实验五离子交换柱层析法分离氨基酸

实验六实验六离子交换柱层析法分离氨基酸离子交换柱层析法分离氨基酸目的要求（1）学习采用离子交换树脂分离氨基酸的基本原理。（2）掌握离子交换柱层析法的基本操作技术。一、原理一、原理离子交换层析离子交换层析是用是用离子交换剂离子交换剂（具有离子（具有离子交换性能的物质）交换性能的物质）作固定相作固定相，利用它与流动，利用它与流动相中的离子能进行相中的离子能进行可逆的交换可逆的交换性质来分离离性质来分离离子型化合物的层析方法。子型化合物的层析方法。即溶液中的离子同离子交换剂上即溶液中的离子同离子交换剂上功能基团功能基团交换反应交换反应的过程。的过程。带电荷量少带电荷量少，亲和力小的，亲和力小的先先被被洗脱洗脱下来，下来，带电荷量多带电荷量多，亲和力大，亲和力大的的后后被被洗脱洗脱下来。下来。离子交换过程示意：离子交换过程示意：起始起始 吸附吸附 解吸解吸 完成完成 x+:起始缓冲离子起始缓冲离子 y+：待分离离子：待分离离子 z+：待分离离子：待分离离子二、离子交换剂的种类二、离子交换剂的种类v 在惰性载体上引入带有电荷的活性基团即离在惰性载体上引入带有电荷的活性基团即离子交换剂。子交换剂。（一）按活性功能基团带电荷性质不同（一）按活性功能基团带电荷性质不同阳离子交换剂阳离子交换剂 带负电荷，与阳离子交换带负电荷，与阳离子交换阴离子交换剂阴离子交换剂 带正电荷，与阴离子交换带正电荷，与阴离子交换（二）按载体种类不同（二）按载体种类不同1.离子交换树脂离子交换树脂：主要有聚苯乙烯树脂：主要有聚苯乙烯树脂苯乙烯苯乙烯+二乙烯苯二乙烯苯 聚苯乙烯聚苯乙烯 （单体）（交联剂）（单体）（交联剂）二乙烯苯二乙烯苯交联度交联度=100%苯乙烯苯乙烯+二乙烯苯二乙烯苯v交联度大，网孔变小，大分子量的离子不能交联度大，网孔变小，大分子量的离子不能进入树脂颗粒内发生离子交换。进入树脂颗粒内发生离子交换。v在不影响分离的情况下，以采用在不影响分离的情况下，以采用交联度较高交联度较高的树脂为好，这样可以提高树脂对离子的选的树脂为好，这样可以提高树脂对离子的选择性择性。目数目数：离子交换树脂的颗粒直径大小：离子交换树脂的颗粒直径大小 Dowex 50 为为20-50目目Dowex 20 840 m 50 297 m 100 149 m（代表二乙烯苯的百分含量）（代表二乙烯苯的百分含量）树脂树脂resin（据所含交换基团的性质分）（据所含交换基团的性质分）阳离子交换树脂阳离子交换树脂 强酸型强酸型 含磺酸基团含磺酸基团(R-SO3H)中等酸型中等酸型 含磷酸基团含磷酸基团(-O-PO2H4)弱酸型弱酸型 含酚基、羧基含酚基、羧基阴离子交换树脂阴离子交换树脂 强碱强碱 含季胺基团含季胺基团-N+(CH3)3 弱碱弱碱 含叔胺、伯胺基团含叔胺、伯胺基团-N(CH3)2 阴离子交换树脂对化学试剂及热都不如阳离阴离子交换树脂对化学试剂及热都不如阳离子交换树脂稳定。子交换树脂稳定。2.离子交换纤维素离子交换纤维素v阴离子交换纤维素阴离子交换纤维素 如如:DEAE-纤维素纤维素 以下分离中性或酸性物质以下分离中性或酸性物质,具二乙胺乙基具二乙胺乙基v阳离子交换纤维素阳离子交换纤维素如如:CM-纤维素纤维素 一般一般pH4条件下使用条件下使用,具有羧甲基具有羧甲基 3.离子交换凝胶离子交换凝胶 分离大分子物质分离大分子物质如：葡聚糖（如：葡聚糖（Sephadex）、）、聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺（PAG）、琼脂糖（）、琼脂糖（Sepharose）三、操作注意点三、操作注意点（一）离子交换剂的选择（一）离子交换剂的选择原则：原则：根据被分离物质的性质选择根据被分离物质的性质选择同一性质同一性质离子交换剂中选用对被分离物质各组分之间离子交换剂中选用对被分离物质各组分之间结合力结合力差异大差异大的型号交换剂，以保证通过离的型号交换剂，以保证通过离子交换层析后能得到比较满意的结果。子交换层析后能得到比较满意的结果。考虑因素：考虑因素：1.被分离物质带何种电荷被分离物质带何种电荷2.