转基因食品检测技术研究进展

河北科技师范学院食品科技学院课程论文课程名称： 转基因食品 论文名称： 转基因食品检测技术研究进展 作者名称： 贝秋龙 学 号： 0613090102 班 级： 酿酒0901 2012 年 4 月 19日转基因食品检测技术研究进展学号 0613090102 姓名贝秋龙（河北科技师范学院 食品科技学院 秦皇岛 066004）摘要：基因工程通过重组技术，能够获得有特殊生物遗传性状和功能的遗传工程生物体。基因工程技术应用于农业、食品工程，产生了转基因食品。本文概述了转基因食品在国内外的发展状况，简要介绍了转基因食品检测技术的原理、优缺点及应用情况。关键词：转基因食品,检测技术,研究进展前言21 世纪被誉为“生物技术世纪”，基因工程在全球很多国家兴起。 基因工程通过DNA重组技术,能够获得有特殊生物遗传性状和功能的遗传工程生物体(GMO)。基因工程技术应用于农业、食品工程，产生了转基因食品，它是含有转基因生物成分或者利用转基因生物如转基因植物、动物或微生物生产加工的食品#随着转基因食品的不断发展，其安全性问题已引起了越来越多的群众和政府部门的关注，为满足广大消费者的知情权和选择权，以及国际贸易的需求，迫切需要建立一系列关于转基因食品的检测技术。1 转基因技术的基本原理DNA 是生物体内的遗传物质, 通过DNA 的复制、转录和翻译将遗传信息进行传递和表达。通过对生物体内DNA 分子的修饰改造从而改变生物体的遗传性状, 这是转基因技术的理论基础。DNA 限制性内切酶及基因克隆等技术的发现为转基因操作奠定了技术基础。转基因技术的主要步骤: 分离目的DNA 片断,将目的片断克隆到细菌的DNA 中, 构建重组DNA,将重组DNA 扩增后, 利用农杆菌介导、基因枪、化学物质诱导、电穿孔、微注射及花粉管通道等方法将连接了启动子和终止子的目的基因导入到目标植物的细胞中, 最后筛选含目的基因的转化细胞, 并诱导产生转基因植株, 经扩繁后, 加工生产出转基因食品。2转基因食品可能存在的安全性问题随着基因工程技术的快速发展，转基因植物已进入大规模商品化生产阶段，转基因作物品种达100 多个，主要有大豆、玉米、棉花、油菜等，由转基因作物加工生产的转基因食品和食品成分达4000 余种。然而转基因作物在带来巨大经济效益的同时也存在许多潜在问题。由于目前尚缺乏科学依据证明转基因产品对人类健康和环境的安全性，转基因产品对健康和环境潜在的风险引起世界各国政府和公众的极大关注和广泛忧虑，这些焦虑主要集中在：（1）转基因产品是否对人类无毒、无副作用，转基因产品与非转基因产品是否“实质等同”、“无显著差异”；（2）是否对环境造成长期的生态影响；（3）转基因生物是否对物种进化及人类社会造成灾难等社会伦理道德问题。食品中转基因成分的安全性问题已由科学问题上升为社会问题。3转基因食品的检测技术由于转基因物质有可能在耕种、收割、运输、储存和加工过程中混入食品，对食品造成偶然污染。因此，不论是对转基因食品贴示标签，或是对转基因与非转基因原料进行分别输送，转基因原料和食品的检测都是必不可少的；另外，要区分转基因与非转基因食品，对转基因食品进行选择性标记，对食品中的转基因含量的多少加以限制，也需要准确有效的基因检测技术。从发展来看转基因食品的检测技术根据检测的直接对象可分为三类：（1）利用导入外源基因所表达的特殊性状直接鉴定；（2）针对导入外源基因表达的蛋白质的鉴定方法；（3）以导入外源基因的特定DNA 序列为检测对象的检测技术。其中目前用的比较多的是PCR 技术、ELISA 技术( 酶联免疫法)和生物芯片技术三种。3.1免疫学检测法是从蛋白质水平对转基因食品进行检测(即对外源蛋白质的测定可将其分为Western 杂交、酶联免疫法（ELISA）、试纸条法和快速检测试剂盒法。 免疫学检测法，其基本原理是通过抗原（antigen）抗体之间的特异反应来实现的。抗原抗体反应是一种非共价键特异性吸附反应， 即通常情况下，抗原只和它自己（或者具有相同抗原决定族的抗原）诱导产生的抗体发生反应。3.11 杂交Western 杂交是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异蛋白检测方法，它具有很高的灵敏性，可以从植物细胞总蛋白中检测出50ng的特异蛋白。Western 杂交检测的关键是抗体的制备【1,2】 2.1.2 酶联免疫吸附法ELISA（Enzyme Linked Immune absorbent Assay），此法则通过酶反应将抗原抗体反应信号放大，从而提高了检测灵敏度，而且还能产生有颜色的底物，通过仪器或肉眼识别，此法一般在酶联板上或膜上进行，检测一次需要4小时左右【1,3】3.1.3 试纸条法试纸条法（Lateral Flow Strip），此法主要将特异的抗体交联到试纸条上和有颜色的物质上， 当纸上抗体和特异抗原结合后， 再和带有颜色的特异抗体进行反应，就形成了带有颜色的三明治机构，并且固定在试纸条上，如果没有抗原，则没有颜色【2，4】3.1.4 快速检测试剂盒法此法具有操作简易%使用方便的特点，但是试剂盒本身价格较昂贵， 在称取样量上用量较少，代表性不能保证，这将影响到检测结果的正确性。目前见得多的产品主要是国外的，如Dneasy Plant Mini Kit（QIAGEN）等试剂盒). 3.2 PCR检测法PCR检测法是目前转基因存在的检测方法中最为成熟的,它具有灵敏度较高/特异性强/可准确定量等优点,PCR 技术即“.聚合酶链反应技术”，是指模拟体内DNA复制方式在体外选择性扩增DNA某个特殊区域的技术,它能在短时间内准确地将目的顺序大量复制,PCR 的基本要素包括模板、引物、合成DNA的原料即DNTP和DNA聚合酶.PCR即可做定性又可做定量分析。 目前大多以定性检测为主，定性检测的检出范围为0.1%，但该项技术的检测结果也有可能与实际不相符合，会出现假阴性或假阳性结果（即检测物质本身含有转基因特制而未被检出，或是本身没有转基因物质，而检出有转基因成分）【5,6】 3.2.1 定性PCR技术转基因食品重组DNA的基本结构包括启动动子、目的基因、终止子和标记基因，到目前为止，全世界已有30 多种源基因食品得到相关国家的安全评价，在现有的商品化源基因食品中绝大多数含转录启动子CaMV35、 转录终止子NOS 及抗生素抗性基因NPTII。 这就为人们建立相应的PCR筛选检测方法提供了便利22迄今为止，利用定性PCR 检测技术可检测如大豆、玉米、番茄、油菜等多种转基因作物3.2.2 定量PCR技术近年来随着人们对转基因食品量化要求的提高,研究者们在定性筛选PCR方法的基础上发展了不同的定量转基因食品的PCR检测方法#目前转基因成分的定量检测方法有定量竞争PCR(Quantitative competitive PCR)和实时（Real-time）荧光定量检测分析PCR。定量竞争PCR 的基本原理是采用构建的竞争DNA 与样品DNA 相互竞争相同底物和引物, 并根据电泳结果以竞争模板的稀释度和结果做标准曲线,从而得到可靠的定量分析结果。其特定是含有内部标准子，可降低实验室之间的检测误差。 实时荧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时检测整个PCR进程，然后在标准曲线上对未知模板进行定量分析，此法采用了独特的全封闭反应，减少了污染，具有高度的灵敏性【7】3.2.3 PCR-ELISA这是一种将PCR 的高效性、 高灵敏度与ELISA的高准确度相结合的方法,它是以地高辛标记的特异性探针诱捕PCR 产物在合适条件下杂交,在用碱性磷酸脂酶标记的链酶亲和素进行ELISA 反应, 既适合于快速的定性筛选又可进行准确的定量分析8_4 蛋白质水平的检测4. 1 酶联免疫法( ELISA ) 􀀁 ELISA 检测是将抗原和抗体反应的特异性与酶对底物的高效催化作用结合起来, 根据酶作用于底物后的显色反应, 当抗原与抗体结合时, 借助于比色或荧光反应鉴定GMF。酶与底物反应的颜色与样品中抗原的含量成正比。ELISA 检测对样品进行定性检测的同时又能进行定量分析 8 。Rogan等人用EL ISA 法检测出传统大豆加工产品中混有2% Roundup Ready 大豆中的CP4EPSPS蛋白质 9 。此方法具有选择性和灵敏性, 具有商业可利用性; 但是复杂基质对它的准确性和准确度有干扰, 并且外源基因表达的蛋白质在较低水平或热处理变性时, 免疫方法的检测能力就会下降。4.2 试纸法􀀁 主要将特异的抗体交联到试纸条上和有颜色的物质上, 当纸上抗体和特异抗原结合后, 再和带有颜色的特异抗体进行反应, 就形成了带有颜色的三明治机构, 并且固定在试纸条上, 如果没有抗原, 则没有颜色。此法不需要特殊的仪器设备,适用于现场检验或初筛 10 。上面两种方法有三方面不足: 第一, 抗原抗体反应的专一性; 第二, 加工过的转基因食品中的蛋白质抗原性很容易破坏, 从而影响检测结果的准确性; 第三, 有些转基因食品不表达蛋白质或表达量很低或很大时, 则无法进行检测 11 。4.3 蛋白质印迹法(Western B lo t) 􀀁 蛋白质印迹法将电泳较高的分离能力、抗体的特异性和显色酶反应的灵敏性结合起来, 是检测复杂混合物中特异蛋白质最有力的工具之一, 普遍用于分离、检测特异的目的蛋白质, 灵敏度为1 5 ng。它可确定一个样品中是否含有低于或超过预定限值水平的目的蛋白质, 特别是用于不可溶蛋白质的分析。V an Duijn 等人用蛋白质印迹法检测Roundup Ready 大豆中的CP4合成酶, 检测限在0. 5% 1% 。经验证, 这种方法可以应用于转基因Roundup Ready 大豆原材料和大豆蛋白质产品的检测 12 。ELISA 检测目前已有商品化的转基因食品ELISA检测试剂盒, 但只能检测少数几种转基因食品, 且一种试剂盒只针对一特定转基因产物, 无法高通量、快速地检测具有多种混合成分的食品样品, 并且价格很高。蛋白质芯片技术将是未来筛选食品中多种转基因成分的最佳方法。