动物细胞大规模培养生产蛋白的工艺选择

动物细胞大规模培养生产蛋白的工艺选择3米 力 陈志南33(第四军医大学细胞工程中心国家 863西安细胞工程基地 西安 710032摘要 目前全世界蛋白治疗药物的迅速增长和市场需求已远远超过了现有生产 能力。动物细胞规模化生产重组蛋白和抗体的工艺选择可考虑使用当前较成熟的工业化支持技 术平台,以缩短产品工艺研发的时间,加快工业化进程。当前被 FDA 批准的生物技 术产品以及公开发表的生产工艺占有主流优势的是搅拌式生物反应器悬浮培养,工 艺设计是流加或灌流培养。其大规模细胞培养生产所面临的挑战是获得最大生产力 的同时注重维持产品的质量;去除所有培养环境中外源因子的污染,更为精确有效的 工艺控制手段,规模化培养中氧气的限定与溶解 C O 2浓度累积的控制等。关键词 动物细胞 大规模培养 生产蛋白收稿日期:20032042103 国家重大科技专项 (2002AA2Z 344133通讯作者，电子信箱:chcerc2动物细胞大规模培养已成为生物制药领域最重要的关键技术之一,并以其 研究的深入和进展推动生物技术产业的迅速发展。专家预言:蛋白治疗药物如糖蛋 白，抗体和多肽药物仅仅只是开始进入市场，预计在下一个 10年或 20年会有一个更 为快速的发展。蛋白治疗药物的迅速增长和市场需求已远远超过目前全世界的生产能力1由于动物细胞表达产品需求的紧迫性和生产工艺的复杂性,大大促进了该技术 的深入研究与发展。80年代初首先兴起了生物反应器研究,许多形式的生物反应器 被用于哺乳动物细胞培养工艺的研究,如中置搅拌系统,固定单层培养和中空纤维系 统等。近 10年的研究在解决动物细胞大规模培养的关键屏障技术,如限制性氧气的 提供,消耗产物的积累,成熟精确的过程控制,剪切力的敏感性,和贴壁细胞培养规模化 放大等问题都取得可喜的进展2。目前动物细胞工业化生产中主要致力于提高单位细胞的生产力,确保产品质 量和过程工艺设计的一致性,减少工业化生产中的污染与自动化控制等3。以转基因动物和转基因植物为载体的重组蛋白生产在生物制药领域仍具有重要的地位,特别对于每年100kg的超大规模需求量生产。目前被美国FDA批准的生物技术产品和已公开发表的生产工艺,都是较为成熟 的工艺,并不代表当前动物细胞研究发展的趋势。因此动物细胞大规模培养生产蛋 白或抗体的工艺选择,应综合考虑产品特点、工艺难度与工艺研发时间,以加速其产 品产业化的进程。以下就目前动物细胞大规模培养成熟工艺与当前研究的问题、对策作一简述。1目前美国FDA批准的产品与生产工艺1996年1月至2002年12月美国获得成功批准的不同的治疗剂和诊断剂产品共31种,其中用哺乳动物细胞培养生产的就有21种（美国FDA网页http : nnw w w.fda. g蛋白治疗药物有单克隆抗体治疗乳 腺癌的Herceptin，免疫球蛋白肿瘤坏死因子（T NF受体融合蛋白治疗类风湿性关节 炎的 Enbrel 和灭活的甲肝疫苗 Vaqta 等。动物细胞培养技术已经成为一个受到普 遍信任的产业化生产技术,并逐步形成商业化操作水平。按技术应用专利的分类,我 们将这些产品分为重组治疗药物、疫苗、组织培养产品和诊断试剂并连同他们的生 产形式列于表 1。总结表1的数据,在 21种产品中有11种产品是用 3种主要的细胞系 CH O、 SP2nO、NS O生产的重组蛋白治疗药物。首先重组治疗药物，主要是重组蛋白或抗 体,对产品应用最有代表性的需要是生产第 23 卷第 7 期中国生物工程杂志CHI NA BI OTECH NO LOGY2003年7月表1 B LA哺乳动物细胞培养系统来源产品详细数据a(19962000 BLA产品名厂商批准日期产品形式细胞系方法培养液重组蛋白T enecteplasenT NK ase急性心肌梗死G enentech6n2n00重组糖蛋白CHO无报道无报道抗血友病因子G enetics Institute3n6n00重组糖蛋白CHO连续灌流无血清TrastuzumabnHerceptin转移性乳腺癌G enentech9n25n98嵌合抗体CHO搅拌生物反应器，悬浮无血清In fliximabnRem icadeCrohns diseaseCentocor8n24n98嵌合抗体NSO搅拌,悬浮灌流培养无血清PalivizumabnSynagis预防呼吸道病毒M edImmune6E9n98嵌合抗体NSO搅拌,悬浮流加培养无血清BasiliximabnS imulect预防急性器官排斥N ovartisPharmaceuticals5口12口98嵌合抗体鼠骨髓瘤搅拌,悬浮灌流培养无血清DaclizumabnZ enapax预防急性器官排斥H offman2LaR ochel2E0n97嵌合抗体SP2n0无报道无报道RituximabnRituxan淋巴瘤 IDEC PharmaceuticalnG enentech11口26口97嵌合抗体CHO搅拌,悬浮培养含庆大酶素C oagulation factor X重组凝集因子G enetics Institute2Ein97重组糖蛋白CHO搅拌，悬浮，反复批式培养无血清Interferon21anAv onex治疗复杂性硬化Biogen5E7n96重组糖蛋白CHO搅拌，悬浮培养无报道疫苗轮状病毒 W yeth Laboratories8n3in98 肝过滤病毒疫苗 FRh L22N ot revealed 含胎牛血清狂犬病毒Chiron Behringl0n20n97灭活狂犬病毒无报道无报道无报道甲肝疫苗M erck&C。3口29口96灭活病毒人二倍体纤维母细胞Adherent，NCF to C ostar Cubes连续流加培养含血清组织培养产品自体同源培养chondrocytesnCarticel软骨缺陷修复G enzyme T issue Repair8n22n97自体同源细胞软骨细胞组织培养饼含血清诊断试剂产品人T淋巴细胞病毒用于酶联E LIS A Abbott Laboratories8E5n97抗体慢性感染人T、B 淋巴细胞无报道无报道Capromab pendetide肿瘤诊断Cytogenl0n28n96鼠IgGl杂交瘤中空纤维反应口口器无血清含牛血清白蛋白,转铁蛋白N ofetum omabnVerluma肿瘤诊断Dr K arl Thomae8n20n96鼠IgG2b Fab抗体杂交瘤无报道无血清Imciromabpentetate心肌诊断Centocor7n3n96鼠IgG2Fab抗体杂交瘤无报道血清，含庆大酶素a2000年至 今又有7个动物细胞表达的重组蛋白和抗体药物被FDA BLA批准，但因多数无有关 工艺的报道，此表未显示产量与质量，其生产形式至少 70%是采用搅拌式生物反应器悬浮培养形式，50% 以上采用无血清培养;疫苗和组织替代品其产品来源许多不用的细胞系，它需要特殊 的生物反应器系统和培养液;虽然用于诊断的产品主要是单克隆抗体，类似于重组治 疗，但需求量明显低，这就允许考虑多种特殊的生产形式和生物反应器系统。因此，目前用哺乳动物细胞大规模培养生产蛋白的工业化过程，可以看作是以搅 拌式生物反应器悬浮培养作为通用技术平台，使用常用的3种细胞（CH 0、SP2nO、 NS O依托该平台工艺并使其生产能力提高。平台工艺的特点是采用无血清培养和 成熟的流加和灌流工艺。2 目前公开发表工艺的研究目前被批准的生物技术产品以及公开发表的工业化生产工艺,都建立在这个产 品进入临床研究之前,因此这些技术不代表当前动物细胞研究发展的趋势,在工业化 逐级放大生产过程中有些已体现出一定的滞后问题3。2中 国 生 物 工 程 杂 志第 23卷当前哺乳动物细胞培养工艺中占有主流优势的是悬浮搅拌式培养工艺,特别是 在重组治疗性蛋白和抗体的规模化生产。在工业化生产中,悬浮培养工艺参数的放 大原理和过程控制比其它培养系统较易理解和掌握,因此在规模化动物细胞培养生 产中多选择悬浮细胞培养工艺（表1。M oran等和Schenerman等5悬浮流加培养 CH 0、NS O细胞，在I 2III期临床研究单抗的生产放大中使用了 202 452100L生物 反应器，工业化生产放大到500220002 10000L，放大过程的工艺性能和产品特点都非 常相似。