被分离物质分子的大小被分离物质分子的大小大分子物质选用凝胶，其次选用纤维素大分子物质选用凝胶，其次选用纤维素3.被分离物质所处的环境被分离物质所处的环境4.被分离物质的物理化学性质被分离物质的物理化学性质5.被分离物质的大概数量被分离物质的大概数量根据分离过程的实验条件根据分离过程的实验条件 强酸强碱强酸强碱应用广泛应用广泛 弱酸型弱酸型只能在碱性只能在碱性pH范围内使用范围内使用 弱碱型弱碱型只能在酸性只能在酸性pH范围内使用范围内使用（二）缓冲液的选择（二）缓冲液的选择原则原则：不能发生化学反应，所带电荷应与样品：不能发生化学反应，所带电荷应与样品一致。避免使样品变性一致。避免使样品变性(三三)洗脱剂洗脱剂 原则原则：所用洗脱液比吸着物质具有更活泼：所用洗脱液比吸着物质具有更活泼的离子或基团的离子或基团改变改变pH或离子强度或离子强度 增强洗脱液与离子交换剂的结合力增强洗脱液与离子交换剂的结合力降低分离物与离子交换剂的结合力降低分离物与离子交换剂的结合力 洗脱方式：梯度洗脱洗脱方式：梯度洗脱四、应用四、应用分离多肽蛋白、氨基酸、核酸及其他分离多肽蛋白、氨基酸、核酸及其他带电的生物分子带电的生物分子离子交换层析法分离氨基酸及测定离子交换层析法分离氨基酸及测定原理原理 所用样品为天冬氨酸和赖氨酸的混合液，所用样品为天冬氨酸和赖氨酸的混合液，分别属酸性氨基酸分别属酸性氨基酸(pI2.77)(pI2.77)、碱性氨基酸、碱性氨基酸(pI9.74)(pI9.74)，在缓冲溶液中分别带正电荷和负，在缓冲溶液中分别带正电荷和负电荷，与电荷，与强酸型阳离子交换树脂强酸型阳离子交换树脂Dowex50亲亲和力有很大不同和力有很大不同，在一定的洗脱条件下洗脱，在一定的洗脱条件下洗脱，将它们分离。利用氨基酸可与茚三酮反应生将它们分离。利用氨基酸可与茚三酮反应生成有色化合物进行氨基酸鉴定。成有色化合物进行氨基酸鉴定。紫色物质，用于紫色物质，用于氨基酸的比色测定和纸层析显色氨基酸的比色测定和纸层析显色与水含茚三酮的反应：与水含茚三酮的反应：R CHNH2COOHOOOHOH+2H2OOOOONHCHRN CHCOOHRCO2OON CH2ROONH2HRCHO +OOOHOHOONHOOOONOOHH2OvAsp LysvpH 10器材器材1.层析柱等层析柱等2.2.沸水浴沸水浴试剂试剂vDowex50 v2mol/L NaOHv柠檬酸缓冲液柠檬酸缓冲液v样品液：氨基酸混合液样品液：氨基酸混合液v茚三酮混合液茚三酮混合液实验步骤1树脂的处理树脂的处理将干的强酸型树脂用蒸馏水浸泡过夜，使之充分溶胀。用4倍体积的2mol/L的盐酸浸泡1小时，倾去清液，洗至中性。再用2mol/L的氢氧化钠处理，做法同上。最后用欲使用的缓冲液浸泡。2装柱装柱 取直径1cm,长度1012cm的层析柱。将柱垂直至于铁架上。自顶部注入上述经处理的树脂悬浮液，关闭层析柱出口，待树脂沉降后，放出过量溶液，再加入一些树脂，至树脂沉降至810cm的高度即可。v装柱要求连续、均匀，无纹格、无气泡，表面平整。液面不低于树脂。3平衡平衡将缓冲液瓶与恒流泵相连，恒流泵出口与层析柱入口相连，树脂表面保留34cm液层，开动衡流泵，以24ml/h流速平衡，直至流出液pH与洗脱液相同。4.加样加样揭去层析柱上口盖子，待柱内液面至树脂表面12mm关闭出口，沿管壁四周小心加入样品，慢慢打开出口，同时开始收集流出液。当样品液弯月面靠近树脂顶端时，即刻加入少量柠檬酸缓冲液冲洗加样品处数次，然后注入柠檬酸缓冲液至液面高34cm左右，接恒流泵。5.洗脱洗脱以缓冲液洗脱，开始用试管收集洗脱液，每管收集1mL，共收集6080管。6洗脱及氨基酸的鉴定洗脱及氨基酸的鉴定向各管收集液中加1mL水合茚三酮显色剂并混匀，在沸水浴中准确加热5min后冷却至室温，再加入3mL的0.1%硫酸铜溶液。混匀，以收集液第2管为空白，测定A570波长的光吸收值，以光吸收值为纵坐标，以洗脱液体积为横坐标绘制洗脱曲线。实验结果根据氨基酸的解离性质，分析该实验条件下氨基酸从层析柱洗脱下来的顺序。Separation of amino acids on a cation exchange column 注意事项 在装柱时必须防止气泡、分层及柱子液 面在树脂表面以下等现象发生。