制片、染色及显微观察

食品微生物检验 规范操作基础培训 5 制片、染色及显微观察 福建出入境检验检疫局技术中心食品所微生物实验室 2010.05 主要内容： 1 清洗、消毒和灭菌操作 2 培养基的制备 3 采样和取、制样 4 接种、分离纯化 5 制片、染色及显微观察 6 实验室安全基础知识 5.1 显微操作 显微镜是微生物检验中最常用的精密 光学仪器。 显微镜的种类很多，在实验室中常用 的有：普通光学显微镜、暗视野显微镜、 相差显微镜、荧光显微镜和电子显微镜等。 食品微生物检验中最常用的是普通光 学显微镜。 显微镜的使用方法 用光学显微 镜观察微生物 形态时，一般 遵循先 低倍镜 观察， 后 高倍 镜观察，再油 镜观察 。 低倍镜操作方法 1.两眼从侧面注视 低倍物镜对准通光孔，使用粗调焦螺 旋将镜筒自上而下的调节，避免物镜镜头接触到玻片 而损坏镜头和压破玻片。当物镜镜头与载物台的玻片 相距 2 3mm时停止； 2.左眼注视 （注意右眼应该同时睁着），并转动粗调焦 螺旋，使镜筒徐徐上升，直到看清物象为止； 3. 再用微调焦螺旋调至清晰。 注意： 粗调调焦螺旋只用于上调载物台，如观察 显微镜时，用粗调节器调节，有压碎载玻片、损坏物 镜的危险。因此，用细调焦螺旋调节视野使其更清晰 高倍镜操作方法 1.将低倍镜观察到的目标移动至视野中央； 2.将低倍镜镜头转换成高倍镜镜头。换用高倍 镜后，视野内亮度变暗，因此一般选用较大 的光圈并使用反光镜的凹面； 3.用微调焦螺旋调至清晰。观看的物体数目变 少，但是体积变大。 注意： 高倍镜观察时，光线需增强。 油镜操作方法 1.将高倍镜观察到的目标移动至视野中央； 2.将高倍镜镜头挪开，于载玻片上滴一滴香柏油； 3.将油镜镜头移动至视野，让油镜镜头浸入香柏油（至 油晕不再扩大为止）； 4.用微调焦螺旋调至清晰。 注意： 油镜的操作需要较强的关线，故需将光线 调至最强。 用 10倍和 /或 40倍物镜为随后的高倍油镜（ 90倍 或 100倍）选择合适的视野（ 油镜镜筒上通常刻有 H.I.OIL或 OEL等标志 ） 油镜用后的处理： 第一遍：用擦镜纸拭去镜头上的油； 第二遍：用擦镜纸蘸少许二甲苯（香柏油 溶于二甲苯）擦去头上残留的油迹； 第三遍：再用干净的擦镜纸擦去残留的二 甲苯。 普通显微镜的保养 (1)观察完后，移去观察的载玻片标本。 (2)用过油镜的，应先用擦镜纸将镜头上的油擦去， 再用擦镜纸蘸着二甲苯擦拭 2 3次，最后再用擦 镜纸将二甲苯擦去。 (3)转动物镜转换器，放在低倍镜的位置。 (4)将镜身下降到最低位置，调节好镜台上标本移 动器的位置，罩上防尘套。 镜头清洁，只能用 软而没有短绒毛 的 擦镜 纸 ， 物镜的清洗，可选用不同的溶剂，如酒精、 丙酮和二甲苯等，其中 最安全的是二甲苯 。 5.2 制片和染色 染色原理 由于微生物细胞含有大量水分， 机体是无色透明的 ，与周围 背景没有明显的反差 , 必须进行染色，使经染色后的 菌体与背景 形成明显的色差 ，从而能更清楚地观察到其 形态和结构 。 微生物细胞是由蛋白质、核酸等两性电解质及其他化合物组 成。所以，微生物细胞表现出两性电解质的性质。两性电解质兼 有碱性基和酸性基，在酸性溶液中离解出碱性基呈碱性带正电。 在碱性溶液中离解出酸性基呈酸性带负电。 细菌带负电荷多，容易与带正电荷的碱性染料结合，故用碱 性染料染色的较多。 微生物中细菌、致病菌是很小的生物体，必须通过染色的方 法，在显微镜下才能看得清楚，并且还可以通过染色的方法鉴别 革兰氏染色特性，以及是否长有鞭毛、周毛、荚膜和芽孢等。 细菌的形态 杆菌 螺形菌 球菌 细菌的测量单位： 微米 (m) 细菌的大小与形态 染色方法 (一 )简单染色法 简单染色法又叫作普通染色法，只用一种 染料使细菌染上颜色，观察细菌的形态。 (二 )复染色法 用两种或多种染料染细菌，目的是为了鉴别不同性 质的细菌，所以又叫鉴别染色法。主要的复染色法有 革 兰氏染色法和抗酸性染色法。 革兰氏染色法：不仅能观察到细菌的形态，而且还 可将所有细菌区分为两大类： 染色反应呈蓝紫色的称为 革兰氏阳性细菌 ，用 G+表示； 染色反应呈红色的称为 革兰氏阴性细菌 ，用 G 表示。 细菌对革兰氏染色的不同反应，是由于它们 细胞 壁的成分和结构 不同而造成的。 实验材料 1.显微镜 、 香柏油 、 二甲苯 、 擦镜纸 、 吸水纸 、 接种环 、 载玻片 、 酒精灯 、 蜡笔等 。 2.草酸铵结晶紫染液 、 碘液 、 95 乙醇 、 蕃红染 液 、 石炭酸复红染液 3.菌株：大肠杆菌，金黄色葡萄球菌 实验内容与步骤 (一 )细菌的简单染色步骤 涂片 干燥 固定 染色 水洗 干燥 镜检 1 涂片 取干净的载玻片于实验台上，在载玻片的中央滴一 滴无菌蒸馏水，将接种环在火焰上烧红，待冷却后从 斜面挑取少量培养物与玻片上的水滴混匀后，在载玻 片上涂布成一均匀的薄层， 涂布面不宜过大 。 2 干燥 涂片最好在室温下使其自然干燥 ， 有时为了使之干 得更快些 ， 可将标本面向上 ， 手持载玻片一端的两侧 ， 小心地在酒精灯上高处微微加热 ， 使水分蒸发 ， 但 切 勿紧靠火焰或加热时间过长 ， 以防标本烤枯而变形 。 3 固定 手持载玻片的一端 ， 标本向上 ， 在酒精灯火焰 外层尽快的来回通过 23次 ， 共约 23秒钟 ， 并不时 以载玻片背面加热触及皮肤 ， 不觉过烫为宜 （ 不超 过 60 ） ,放置待冷后 ， 进行染色 。 4 染色 在涂片薄膜上滴加染色液 (石炭酸复红 、 草酸铵结 晶紫或美蓝任选一种 )一滴 ， 使染色液覆盖涂片 ， 染 色约 1min。 5 水洗 斜置载玻片 ， 在自来水龙头下用小股水流冲洗 ， 直至 洗下的水呈无色为止 。 6 干燥 用吸水纸吸去涂片边缘的水珠 ， 置于室温下自然 干燥 。 用吸水纸时 切勿将菌体擦掉 。 7 镜检 (二 )细菌的革兰氏染色步骤 涂片 干燥 固定 初染 水洗 媒染 水洗 脱色 水洗 复染 水洗 干燥 观察 1 取培养物分别做 涂片 、 干燥 、 固定 ， 方法均与简单染 色的相同 。 2 用 草酸铵结晶紫 染色 1min后水洗 。 3 加 碘液 媒染 1min后水洗 。 4 斜置载玻片 ， 滴加 95 乙醇 脱色 ， 至流出的乙醇不现 紫色 为止 ， 大约需时 2030s， 随即水洗 。 5 用 蕃红 染液复染 1min， 水洗 。 6用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下，用低 倍镜观察，发现目的物后用油镜观察，注意细菌细胞 的颜色。 革兰氏染色图解 革兰氏染色试剂 步骤 1：用蒸馏水滴瓶滴一小滴蒸馏水于洁净的载玻片上 步骤 2：用无菌操作法取少许培养物于蒸馏水滴上 步骤 3：用接种环将培养物涂布成一薄层 步骤 4：风干 步骤 5： 在酒精灯火焰外层尽快的来回通过 3-4次固定 步骤 6：结晶紫染色 1分钟 步骤 7：用蒸馏轻轻冲洗玻片 步骤 8：革兰氏碘液染色 1分钟，再用蒸馏水轻轻冲洗 步骤 9：酒精脱色至下滴液为无色，立即用蒸馏水冲洗 步骤 10：番红复染 1分钟，用蒸馏水轻轻冲洗 大肠杆菌（ Escherichia coli）革兰氏染色图 革兰氏染色阴性杆菌（红色） 金黄色葡萄球菌（ Staphylococcus aureus）革兰氏染色 革兰氏染色阳性球菌（紫色） 注意事项 1 革兰氏染色成败的 关键是脱色时间 ，如脱色过度，革 兰氏阳性菌也可被脱色而被误认 为革兰 氏阴性菌；如 脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被误认为是革兰氏 阳性菌。因此必须 严格 把握脱色时间。 2 选用培养 18-24小时菌龄 的细菌为宜，若细菌太老， 由于菌体死亡或自溶常使革兰 氏阳性菌 转呈阴性反应。 3.干净的玻片、热固定、每一步水洗要彻底并且吸干等 也是实验成功的关键。 鞭毛 化学组成： 鞭毛蛋白 功能： 运动器官 与致病有关 鉴定分类细菌 荚膜 化学组成： 多糖或多肽 功能： 抗吞噬作用 粘附作用 抗有害物质损伤作用 芽孢 脱水而成，为细菌休眠形式 功能与医学上意义： 对外界的抵抗力增加 可发芽成繁殖体有致病性 有鉴别作用 应以杀死芽胞为灭菌效果的指标 菌毛 化学组成： 菌毛蛋白 种类与功能： 普通菌毛 与致病有关 性菌毛 与遗传变异有关