Sauer等用搅拌式生物反应器，无血清流加培养SP2nO、NS O细胞生产人 源化IgG抗体，工艺优化过程从3L215L2750L直接放大，其细胞密度，特异性抗体产 生率和产品质量非常相似。作者认为一个好的细胞培养平台系统可适用于许多不同 重组蛋白或抗体的生产，选择适宜的平台系统可有意义地减少工艺过程所需的时间 6。悬浮贴壁细胞培养的传统方法是采用转瓶、堆积床和微载体悬浮培养，转瓶和 堆积床培养的放大生产受到很大的限制，悬浮微载体培养是目前疫苗生产常采用的 种形式。Wiktor等用悬浮微载体培养Vero细胞生产狂犬疫苗，初始工作种子在 1L生物反应器培养,然后是放大至5L225L2150L生物反应器，以后还可在放大到 1000L或采用多个150L的生物反应器，最后有效地感染病毒7。非传统的贴壁细胞 培养选用气升式生物反应器、膜透析生物反应器和填充床灌流培养等。211 悬浮细胞培养工艺悬浮培养适于许多细胞培养，如杂交瘤、鼠骨髓瘤（SP2nO,NS O,对适于贴壁培 养的细胞（CH O, BHK可进行细胞生长形式的驯化。目前已发表的大量文献,就继续 深入研究和进一步解释如何提高单位细胞的生产力;如何优化培养环境获得最高的 产量,同时保持最好的产品质量;如何去除培养液中动物来源的成分,使大规模生产中 的污染最小化;如何控制培养过程中的C O2的积累等进行了论述。在大规模细胞培养中,细胞死亡是维持细胞高活性和高密度的最大障碍,由于在 悬浮培养工艺中，细胞的死亡主要是因凋亡所致。通过导入凋亡抑制基因（BC122来 调节细胞抗凋亡的机制,延长细胞生存时间,促细胞活力和增加抗体的产量8。悬浮培养工艺中影响细胞生产数量和质量的因素，主要应考虑细胞培养环境（营 养条件、产物积累、pH、温度和渗透压，终产物（乳酸和氨毒性累积和必需营养物的 添加等。设计适应细胞生长的无血清培养基，控制营养物的添加，减少产物消耗积累 是解决问题的有效手段。1996年X ie等运用化学计量法，根据动物细胞生长的需 求，设计定量添加浓缩的培养液，将葡萄糖、谷氨酰氨的浓度维持在一个低水平，以改 变细胞代谢方式。在杂交瘤细胞流加培养周期超过550h，比较一般流加工艺特异性 乳酸生成率减少了 4倍，特异性氨生成率减少了 10倍，细胞密度5xl07nm 1,峰值的活 细胞密度大于115xl07nml,抗体累积浓度为214mgnml10。细胞培养过程的有效工艺参数控制,Enda等在两组流加悬浮培养的不同工艺参 数控制（如pH,温度，结果温度控制为34C比较37C,平均生长率降低而特异产物生 产率提高;当细胞外pH维持在812和619时，重组蛋白的糖基化将发生有意义的改 变11。另外有许多报道，批式培养在高渗透压环境可增加抗体浓度。高渗透压不仅影 响抗体的产量，还影响生长速率，生长指数持续时间和细胞的死亡率。渗透压范围在 350-400m0sm,特异性抗体产生率可较多地补偿细胞生长率和最大细胞密度的减少， 以得到理想的最终抗体浓度12。确保产品质量与无血清培养工艺的一致性是当前重组蛋白生产中最为关注的问 题。Schenerman等在人源化抗体（Synagis放大生产过程中，用3个评价工艺参数（最大反应体积的群体倍增时间;低糖培养条件;回收后稳定时间对工艺放大过程进行 了相似性比较研究,以确认工艺放大与产品质量的一致性。结果显示在生物反应器 逐级放大过程的早期,抗体表达存在着不同的糖基化形式;培养环境和条件的变化对 细胞系的稳定性和抗体结构、活性滴度都没有影响5。对于搅拌的剪切损害可通过反应器的优化被减少,另外在培养液中添加剪切保 护剂,Pluronic F68是使用最为广泛、研究最多的保护性多聚体，它可在细胞与气泡的 接触面形成保护层,以减少动力学表面的张力。212 贴壁细胞培养贴壁细胞培养主要解决工艺放大的问题。微载体无消化直接接种细胞的有关研 究,Zhang等用3第 7期米 力等:动物细胞大规模培养生产蛋白的工艺选择个3L15L搅拌生物反应器内置一个旋转过滤器，灌流微载体培养CH O细胞 生产重组人单核细胞集落刺激因子（hST C,连续培养2个月，其工艺特色是直接接种 微载体培养无细胞消化步,在工艺中需要反复优化增加微载体的表面积和高微载 体浓度下的搅拌形式。确保产品质量与培养工艺的致性对贴壁细胞培养同样至关 重要。Zhang等用完全相同的hST C全长cDNA克隆baculovirus转染SF29昆虫细 胞表达，在60L生物反应器生产，虽然生产方法和微载体灌流培养CH O细胞的产量 相似，但CH O细胞生产的hST C和SF29昆虫细胞生产的hST C有不同的糖基化形 式，因此说明糖基化形式对哺乳动物细胞表达产品的生产非常重要13。目前报道的贴壁细胞生产工艺，最佳的生物反应器形式是搅拌式微载体悬浮培 养系统，最大放大到10000L，并可提供最有效的优化工艺和最适宜的流加工艺设计。 最佳的工艺设计是高密度连续灌流培养,最近在30L生物反应器高密度微载体连续 灌流培养Vero细胞生产人狂犬疫苗，微载体数量达到25gnL细胞密度可以达到12xl09nml,这项技术的进步主要是生物反应器提供一个独特的细胞沉降系统，高氧气传输系统,和高营养环境及强的pH缓冲体系14。流加培养（fed2batch和灌流培养（perfusion是动物细胞培养工艺中最常用的两种 操作方式。另外可供选择的方式还有批式2反复流加（batch2 refeeding。虽然许多较 老的病毒生产工艺采用批式操作（batch，新的病毒疫苗生产已采用改良的生产形式如 批式 2反复流加或灌流培养工艺。流加培养工艺的基础是用搅拌生物反应器,营养 物的添加主要考虑减少代谢废物的积累和营养的均衡,维持一个高细胞密度和高产 物浓度。灌流悬浮培养在生物反应器的设计上必须考虑细胞截流。流加悬浮培养与 灌流悬浮培养在操作形式上并无明显不同,两种操作形式的选择完全取决于每个产 品潜在的细胞生长活力与相关产物的稳定性,以及产品的最高产量需求和质量要 求。213 悬浮和贴壁细胞生产工艺的共性问题近年来有许多有关动物细胞批式培 养生产工艺中在线监控的研究,限制氧气供给,通过氧气测定优化添加工艺的研究 15。有关动物细胞培养的代谢和生理学研究以往多集中在乳酸和氨,在工业化生产 尤其在高细胞密度时,C O2的积累可产生毒性或改变细胞的代谢。G arnier等的结果是CH O细胞可耐受的最大CO2浓度为33%（250mm Hg时,C O2浓度18%时细胞生长受到抑制。动物细胞通过在线监控氧气吸收率以控制优化培养环境,C O2溶解率的监测与控制是通过控制最小氧气需求量而实现的,Bjorn Frahm等，用 “关气”法测定哺乳动物细胞悬浮培养的溶解CO2浓度和HC O3浓度以及C O2产生率。Pattis on等报道用一个在线C 02溶解率分析（Y SI8500在哺乳动物 细胞和微生物发酵工艺中的应用，在302000L搅拌反应器微载体悬浮培养，结果证明C O2积累对细胞生长、产物提高都是不利的，使用纯氧微通气以避免过多气泡伤害，通过在线分析 C 02溶解率，以氮气调节控制溶解C O2的积累16 。动物细胞培养过程的污染，在规模化生产中一直是不可低估的问题。污染原因极有可能是病毒或培养液中动物组织潜在的一些转染物，其它污染主要来源于不完善的工艺条件,被动的控制方法是使用抗生素,在商业化产品中抗生素的含量也存在 着潜在的危险17。无血清无蛋白培养一直是动物细胞培养的研究主题。动物血清成分添加培养在 工业化生产过程中已逐渐被FDA限制。细胞起始在培养小瓶驯化无血清条件，后来 放大到生物反应器悬浮培养最终要形成小的团块。无蛋白和无胆固醇培养已成功地 培养杂交瘤和转染谷氨酸合成酶的骨髓瘤细胞系NS 0（正常胆固醇缺陷株用于生产 人单克隆抗体18。贴壁细胞的无血清无蛋白培养通常需挑选特殊的克隆，再克隆或适应每个新克 隆。通过分子遗传途径解决细胞依赖血清生长因素,CH 02K1细胞系转染胰岛素和 转铁蛋白基因，细胞依赖自身合成所需的生长成分而有效生长19。最为理想和有希望的研究是用机器人自动控制生物反应器,Lutkemeyer等已经 成功显示机器人可执行20100L反应器的无菌取样程序和提交样品到指定的分析 仪器20。3结论回顾当前动物细胞规模化生产重组蛋白和抗体的工艺中占有主流优势的是搅拌 式生物反应器4中 国 生 物 工 程 杂 志第 23卷悬浮培养，工艺设计是流加或灌流培养。就美国FDA BLAs批准公开的工艺，在 动物细胞生产重组蛋白和抗体的工艺选择可考虑使用以上较成熟的工业化支持技术 平台,除少数特殊细胞系对工艺设计选择的多样性,对同类产品或同类细胞进行工艺 研发和放大,以缩短产品工艺研发的时间,加快工业化进程。当前大规模动物细胞培养生产所面临的挑战,是获得最大生产力的同时注重维 持产品的质量;去除所有培养环境中外源因子的污染,更为精确有效的工艺控制手段, 规模化培养中氧气的限定与溶解C 02浓度累积的控制等。参考文献1 M orrow K J.Antibody production.G enetic Engineering News, 2001,21(7:12 W ei2Shou Hu,John G A.Large2scale mammalian cell culture. 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Mammalian cell2culture production of recombinant proteins and antibodies indicates that production is still faced with significant challenges maximizing productivity while maintaining product quality , removing all animal derived components from cell2culture medium , and controlling carbon dioxide removal . Key words Animal cell Large2scal culture Production protein g. fed2batch or perfusion . Recently approved FDA BLAs and the published literature both suggest that companies may 易所 、 广州生物工程中心 、 广东国际科 技贸易展览公司生物技术高峰论坛主题 : 生物技术产业化 、 工业生物技术前沿 、 生物医药高新技术研发模式的探讨 、基 因工程药物的研究开发 、 肿瘤生物治疗 药物产业化开发、 香根草生物技术及其在中国的产业化前景 、 基因 芯片技术的 新进展、 海洋生物制药 、 海洋生物技术与海洋经济 展会及论坛联系方式 : 广东 国际科技贸易展览公司联系人：王国斌电 ：020*口话83558312 传 ：020*口 真 83561724 电子信箱：ste ste. com. cn be considering the use of platform technologies to speed up process development timelines. Large2scale cell2culture第二届中国(广州国际生物技术及仪器装备展览会暨生物技术高峰论 坛时间 ：2003 年 5 月 20 - 22 日 地点 ： 广州中国出口商品交易会展馆主办单位 ： 广东省科学技术厅、中国生物工程开发中心、中国生物工程学会承办单位 ：广 东省对外科技交流中心、广东省分析测试协会 、中国广州分析测试中心、广州 技术产权交 Industrial Choices for Protein Production by Large2scale Animal Cell Culture Mi Li Chen Zhinan (National 863 Project Xi Cell Engineering Base The Fourth Military Medical University , an Cell Engineering Research Center Xi an 710032