果胶酶活性测定实验报告

一、实验设计实验序号实验三I实验名称I特定产物工业生产菌种发酵试验时间2010年13日-23日 实验室 基础生物2 （121）一、实验目的1、掌握菌种选育、菌种发酵条件的优化和微生物酶制剂酶活测定的基本方法；2、了解酶学性质的研究.3、了解影响果胶酶对果汁澄清效果的各种因素二、实验与原理1、果胶酶概况（1）、果胶质：是高等植物细胞壁内及细胞壁间的结构性多糖，是一类高分子碳 水化合物，它的存在往往给果蔬加工等工艺带来许多麻烦和损失。（2）、果胶酶：是指能分解果胶质的多种酶的总称，广泛存在于高等植物和微生 物中。（3）、产生果胶酶的微生物：细菌、放线菌、酵母和霉菌，但目前商品果胶酶多 数来自霉菌。（4）、果胶酶的应用：主要是用于果胶的分解，在水果加工、葡萄酒生产、麻类 脱胶和饲料等方面有着广泛的应用。2、果胶酶的酶活测定方法（1）、粘度降低法：利用粘度计测量在一定温度、酶浓度和一定反应时间内，标 准果胶溶液的粘度降低值。（2）、脱胶作用时间法：以脱胶作用的时间来测定果胶酶的酶活力。（3）、次亚碘酸法：用滴定法定量测定半乳糖醛酸的生成量，以表示果胶酶的活 力。（4）、还原糖法（DNS法）：根据果胶酶水解果胶生成半乳糖醛酸，后者是一种 还原糖，与3, 5 -二硝基水杨酸共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定 的范围内，还原糖的量和反应液的颜色呈比例关系，可利用比色法在540nm进行 测定。3、微生物发酵生产产品受以下条件制约：（1）、培养基成分：C源、N源、无机盐、水和生长因子（2）、培养条件：温度、pH、溶解氧等（3）、附加条件：诱导物、表面活性剂等4、酶催化反应的进行受多种因素的影响：底物浓度、酶浓度、温度、pH、激活 剂、抑制剂三、设备与材料（一）、培养基1、菌种筛选使用培养基（1）、基本培养基：果胶1%、磷酸氢二钠0.5%、蛋白胨1%、pH4.5、琼脂2.0%。（2）、分离培养基：果胶0.5%、磷酸氢二钠0.5%、琼脂2.0%、H4.5。（3）、发酵培养基果胶1%、磷酸氢二钠0.5%、蛋白胨1%、pH4.5。2、黑曲霉Asp-2固体发酵培养基菌种斜面培养基（查氏培养基）：NaNO3 0.2%、K2HPO4 0.1%、KC10.05%、MgSO40.05%、FeSO4 0.001%、蔗糖 3%、琼脂 2.5%、自然 pH。3、种子培养基：麸皮 3.0%、橘子粉 2.0%、硫酸铵 0.5%、葡萄糖 1%、KH2PO4 0.1%、pH4.5。4、固体发酵培养基：麸皮 10g、橘子粉 2.5g、（NH4）SO4 0.1g（0.8% 干料计）、葡萄糖 0.125g（1%十料计）、水15ml。（二）、试剂1、酶活测定使用试剂（1）、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液：称取柠檬酸15.652g，柠檬酸钠7.5g，溶解定 容至 1000ml，用 0.1M NaOH 或 0.1M HCl 调节 pH 至 3.0。（2）、底物0.25%果胶溶液：称取0.25g果胶，用上述缓冲液溶解，在电炉 上加热至完全溶解，用缓冲液定容至100mL，储存于4C，7天内有效。（3）、DNS试剂：称取酒石酸钾钠182.0g、溶解于500 mL水中，加热（不超过 50C),于热溶液中依次加入3-5二硝基水杨酸6.3g,氢氧化钠21.0g,苯酚5.0g, 无水硫酸钠5.0g，搅拌均匀至溶解，冷却后定容至1000 mL,储存于棕色瓶中， 室温保存，710天后过滤使用。(三) 、仪器(1) 、烧杯、三角瓶、试管、移液管、洗耳球、量筒、容量瓶、试剂瓶、研钵等(2) 、天平、灭菌锅、超净工作台、培养箱、电炉、恒温水浴锅、记时器(精确 到秒)、分光光度计等。四、实验方法步骤(一)、果胶酶产生菌的分离稀释涂布平板法1、菌种的采集要获得产生果胶酶的菌种，可从富含果胶酶作用底物的场所去采集。胞外酶的稳 定性和最适反应条件通常和菌的最适生长条件一致，因此要筛果胶酶时，只要到 相应的环境中采样即可。(果树下面的土壤里)2、倒平板配制分离培养基 高压灭菌30min冷却至约50 C 倒56块平板/100mL 冷 却备用3、制备土壤稀释液(1) 称取土样10g,放入90mL无菌水中(带玻璃珠)，摇动10min,静置10min, 制备得到10-1 土壤稀释液；(2) 用无菌吸管吸出1mL 土壤悬液，加入盛有9mL无菌水的大试管中，充分混 匀，制备得到10-2 土壤稀释液；(3) 再从中吸出1mL加入盛有9mL无菌水的大试管中，混匀后得到10-3 土壤稀 释液；(4) 以此类推，分别制备得到10-4、10-5、10-6、10-7 土壤稀释液。