5 核酸水平的检测5.1 定性PCR 聚合酶链式反应( PolymeraseCha in R eaction, PCR)是以特定的基因片段( DNA 片断)为模板, 利用人工合成的一对寡聚核苷酸为引物, 以4种脱氧核苷酸( dNTP)为底物, 在耐高温聚合酶的作用下, 通过DNA 模板的变性、退火及引物的延伸3个阶段的多次循环, 使模板扩增。转基因细胞转入的基因成分一般包括启动子( Promotor)、报告基因( Reporter G ene )、目的基因( Target Gene)、终止子( Term inator) , 其中启动子和终止子为表达目的基因所必需的 13 。至今, 转基因植物常用的是花椰菜花叶病毒启动子( CaMV 35S )和根癌农杆菌终止子( NOS)。通过PCR 扩增这些特殊的启动子和终止子序列, 是目前最常用的鉴定食品中有无转基因成分的方法。Shira i等通过对35S启动子、NOS终止子的检测, 实现了对抗草甘膦大豆Roundup Ready 转基因成分的筛选检测 14 。曹际娟等对转基因玉米及其粗加工食品, 如爆米花、熟玉米棒、速溶玉米片的基因进行了PCR 定性检测 15 。但定性的PCR 方法对转基因玉米原材料的灵敏度比转基因大豆原材料略低(如检测0. 1% 的转基因玉米种的35S启动子的假阴性数量是14个,而相应的转基因大豆的35S启动子的假阴性数量是5个) 16 。PCR方法已经发展为检测转基因RoundupReady 大豆的方法, 呈现高度特异性和敏感度( 0. 01% GMF), 适用于从大豆到豆制品、大豆蛋白质、卵磷脂及豆油的半成品和终产品样品 12 。5.2 多重PCR 多重PCR 是常规PCR 方法的改进, 它是在同一个反应中同时扩增两个或多个目标基因序列 17 。这种方法具有更大的可靠性和适应性, 并且能降低检测成本。张平平等为了同时检测转基因食品中所含的多个目标基因序列并排除扩增结果的假阴性, 采用多重PCR 分析技术对转基因大豆食品进行了检测, 当转基因大豆含量仅为0.15%时, 仍然可以对转基因食品进行可靠的鉴定, 从而表明该方法的高度敏感性 18 。Perm ingeat等仅用两对引物就可同时检测出转基因玉米B t176、MON 810、B t11和T25的C ryIA ( b )和pat基因。多重PCR也可同时准确地扩增出Roundup Ready大豆的NOS和epsps序列片段 19 。刘光明根据转基因农作物中常用的花椰菜花叶病毒启动子( CaMV 35S )和根癌农杆菌终止子(NOS)的序列, 设计并合成了两对不同的引物和相对应的两种荧光双链探针( FDCP) , 分别建立了常规PCR、应用FDCP 的新型实时荧光PCR 检测转基因成分35S 启动子和NOS终止子的方法。试验结果表明, 建立的多重PCR方法能有效检测出35S和NOS成分, 其中多重PCR法具有灵敏度高、特异性好的特点, 多重荧光PCR法则更为简便、快速、准确 20 。_3 发展趋势目前，我国在转基因食品检测技术上存在的问题和发展趋势主要体现在以下几个方面：（1）加工转基因产品DNA 提取技术不成熟，缺乏检验机构急需的成品试剂盒，因此真正切实可行的检测体系并没有建立起来；（2）从事转基因产品检测的实验室缺乏内部质量控制机制；（3）与国际接轨、高灵敏度、低成本的检验方法尚未形成。目前应用较多的两种方法：PCR 检测技术和ELISA 检测技术。这两种方法的出发点不同，适用的检测范围也不同，各有利弊。PCR 法包括定性法和定量法，由于该方法是建立在DNA 水平上，所以即使DNA 在高温高压等严峻环境下发生降解，但仍能进行检测，所以此法适用于各种初加工和深加工品。而免疫学方法不适用于经深度加工后使蛋白质变性的产品，灵敏度较低，此法适用于原材料的快速检测，且仍需要PCR 法进行最后的确证检验。这两种方法的发展都存在一定的制约因素，刚出现不久的生物芯片技术可以解决这一问题，生物芯片通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有很高的应用价值，具有高通量、微型化、自动化和信息化的特点，是转基因检测的方向。_参考文献1 brett G M,Chambers SJ,Huang L,etal.Design and development of immunoassays for detection of proteins J.Food Control.1999,10:401-4042 Lipton CR Guidelines for the validation and use of immunoassays for determining of introduced proteins in iotechmology enhanced crops and derived food ingredientsJ. 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