏瓶或瓷盘 培养。 固体培养法：三角瓶、蘑菇瓶、克氏 瓶、培养皿等麸皮培养。 实验室阶段 种子培养物 选择的原则 A. 目的：种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特点最 终的培养物可分为两类： 对于 不产孢子 和芽胞的微生物 获得一定数量和质量的 菌体 对于不产芽孢和孢子的微生物，实验室阶段的种子扩培 最终是获得一定 数量和质量 的 菌体 ，如谷氨酸的种子培 养。 获得一定数量和质量的 孢子 菌丝体培养步骤少，因而 更容易获得量和质稳定的 种子 ，但操作 繁琐 。 对于产孢子 的微生物 获得一定数量和质量的 菌丝体 便于操作，但需要更仔细的控制。 培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对 孢子培养基 应该是有利于 孢子的生长 。 B.在原料方面 ，实验室种子培养阶段，规模一般比较小， 因此为了保证培养基的质量，培养基的原料一般都比较 精细 。 起始接种物的传代问题 细菌 保藏斜面 活化斜面 产孢子 保藏 母斜面 子斜面 目的 ：使菌种的 传代次数尽可能的少 。 母瓶 ：活化、纯化，使 保藏菌种生长 ，并去处变异株。 所以接种时要 稀一点 、便于纯化生长到单菌落。 子瓶 : 大量繁殖，得到大量孢子 。 接种：从母斜面上点接种，选取生长好的单 菌落 接种时 密一点，得到大量的孢子 。 孢子培养时注意 湿度 ，子斜面使用一般不超过 1个月 孢子培养 （二）生产车间种子制备 实验室制备的孢子斜面或摇瓶种子移接到种子 罐进行扩大培养 种子罐培养一获得足够的菌种数量，二 种子 罐的培养基接近发酵罐培养的醪液成分和培养 条件，使菌体适应发酵环境 种子罐级数越少，越有利于简化工艺和控制， 并减少由于多次转种而带来的染菌机会以及 减少因种子罐生长异常而造成的发酵波动 但考虑能否在一定时间内获得优质、足量的 种子以满足发酵的需求 1。生产车间阶段种子培养物的 选择原则 在 生产车间 阶段，最终一般都是获得一定数量的 菌丝体 。 缩短发酵时间 有利于获得好的发酵结果 菌丝体 比孢子要有利： 目的：获得一定数量和质量的 菌体 ，因此培养基的选择应 首先考虑的是有利于孢子的发育和菌体的生长，所 以 营养 要比发酵培养基丰富。 在原料方面 ：不如实验室阶段那么精细，而是 基本接近于 发酵培养基 ，这有两个方面的原因 : 一是 成本 二是 驯化 例：柠檬酸发酵 （ 黑曲霉 ） 以蔗糖为原料 成分 斜面 种子罐 发酵 麦芽汁 麦汁 蔗糖 2.5-5% 20% NH4NO3 0.225% 0.11% K2HPO4 0.03% MgSO4.H2O 0.025% 0.025% KCl 0.015% 琼脂 2% 薯干粉 成分 斜面 种子罐 发酵 麦芽汁 麦汁 薯干粉 10% 22-28% (NH4)2SO4 0.5% 琼脂 2% 种子制备过程举例 一、谷氨酸生产的种子制备 制备过程 斜面菌种 一级种子培养 二级种子培养 发酵 1、斜面 培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏 1%，氯化钠 0.5 琼脂 2%， pH 7.0-7.2 培养基特点： 有利于菌体的生长，原料比较精细 培养条件： 32 ，生长 18-24小时 生长斜面要求： 生长良好，所使用 斜面连续传代不超过 3次 2. 一级 种子（ 摇瓶 ） 培养条件：于 1000ml三角瓶中，装液 200-250ml,32 培 养 12小时。 培养基： 葡萄糖 2%，尿素 0.5%，玉米浆 2.5%， K2HPO4 0.1% 培养基特点： 有利于菌体的生长，所使用的原料已经基 本接近于发酵培养基 3. 二级种子 (种子罐 ) 培养条件：在 种子罐 中培养（容积为发酵罐的 1%）， 32 培养 7-10个小时 培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用 水解糖 代替， 浓度为 2.5% 培养基的特点 ：长菌体，更接近于发酵培养基 种子的质量要求： 108-109个 /ml 大小均匀，呈单个或八字排列 PH 7.0-7.2时结束， 6.887.0 -7.2 活力旺盛 二、青霉素生产的种子制备 制备过程 安培管 斜面孢子 大米孢子 一级种子 二级种子 发酵 1、斜面孢子 培养基：甘油、 葡萄糖、 蛋白胨等 培养基特点 ： 有利于 长孢子 ，用量少而精细 培养条件： 25 、 7天 , 注意湿度 50%左右 2、大米孢子 培养基：大米及 氮源（玉米浆） 培养基的特点 ： 成本低、米粒之间结构疏松提高比表 面积和氧的传质，营养适当（要求 大米 的白点小 ）有利于孢子的生长。 培养条件： 25 、 7天，控制湿度 大米孢子的要求 ： 1粒米含 1.4*106个孢子 3、一级种子 培养基：（ 葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米 浆 目的 ： 长菌体 培养条件： 27 ， 40小时 接种量： 200亿孢子 /吨 4、二级种子 培养基：同上 培养条件： 27 、 10-14小时 接种量： 10% 种子的质量要求 菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，有中小空孢，处于 期 青霉素发酵菌丝体的生长共分为 6个期 ， 1-4为年青期 ， 4-6期合成青霉素的能力最强 四 .影响种子质量的因素 原材料质量 培养温度 湿度 通气与搅拌 斜面冷藏时间 培养基 pH 培养基，培养条件，种龄，接种量： 原材料质量 原材料质量波动引起种子质量不稳定 原材料质量波动的主要原因：无机离子 含量不同（微量元素 Mg2+、 Cu2+、 Ba2+ 能刺激孢子的形成，磷含量太多或太少 也会影响孢子的质量）。 培养温度 温度过低，菌种生长发育缓慢 温度 过高 会使菌丝 过早自溶 在制备土霉素生产种子过程中， 高于 37 培养时， 孢子接入发酵罐后表现出糖代谢变慢，氨 基氮回升提前，菌丝过早自溶，效价降低等现象。 湿度 湿度 低 ，孢子生长 快 ； 湿度大，孢子生长慢 制备土霉素生产菌种龟裂链霉菌孢子时 发现，在含有少量水分的试管斜面培养基下 部孢子长得较好，而斜面 上部 由于水分迅速 蒸发呈 干瘪状，孢子稀少 通气与搅拌 足够的通气量，以保证菌种代谢正 常，提高种子的质量 搅拌可提高通气效果，促进生长繁 殖，过度搅拌导致培养液大量涌泡， 液膜表面的酶易氧化变性，泡沫过 多增加染菌机会，增加能耗。 丝状微生物不宜剧烈搅拌。 斜面冷藏时间 对孢子的生产能力有较大影响 冷藏时间越长，生产能力下降越多 链霉素生产中，斜面孢子在 6 冷藏两 个月后的发酵单位比冷藏一个月的降低 18， 比冷藏 3个月的降低 35。 培养基 培养种子的目的： 扩大培养，增加细胞数量； 同时也必须培养出强壮、健康、活性 高的细胞。为了使细胞迅速进行分裂 或菌丝快速生长。 有较完全和丰富的营养物质，糖分少，需充足 氮源和生长因子，无机氮源比例大； 各种营养物质的浓度不必太高； 供孢子用的种子培养基，可添加易被吸收利 用的碳源和氮源； 应考虑与发酵培养基的主要成分相近 。 种子培养基特点 pH 选择最适种子培养 pH的原则是获得 最大比生长速率和适当的菌量 培养最后一级种子的培养基的 pH应 接近于发酵培养基的 pH，以便种子 能尽快适应新的环境 种龄与接种量 （一）种龄 种子罐中培养的菌体从开始移入下一级种 子罐或发酵罐时的培养时间 种子培养期应取菌种的对数生长期为宜， 菌种过嫩或过老，不但延长发酵周期，而 且会降低产量。 大量地接入培养 成熟 的菌种的优点： 缩短生长过程的延缓期，因而缩短了 发酵周期，提高了设备利用率 节约发酵培养的动力消耗 有利于减少染菌机会 放射形土壤杆菌多糖（ ARPS） 发酵过程中不同的种龄对多糖产量的影响 （舒琴） 镜检： 24小时多个杆菌首位相连成线形，处于繁殖旺盛期 30小时开始出现芽孢 种龄短：菌体 太少 ；种龄长：易 老化 。 种龄选择原则： 对数生长期末 ，细胞活力强，菌体浓 度相对较大，但是最终由实验结果定。 （二）接种量： 移入的种子液体积和接种 后培养液体的体积的 比例 接种量过多，菌丝生长过快、溶氧不足，衰 老细胞增加等，发酵后劲不足 种量过少延长发酵周期，形成异常形态，而 且易造成染菌。 以生产菌种在发酵罐中的繁殖速度为依据 接种量的大小直接影响发酵周期。 移入 种子的体积 接种量 接种后 培养液的体积 在放射形土壤杆菌多糖（ ARPS） 发酵过程中不同的接种量对多糖产量的影响 接种量对菌体形态和产 亚麻酸的影响 （杨博 亚麻酸是一种人体必需多价不饱和脂肪酸，它是人体 前 列腺素 的前体物质，在预防与 治疗心脑血管疾病、糖尿病 治疗、增强免疫力、抗癌和保护皮肤 等方面具有重要的生理 功能。因发酵法生产 亚麻酸与从 天然植物提取 相比具有一 系列优点，发酵法生产 亚麻酸成了当今研究的一个热点。 亚麻酸发酵一般是采用 丝状真菌 来进行，丝状真菌的 形态往往对发酵有较明显的影响，而丝状真菌发酵 亚麻酸 时菌丝体形态的不同对发酵的影响很少有报道。 采用被孢霉进行 亚麻酸发酵时接种量可以明显影响 菌丝体 研究发现，采用被孢霉进行 亚麻酸发酵时接种量可以明显 影响 菌丝体的形态 ，从而影响菌体干重和 亚麻酸产量 。 接种量过大过小都不好，最终以实践定，如 大多数抗 生素为 7-15%。但是一般认为大一点好。 双种 ：两个种子罐接种到一个发酵罐中。（ 加大接种量 ） 倒种 ：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。 种子罐染菌或种子质量不理想可采样倒种法，以适宜的发酵罐倒 出部分给另一发酵罐。 小结 二 生产菌种的质量控制 A. 影响 孢子 质量的因素及控制 培养基 a) 培养基的原材料 的产地 、品种、加工方法 和用量对孢子质量都有一定影响 b) 减少 水质 影响的方法：在蒸馏水或无盐水 中加入适量无机盐，供配制培养基使用 c) 斜面培养基的主要材料经化学分析和摇瓶发酵 试验合格后 才 能用于孢子培养基 d) 应保证培养基 灭菌 后的 质量 e) 水份适中 有利于孢子生长，因此斜面培养基使用前应于一定 温度下放置一定时间，使斜面 无冷凝水 两条经验： 1. 供 生产用的孢子 培养基或作为沙土孢子或传代所用的培养基 宜用 单一氮源 ，以保持正常菌落的优势。 2. 作为选种或 分离用 的平板培养基，则需采用较复杂的 有机氮 源 ，目的是便于选择特殊代谢菌落。 温度和湿度 a) 提高培养温度，可加速菌体代谢，缩短 培养时间，但 不可超过 菌体敏感温度 a) 相对湿度对孢子形成的速度、数量和质 量均有影响，北 40 45%方南方 35 42%。 培养时间和冷藏时间 a) 孢子培养时间 孢子培养时间应控制在孢子量多、孢子 成熟、发酵产量正常的阶段终止培养 一般， 衰老 的孢子核物质趋于分化，因 此不如年轻的孢子，但 过于年轻的孢子 经不起冷藏 b) 孢子冷藏时间 原则： 宜短 不宜长 举例 土霉素 菌种斜面培养 4.5d，冷藏 7 8d开 始自溶，如培养 5d，冷藏 20d也不自溶。 接种量 a) 应 适中 b) 传代用的 斜面 孢子要求菌落分布 较稀 ， 适于挑选单个菌落进行传代培养 c) 接种 摇瓶或进罐 的斜面孢子 要求菌落 密 度适中或稍密 ，孢子数达到要求标准， 一只高度为 20cm 、直径为 3cm的试管斜 面，丝状菌孢子数要求达 107 d) 接入种子罐的孢子接种量对发酵生产也 有影响 B. 影响 种子 质量的因素及控制 培养基 a) 应养成分适当 丰富和完全 ，易于被菌 体直接吸收和利用，利于孢子发芽和 菌丝生长 b) 营养成分 尽可能和发酵培养基接近 c) pH值稳定 ，浓度 较稀 培养条件 a) 采用最适温度 b) 根据不同时期需氧量不同控制通气 搅拌 ， 一般， 前期较少，后期增加 c) 产品小罐生产，可采用 补料 工艺提高种 子质量 d) pH控制 种龄 种子培养时间 a) 一般选择生命力极旺的 对数生长期 ， 菌体尚 未达到最高峰时 移种 b) 一般细菌最适种龄 7 24h，霉菌最适 种龄 16 50h，放线菌最适种龄 21 64h c) 同一菌种采用不同工艺，或不同批次 种子质量不同 接种量 a) 移入发酵罐的种子液的体积和接种后培养液的体积 的比例，称接种量 b) 较大接种量 可缩短发酵罐中菌体繁殖至最高峰所需 时间，加快产物合成，但 过大 易造成营养 不足和溶 氧缺乏 c) 过小接种量已造成营养缺乏，发酵异常 d) 加大接种量可采用 双种法 ，两个种子罐的种子接入 一个发酵罐；种子罐染菌或种子质量不理想可采样 倒种法 ，以适宜的发酵罐倒出部分给另一发酵罐 五 .种子质量的控制措施 菌种稳定性的检查 测定其生产能力，从中挑选高产菌株，并 及时对退化菌种进行复壮 提供适宜的生长环境 种子无杂菌检查，保证纯种发酵。 种子液生化分析项目主要有：营养基质的消 耗速度、 pH变化、溶氧变化、色泽和气味等 种子质量标准 细胞或菌体 生化指标 产物生成量 酶活力 种子异常的的分析 菌种生长过快或过慢、菌丝结团、菌 丝粘壁 种子制备的放大原理与技术 细菌发酵时的种子扩大培养； 细菌发酵过程中种子扩大培养的主要目的是 为了获得大量的活力强的种子 ； 种龄对于生芽孢的种子尤其重要。若接种物 含大量芽孢，将给后续发酵带来较长迟滞期 梭状芽孢杆菌 发酵 丁醇丙酮 时种子扩大培养的程序 举 例： 酵母发酵时的种子扩大培养 酿酒酵母的扩大培养 最初采用纯种进行酵母发酵并设计出 酵母繁殖流程，他将每一步的接种量 规定为 10，并控制繁殖条件与酿造 时一致 现代的流程中，接种量为 1%或更低， 控制的条件也与酿造时不同。 丝状真菌发酵的种子扩大培养 丝状真菌既可以利用孢子，也可以 利用菌丝体作为接种物接种到发酵罐 进行发酵 在固化的培养基上产生孢子 “ 滚瓶 ” 技术应用于产黄青霉的孢子生产 在固体培养基上产生孢子 在谷类的颗粒表面形成大量的孢子 在液体深层培养基中产生孢子 真菌利用 孢子 作为接种物 灰黄霉素产生菌 展青霉 一试验表明在良好的 通气条件下，培养基中含氮是在 0.05 0.1 （ w/v）之间时，可以产生大量的孢子 丝状真菌的 菌丝体 作为接种物 不能产生无性孢子的用繁殖体菌丝作 为接种物，如生产赤霉素的菌种 藤仓赤霉 问题：难以获得均一的接种物 接种前将菌丝打成碎片，形成大量的 菌丝段，它具有大量的生长点 放线菌发酵时的种子扩大培养 斜面培养，制备孢子悬浮液作初级 种子 可用培养摇瓶菌丝体作为初级种子 量：要求达到一定的浓度 质 : 形态 （生长处于某个阶段、均匀等等） 理化指标： C、 N、 P的含量， pH 酶活等 无污染 种子质量要求小结： 本章小结： 了解种子扩培的工艺过程及其中的基本概念 理解种子扩培的目的和要求 掌握控制种子质量的基本方法和手段