4、涂布用无菌吸管分别吸取10-3、10-4、10-5、10-6和10-7 土壤稀释液各0.1mL, 对号放入已经写好记号的平板中央，用无菌玻璃涂棒涂匀。5、富集培养采集到的样品中如果所需的菌很少，需要先经过富集培养，使所需的菌大量繁殖，而不需要的菌则不生长或少生长，以利于筛选。培养时控制培养的温度、pH和营养成分等。6、菌种的分离培养基里含有果胶，能利用该底物生长的菌种就是所需要的产果胶酶菌种。7、纯化挑取其中透明圈较大的单菌落，划线于平板，37倒置培养23d；如发现杂菌需再一次进行纯化直到获得纯培养。（二）、果胶酶产生菌的发酵1、配置发酵培养基40mL/瓶。2、分别挑取细菌和霉菌菌落接种于发酵培养基中。3、37C、200r/min 摇瓶发酵约 72h。（三）、果胶酶的活性测定（1）、待测酶液的制备将发酵液离心，取上清液用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液稀释10倍（2）、制作标准曲线半乳糖醛酸溶液（ml）0.00.20.40.60.81.01.2半乳糖醛酸（mg）0.00.20.40.60.81.01.2缓冲液（ml）2.01.81.61.41.21.00.8DNS (ml)3333333定容总体积（ml）20202020202020OD (540nm)（3）、酶活的测定操作步骤空白管样品管A样品管B步骤1吸取1.8mL果胶底物溶液吸取1.8mL果胶底物溶液吸取1.8mL果胶底物溶液步骤237C保温5分钟37C保温5分钟37C保温5分钟步骤3加入待测酶液0.2ml加入待测酶液0.2ml步骤437C精确保温30min37C精确保温30min37C精确保温30min步骤5加入3mLDNS试剂终加入3mLDNS试剂终加入3mLDNS试剂终止反应止反应止反应步骤6混合均匀混合均匀混合均匀步骤7加入0.2ml待测酶液，沸水浴煮沸5min沸水浴煮沸5min沸水浴煮沸5min步骤8流水冷却流水冷却流水冷却步骤9加蒸馏水15mL混匀加蒸馏水15mL混匀加蒸馏水15mL混匀步骤10OD540nm 比色OD540nm 比色OD540nm 比色二、实验报告（一）、实验结果及现象1、标准曲线半乳糖醛酸（mg）0.00.20.40.60.81.01.2OD 值（540nm）0.0000.0850.2410.4050.5500.7030.850半乳糖醛酸标准曲线2、酶活测定值菌种类型细菌霉菌OD 值（540nm）0.0830.0870.0070.0070.0830.1030.0020.002平均OD值0.0890.0045酶活计算（细菌）（1.3623*OD+0.0484）*N*1000酶活E=6.159umol/ml0.2*194.14*10（二）、实验总结和分析1、注意事项（1）、接种时的注意事项接种方式是液体一固体，用灭菌的移液管或10ml量筒接种或大枪头；接种后振 荡接种瓶，使菌种充分与固体培养基混合。（2）、酶活测定注意事项试管上编号：贴上用圆珠笔写上编号的胶布，以防止保温或沸水加热时脱落； 移液枪的使用：向试管内加入待测酶液或DNS时，枪头不要触碰管壁，也不要 伸入液面下，连续吸取同一种溶液时可以不用更换枪头；精确记时：每一管加入酶液的时间要做记录，每管之间间隔的时间要合理；避免试管进水：煮沸和用流水冲洗时；（3）、UV2000型分光光度计的使用注意事项提前半小时接通电源，打开机器开关使仪器通电，自检；将对照液及测定液分别装入比色杯3/4体积并用镜头纸擦干外壁，放入样品室； 调节测定所用波长；读数完毕，打开仪器盖板，关闭开关，将比色杯冲洗干净、浸泡于30%酒精中。2、实验总结实验菌种的采集不成功，没有到要求的地方采集，也可能是温度较低不适宜 菌体生长；菌种分离纯化时可能是无菌操作不严格，导致平板上面杂菌滋生，没 有分离出目的菌种，各方面的操作都有不严谨之处，最后得到的酶活性较低，实 验做的不是很成功。3、参考文献【1】、陈守文主编.酶工程.北京：科学出版社，2008【2】、沈萍.范秀容.李广武 微生物学实验2000【3】、于龙江主编.发酵工程原理与技术应用.北京：化学工业出版社，2006.6【4】、田国政酒曲根霉糖化性质的研究期刊论文-湖北民族学院学报（自然 科学版）2003（02）【5】、刘建军.姜鲁燕 根霉PE-8菌株的选育及其淀粉降解酶类的研究1998（02） 【6】、全国食品发酵标准化中心等单位编制.工业用酶制剂行业标准资料汇编.M.1993:37 44。【7】、沈萍.范秀容.李广武微生物学实验2000【8】、刘建军.姜鲁燕 根霉PE-8菌株的选育及其淀粉降解酶类的研究1998(02)【9】、孙君社.酶与酶工程及其应用.北京.化学工业出版社.20064、教师评语及评分签名: