10生物电分析化学课件

一、引言一、引言 今日的生物电分析化学已经涉及到不同领域的生物学问题，主要是：（1）在生物体内进行的绝大部分化学反应都是氧化还原反应，例如为生命所需（营养、组织生长、再生）进行的新陈代谢。（2）光合作用，包括吸收分子的电子激发过程。膜上产生的电子和质子转移过程和代谢化学反应。第一页，编辑于星期一：八点 八分。（3）膜现象控制着离子、分子及其它物质从细胞外部向内部或逆向传输，离子有方向性的运动造成了跨膜电位差，调节着一系列的物质运输。（4）生物体所需的信息过程几乎都是通过电信号方式发生的，出现一系列电生现象，包括视觉、动作、痛觉、热刺激、饥饿和干渴感等等。第二页，编辑于星期一：八点 八分。（5）用一定周期和幅度的适当电脉冲在膜中生产膜孔，使物质更容易跨膜转移，有可能实现细胞融合和基因摄取。（6）生物电化学方法对各种疾病的治疗，涉及生物传感器、燃料电池、人工心脏、电刺激和电麻醉、食品控制、环境保护等方面的应用。第三页，编辑于星期一：八点 八分。生物传感器所涉及的学科领域第四页，编辑于星期一：八点 八分。Schemes for insulin therapy(胰岛素治疗）第五页，编辑于星期一：八点 八分。二、生物传感器的分类压电(石英晶体微天平)电位型 阻抗/电容型电化学生物传感器电导伏安/安培第六页，编辑于星期一：八点 八分。1.1.电导型生物传感器电导型生物传感器 许多生物/化学反应通常都伴随离子种类和数量的变化，从而会导致电导率发生相应的改变。基于此原理可以制备电导型传感器。电导的测量通常被认为缺乏选择性，但是通过选择性的生物识别，如特异性的酶促反应，可克服这个局限。电导型生物传感器为现有的生物传感器提供了一种有意义的选择。第七页，编辑于星期一：八点 八分。2.2.电容型生物传感器电容型生物传感器 Newman于1986年首次报道用电容传感器直接测定抗原-抗体的相互作用以来，该技术得到了科技工作者的关注。这类传感器研究主要集中在免疫电容生物传感器、酶电容生物传感器、DNA电容生物传感器、分子印迹电容生物传感器等方面。第八页，编辑于星期一：八点 八分。3.3.电位型生物传感器电位型生物传感器 电位型传感器是基于异相之间的界面电位的变化。电位型生物传感器主要有两类:一类一类是将离子选择电极和固定酶结合在一起，能实现对被检测分子的高灵敏、高选择性分析。另一类另一类电位型生物传感器是固定了酶、抗体等生物组份的场效应晶体管 第九页，编辑于星期一：八点 八分。4.4.安培（电流）型生物传感器安培（电流）型生物传感器 安培生物传感器是研究和应用最多的电化学生物传感器，也是最为成功的生物传感器。同电位法相比，安培检测更加灵敏、准确和快速。安培试验所用的仪器也相对简单,记录的是i-t曲线。第十页，编辑于星期一：八点 八分。三、生物传感原理第十一页，编辑于星期一：八点 八分。生物传感器是将生物活性物质如：器官、组织、细胞、酶、抗体等生物物质与换能器(Transducer)、电子放大器(Electronic amplifier)直接结合，将受体与被检测分子发生的特定生物化学反应转换成可检测的输出信号。根据换能器转换的信号又可分为电化学生物传感器、光学生物传感器、压电晶体生物传感器、半导体生物传感器、介体生物传感器及热敏生物传感器。电化学生物传感器是这几种中发展最为广泛的。第十二页，编辑于星期一：八点 八分。生物传感器的结构第十三页，编辑于星期一：八点 八分。生物传感器的敏感识别模式第十四页，编辑于星期一：八点 八分。生物传感器的电子传递第十五页，编辑于星期一：八点 八分。1.1.酶的种类及其电子转移性质酶的种类及其电子转移性质 酶是一种由生命体合成的特殊化学催化剂，作为催化剂其最显著特征是在温和条件下的高效和专一性。酶通常由两个部份组成：一是脱辅基酶蛋白(Apoenzyme)；另一部份是非朊基基团(Prosthetic group)，这部份在酶的催化反应中起主要作用，是酶的活性中心(Active center)。按其催化反应的性质，酶可分为氧化还原酶(Oxidoreductase)、移换酶(Transferase)、水解酶(Hydrolase)、裂合酶(Lyase)、异构酶(Isomerase)、合成酶(Lligase)等六大类。第十六页，编辑于星期一：八点 八分。大部分酶安培生物传感器是在氧化还原酶的基础上发展的，这是因为氧化还原酶和底物在酶促反应过程中发生了电子转移。氧化还原酶又可细分为脱氢酶(Dehydrogenase)、氧化酶(Oxidase)、还原酶(Reductase)、过氧(化)物酶(Peroxidase)、氧酶(Oxygenase)、羟化酶(Hydroxylase)、触酶(Catalase)等几种。通常根据其非朊基基团(活性中心)又可分为含黄素(Flavin)类活性中心酶和含醌(Quinone)类活性中心酶两类。黄素(Flavin)类酶包含约80种酶（如：葡萄糖氧化酶和黄嘌呤氧化酶），其活性中心分别为黄素腺嘌呤二核苷酸(Flavine adenine dinucleotide,FAD)或黄素单核苷酸(Flavin mononucleotide,FMN)，其中绝大多数是FAD型酶。第十七页，编辑于星期一：八点 八分。FAD氧化还原中心的氧化还原反应过程，醌类酶的活性基团是吡咯并喹啉醌。第十八页，编辑于星期一：八点 八分。许多氧化还原酶的酶促反应都有一种辅助底物(Co-substrate)的参与。这类物质包括O2、H2O2、ATP、NAD+/NADH及NADP+/NADPH，起着电子受体的作用。与酶对其主要底物的高选择性不同，酶促反应对辅助底物的选择性很低，因而可以用具有良好电化学性能的人工合成试剂(如电子媒介体和中继体)代替辅助底物，从而获得期望的目的。正由于这些特征，氧化还原酶被广泛用来制备安培型生物传感器。第十九页，编辑于星期一：八点 八分。2.2.生物传感器的发展生物传感器的发展 根据酶与电极间电子转移机理,大致可将酶安培生物传感器分为三代：第二十页，编辑于星期一：八点 八分。第一代生物传感器第一代生物传感器 第一代生物传感器是基于检测酶促反应产物(如：过氧化氢、NADH)的生成或辅助底物(如氧分子)的消耗来实现对底物的测定(图1-6A)，因而据此可分为氧检测型、过氧化氢检测型、NADH检测型等三种。第二十一页，编辑于星期一：八点 八分。第一代生物传感器具有如下局限性：第一代生物传感器具有如下局限性：i)响应信号与氧浓度关系较大，氧分压的变化会对酶电极产生明显影响；ii)氧分子也是氧化酶的底物，当溶解氧的浓度不是很高时，难以对高浓度底物进行测定，从而导致线性范围过于狭窄；iii)酶促反应产生的过氧化氢浓度高时会使酶活性降低很多；iv)过氧化氢的测定通常在较高电位(一般在600mV左右)下进行，许多还原性电活性物质会被氧化而产生干扰信号；v)NADH的氧化需要很高的过电位及氧化产物会对电极表面发生聚合而毒化生物传感器。这些缺点限制了第一代生物传感器的进一步推广和应用，于是导致了第二代传感器的发展。第二十二页，编辑于星期一：八点 八分。b)第二代生物传感器第二代生物传感器 在第二代酶安培生物传感器中，一个人工合成的电子受体，即媒介体被用来代替天然受体来传递酶电极间的电子。电子媒介体是一种低分子量的具有氧化还原电对的分子，媒介体首先与酶的还原态反应，然后扩散到电极表面发生快速的电子转移。其电极反应过程如下：S+Eox=P+Ered Ered+Mox=Eox+Mred Mred =Mox+ne-其中Mox、Mred分别为媒介体的氧化态和还原态。diffusional mediatorImmobilizationmediator第二十三页，编辑于星期一：八点 八分。与第一代传感器相比，媒介体生物传感器主要优势在于：(i)测量受氧影响小；(ii)酶电极的工作电位由媒介体的氧化电位调节，即可以在较低电位下检测以避免其它物质的干扰。早先是一些水溶性的无机或有机化合物如铁氰化物和醌用来作为电子媒介体。近年来应用比较多的电子媒介体有二茂铁二茂铁及其衍生物、四硫四硫富瓦烯富瓦烯类、TCNQ类、有机导电盐有机导电盐类、醌醌类、铁铁/亚铁氰化物亚铁氰化物类等 第二十四页，编辑于星期一：八点 八分。例:介体葡萄糖传感器的制备 PVI-PAA-Os/GOD复合膜的最佳成膜条件是:PVI-PAA-Os：0.5 mg mL 1 GOD：0.5 mg mL 1 阶跃电位：0.7 V(2s)和-0.5 V(2s)阶跃次数：35次。第二十五页，编辑于星期一：八点 八分。PVI-PAA-Os/GOD膜共沉积机理膜共沉积机理 第二十六页，编辑于星期一：八点 八分。生物复合膜的电化学特性生物复合膜的电化学特性 CV of a PVI-PAA-Os/GOD film.Potential scan rate:5,10,20,50,100,200 mV s-1 Ep no change Ip 第二十七页，编辑于星期一：八点 八分。复合膜对葡萄糖的电催化复合膜对葡萄糖的电催化 a)No glucose b)10 m mol L-1 glucose第二十八页，编辑于星期一：八点 八分。电子转移机理电子转移机理 第二十九页，编辑于星期一：八点 八分。葡萄糖在电极上的安培响应葡萄糖在电极上的安培响应 Hydrodynamic voltammograms 第三十页，编辑于星期一：八点 八分。线性范围:0.1-30 mM，灵敏度为340 nA mM-1 检测限:0.03 mM(S/N=3)。Each 2 mM 第三十一页，编辑于星期一：八点 八分。c)第三代生物传感器第三代生物传感器 理想的第三代生物传感器是在电极表面实现酶与电极的直接电子传递,即:Ered=Eox+ne-第三十二页，编辑于星期一：八点 八分。三代生物传感器敏感机理对比三代生物传感器敏感机理对比 第三十三页，编辑于星期一：八点 八分。五、五、电极上电极上酶的固定化方法酶的固定化方法 酶是酶传感器中的分子识别物质，因此酶在电极表面固定是制备生物传感器的一个非常关键步骤，酶电极的成功与否往往在很大程度上取决于酶的固定。理想的酶固定方法应该满足以下三条标准：i)能保留酶的高活性；能保留酶的高活性；ii)酶固定层具有很好的稳定性，酶固定层具有很好的稳定性，如：在一定pH范围内不变性，在溶液中没有泄漏；iii)酶电极能对底物发生快速和灵敏的响应。酶电极能对底物发生快速和灵敏的响应。经过多年的研究，发展了许多基于物理的、化学的或物理化学方法相结合的酶固定方法。第三十四页，编辑于星期一：八点 八分。吸附法吸附法 这是一种最为简单的方法，即通过物理吸附物理吸附(基于离子的、极性的、氢键、亲油性、-电子作用等作用力)或化学化学吸附吸附(基于化学反应的分子自组装膜，Self-assembly monolayer,SAM)将酶固定在基体上。由于没有试剂参与固定过程及这些载体对酶良好的亲和性，该方法最大的优点是生物活性高优点是生物活性高。然而由于吸附是一个可逆的过程，该方法制备的生物传感器对pH、温度、离子强度、底物浓度很敏感，这些因素可能会导致酶的脱落。第三十五页，编辑于星期一：八点 八分。b)包埋法包埋法 这是一种应用很普遍的酶固定化技术，该技术包括碳糊包埋、溶胶溶胶-凝胶包埋凝胶包埋、电化学聚合膜包埋等。溶胶-凝胶包埋是将酶包埋并固定在一个聚合物三维空间网络结构或孔状结构中，小分子物质能容易地渗透进来。该方法的缺点是缺点是膜的孔径控制不好经常发生酶的泄漏或对底物的扩散速率的消极影响。碳糊包埋法一般是将酶直接固定在修饰电极材料中；溶胶-凝胶包埋使用金属醇盐（如TEOS）sol-gel膜；电化学聚合膜包埋包括导电聚合物包埋导电聚合物包埋和非导电性聚合物膜包埋。非导电性聚合物膜包埋主要包括聚苯酚、聚硝基酚、聚-氨基乙基苯酚、间笨二酚、苯二胺和聚吲哚等。第三十六页，编辑于星期一：八点 八分。聚合物包埋聚合物包埋第三十七页，编辑于星期一：八点 八分。溶胶溶胶-凝胶法：凝胶法：溶胶凝胶(sol-gel)法是将金 属醇盐或无机盐溶于水或有机溶剂,在低温下通过水解、聚合等化学反应,形成内含纳米粒子的溶 胶,再转化为具有一定空间结构的凝胶。然后经过适当热处理或减压干燥,制备出相应的粉末、薄 膜和固体材料的方法。此法的优点是反应过程易控制,处理温度低,粒径分布窄,纯度高,纳米颗粒分散均匀。但成本昂贵,周期长,产量小,热处理时易团聚且污染环境,难以实现工业化生产。第三十八页，编辑于星期一：八点 八分。c)共价键合法共价键合法 该方法是通过共价键将酶分子与电极表面结合而固定的方法，虽然这种方法操作较为困难，但由于提供了比较稳定的固定化酶，因而已得到了较为普遍的应用。共价键合法的主要缺点是酶在共价键合时可能会改变酶的结构，因而共价键合酶的催化活性及稳定性会受到一定程度的影响。第三十九页，编辑于星期一：八点 八分。d)交联法交联法 通过双(多)功能团试剂将酶分子之间、酶分子与凝胶/聚合物之间交联形成网状结构而使酶固定化。这种方法可以克服酶电极在溶液中从电极表面泄漏的缺点。最常用的交联剂是戊二醛，它能在温和条件下与酶蛋白上的-NH2残基反应。惰性蛋白(如：牛血清蛋白，BAS)常用来形成酶膜，因它含有丰富的赖氨基残基，易于和戊二醛作用形成非水溶性的聚合物膜，同时也为酶分子提供了合适的微环境，从而提高了测定灵敏度。第四十页，编辑于星期一：八点 八分。戊二醛和BAS固定酶电极 第四十一页，编辑于星期一：八点 八分。Glucose oxidase catalysed oxidation of glucose:identification of measurement parameters for glucose assay.第四十二页，编辑于星期一：八点 八分。六、免疫传感器六、免疫传感器 电化学免疫分析法：电化学免疫分析法：将免疫法的高选择性与电化学法的高灵敏性结合起来所产生的一种新型的免疫分析法。电化学免疫分析法包括电化学电化学免疫传感器免疫传感器和伏安免疫分析法伏安免疫分析法。第四十三页，编辑于星期一：八点 八分。免疫法免疫法是基于抗体与抗原或半抗原之间的高选择性反应而建立起来的分析方法。它具有很高的选择性和很低的检测限，可以应用于测定各种抗原、半抗原或抗体。免疫法有放射免疫法、荧光免疫法、发光免疫法及酶联吸附免疫法等。其中以放射免疫法的灵敏度最高。但由于放射免疫法涉及到示踪原子的处理，使用上受到限制。将生物学免疫分析法与伏安法相结合，产生了一种新型的免疫分析法电化学伏安免疫法电化学伏安免疫法。1、伏安免疫分析法、伏安免疫分析法第四十四页，编辑于星期一：八点 八分。实现伏安免疫法的途径很多。通常按标记方法的不同，分为酶酶标记法标记法和非酶标记法非酶标记法。采用酶标记法酶标记法时，通过酶的催化作用，产生一种电活性物质，再用适当的电化学方法进行测量。酶标记法的优点是灵敏度高，因为它利用了酶的催化作用（放大系数103104以上）。非酶标记法非酶标记法通常利用抗体或抗原本身的电活性，或者通过适当的化学反应进行标记，使其产生电活性，然后再进行电化学测量。但灵敏度一般较低。在上述两种方法中，根据是否要将抗体-抗原结合物（Ab-Ag）与游离抗体或抗原进行分离而又可将其分为非均相非均相免疫法免疫法与均相免疫法均相免疫法。下面举例加以说明。第四十五页，编辑于星期一：八点 八分。1.1.酶标记伏安免疫法酶标记伏安免疫法（1）非均相法非均相法 一种方法首先是将抗体固定在聚苯乙烯容器表面上。表面上的空位置用Tween-20结合之。然后将酶标记的抗原（Ag*）和抗原试样（Ag）加入容器中，让其与容器表面上有限的抗体进行竞争反应。待一定时间后，洗去游离的抗原。这时，由于竞争反应的结果，与容器表面上抗体相结合的标记抗原量与试样中的抗原量成反比。然后加入基物，让其与Ag*中的酶相互作用，得到电活性产物P，最后用伏安法进行检测。这一过程可用下图表示。第四十六页，编辑于星期一：八点 八分。第四十七页，编辑于星期一：八点 八分。另一种定量方法是形成夹心式化合物形成夹心式化合物的定量法。在这种方法中将抗原试样加入固定了一定量抗体的容器中，让抗原与抗体进行反应。达到平衡后，洗去游离的抗原。然后加入另一种酶标记的抗体，使其与抗原再反应，形成夹心式化合物。洗去过量的酶标记抗体，再加入适当的基质S。这时，在酶的催化作用下，基质转变为具有电活性的P，从而进行测量。在这种情况下，电信号与被测抗原成正比。这一过程可用图2表示。这种方法已应用于免疫球蛋白的测定。第四十八页，编辑于星期一：八点 八分。采用上述酶标记的非均相伏安免疫法，具有灵敏度高的特点，尤其是这种方法可以将试样溶液中可能存在的干扰物质（如蛋白质等）分离，提高了方法的适应性；缺点是操作稍复杂。第四十九页，编辑于星期一：八点 八分。（2）均相法均相法 这种方法在溶液中进行，不涉及到Ag*或Ag的分离步骤。其基本原理是根据Ag*与Ab反应形成AbAg*后，它的催化活性相应减小这一现象进行测定的。在这种方法中，被测抗原与一定量的酶标记抗原和抗体在溶液中进行反应，由于竞争反应的结果，一部分Ag*形成了AbAg*，引起Ag*的催化活性降低，从而减小由基质（S）产生电活性物质（P）的量，据此可以推算出试样中抗原的含量。与非均相法比较起来，均相法比较简单，但灵敏度较低，均相法比较简单，但灵敏度较低，干扰因素也较多。干扰因素也较多。这种方法已应用于苯妥英等抗癫痫药物的测定。第五十页，编辑于星期一：八点 八分。2.2.非酶标记伏安免疫法非酶标记伏安免疫法 这种方法可能是电分析化学家最感兴趣的，因为它不涉及到酶操作技术。在这种方法中，可以直接利用抗体或抗原的电活性，或者通过适当的化学方法，使它们转变为具有电活性的物质，从而利用免疫反应进行测定。第五十一页，编辑于星期一：八点 八分。非酶标记伏安免疫法也可以非均相或均相非均相或均相的方式进行。其基本原理已如上述，现各举一例以说明：均相均相免疫反应测定雌三醇抗体：雌三醇是非电活性的，将其硝基化后，即转变为具有电活性的二硝基雌三醇（Ag*）。它可借微分脉冲极谱进行测定。于溶液中加入雌三醇抗体，形成AbAg*后，二硝基雌三醇即结合为非电活性物质。因此，利用这一均相免疫反应，可以测定雌三醇抗体含量。第五十二页，编辑于星期一：八点 八分。非均相非均相免疫伏安法：采用In（铟）-DTPA进行标记的人血清蛋白（HSA）的测定属于非均相免疫伏安法。其基本原理如下：目前，用于标记抗原的电活性物质还有Hg2+、Pb2+、Co2+、Ni2+、Cd2+以及Brdicka蛋白质的利用等。被测定的抗原或半抗原还有吗啡、免疫球蛋白、卵蛋白等。第五十三页，编辑于星期一：八点 八分。2 2、电化学免疫传感器、电化学免疫传感器 电化学免疫传感器是由抗原或抗体等分子识别元件和电化学电极组合而成，可以直接检测免疫试剂的结合反应。依据电化学测定的方式的不同可分为：(1)电位免疫传感器电位免疫传感器 主要测量电极表面固定抗原或抗体与其相应的抗体或抗原结合引起的电极表面电位变化，固定抗体的测量电极与参比电极间的电势差大小与相应自由抗原浓度有关。电位免疫传感器已用于环境中2，4-D除草剂的检测。第五十四页，编辑于星期一：八点 八分。(2)电流免疫传感器电流免疫传感器 主要测量电极表面电活性物质被氧化或还原所产生的与其浓度大小成线性关系的电流，一般有氧化酶的参与。如利用双抗电流免疫传感系统对黄体酮（progestarone）进行了测定。(3)电容免疫传感器电容免疫传感器 主要测量电极板上抗原抗体反应所引起的电容变化，电容大小与电容极板表面的介电层(固定抗原或抗体)的厚度和介电性能有关。已利用ELISA（酶联免疫分析）将此类传感技术应用于葡萄糖的测定。(4)电导免疫传感器电导免疫传感器 这类传感器与电容免疫传感器相似，主要通过测定电流变化从而测出两电极间传感层的电导变化。已利用这类传感器对环境中阿特拉津进行了测定。第五十五页，编辑于星期一：八点 八分。电化学免疫传感器按免疫分析法的类型可分为：（1）直接免疫传感器直接免疫传感器 抗体和抗原带有大量的电荷，当抗体和抗原在电极表面形成复合物时，根据其发生的电学或电化学性质（如介电常数、电导率、膜电位、离子淌度等）变化，实现抗原或抗体的测定。（）间接免疫传感器间接免疫传感器 利用标记物（如酶）将免疫反应的信号放大以后，间接测定抗原或抗体。第五十六页，编辑于星期一：八点 八分。间接免疫传感器间接免疫传感器 例如利用碘离子选择性电极，可以测定乙型肝炎抗原。这是一种酶免疫分析传感器。制作这种电极时，需要将乙型肝炎抗体固定在碘离子选择性电极表面的蛋白质膜上。测定时，将此电极插入含有乙型肝炎抗原的溶液中，使抗体与抗原结合，再用过氧化酶标记的免疫球蛋白抗体处理，这时就形成了抗原与抗体的夹心结构。将此电极插入过氧化氢和碘化物的溶液中，在过氧化酶标记的免疫球蛋白的催化作用下，过氧化氢被还原，而碘化物因被氧化而消耗，碘离子浓度的减少与乙型肝炎抗原的量成正比，由此可推算乙型肝炎抗原的浓度。第五十七页，编辑于星期一：八点 八分。另一种有趣的免疫传感器是离子免疫电极离子免疫电极。例如载有特定离子的红细胞抗原，能与待测抗体结合。这种结合物能被一种称为补体的酶识别，并使红细胞溶解，释放出细胞所载的离子。这些释放出来的离子可用离子选择性电极来检测。利用这种原理，以羊红细胞作离子载泡，三甲基苯铵作标记离子，可以测定牛血清蛋白抗体。另外，人造的脂泡也可代替红细胞进行上述免疫分析。例如：以四苯基铵离子作标记离子，把一种脑代谢的中间产物神经节苷脂连接到脂泡的表面作抗原，以四苯基铵离子选择性电极作检测电极，采用薄层电位测量技术，可以测定微升量血清中的神经节苷脂抗体。第五十八页，编辑于星期一：八点 八分。免疫电极的制备和检测：Competitive binding immunoassay.(a)Antigen determined by competition for an immobilized antibody with a labeled antigen;第五十九页，编辑于星期一：八点 八分。Competitive binding immunoassay.(b)similar scheme for sample antibody using immobilized antigen.第六十页，编辑于星期一：八点 八分。七、生物亲和传感器生物亲和传感器：生物亲和传感器：利用生物分子之间的亲和性而建立起来的一种电化学传感器。如某些蛋白质对某特定物质的亲和（识别）性。有二种原理的生物亲和传感器：1）直接亲和型生物传感器；2）分子竞争型生物亲和传感器。也有酶标记酶标记和竞争型竞争型生物亲和传感器。二种原理如下图所示：第六十一页，编辑于星期一：八点 八分。(a)The direct affinity electrode(b):the competitive-binding affinity electrode.第六十二页，编辑于星期一：八点 八分。八、第三代生物传感器八、第三代生物传感器 1、酶直接电荷传输的困难性在于：（1）电活性的辅基位于蛋白质的中心；（2）蛋白质在电极表面的吸附变性；（3）蛋白质在电极表面的不利分子定向 第六十三页，编辑于星期一：八点 八分。细胞色素c 分子空间结构第六十四页，编辑于星期一：八点 八分。第六十五页，编辑于星期一：八点 八分。对于氧化还原蛋白质难以实现直接电子转移的主要原因有：一、通常情况下：（1 1）由于氧化还原蛋白质的辅基(生物活性基团常常为电化学活性基团)被多肽链所包裹,其与电极表面的距离较大,因而难于进行电子传递；（2 2）蛋白质在电极表面的取向往往不利于其电活性基团与电极之间的电子交换;（3）某些杂质在电极表面上的吸附或蛋白质本身的吸附变性可能阻碍它们与电极间的直接电子转移。第六十六页，编辑于星期一：八点 八分。二、氧化还原酶分为含有或不含电子传递通道两类,前者在自然体系中参与电子传递过程,其活性中心与酶分子表面之间存在电子传递通道;相反,后者不参与电子转移过程,所以在其分子中不存在电子传递通道，这类氧化还原酶很难实现直接电化学反应,除非它的氧化还原活性点位于酶分子表面三、氧化还原蛋白质结构复杂且具有各向异性,它们的活性中心并不正好位于蛋白的中心,此外蛋白质分子表面还呈现电荷分布不均匀性第六十七页，编辑于星期一：八点 八分。1977 年年,H ill和和Kuwana分别发现马心细胞色素分别发现马心细胞色素c(Cyt c)与金电极和掺锡氧化铟电极之间有直接可逆与金电极和掺锡氧化铟电极之间有直接可逆的电化学反应。的电化学反应。1979 年年,酶与电极的直接电子传递酶与电极的直接电子传递也见报道。这些开创性的工作为用电化学手段探索也见报道。这些开创性的工作为用电化学手段探索生物体系的奥秘打开了大门生物体系的奥秘打开了大门。近几十年来，人们对蛋。近几十年来，人们对蛋白质直接电化学的研究主要集中在蛋白质固定在电极表白质直接电化学的研究主要集中在蛋白质固定在电极表面上的直接电化学响应。因为面上的直接电化学响应。因为蛋白质在电极表面具有蛋白质在电极表面具有良好的取向是实现蛋白质良好的取向是实现蛋白质电极之间直接快速电子电极之间直接快速电子传递的前提。因此采传递的前提。因此采 用适当的方法在电极表面固定用适当的方法在电极表面固定蛋白质蛋白质,是目前蛋白质电化学研究的热点。是目前蛋白质电化学研究的热点。第六十八页，编辑于星期一：八点 八分。但是大部分氧化还原酶的活性基团被外层的保护性蛋白质和糖原所包裹，无法与电极进行电子交换。Marcus方程给出了理论依据：其中 G G是反应自由能反应自由能；是MarcusMarcus重组能重组能；d d是氧化还原中心实际电子传递距离电子传递距离(即酶氧化还原中心与电极或媒介体之间的距离)。从式可知，电子传递的动力学特性由以下因素决定：推动力、重组能、实际电子传递距离。氧化还原酶的分子量一般在40 000(如：半乳糖酶)至850 000(如：胆碱脱氢酶)Da(Dalton-道尔，一个氧原子质量的1/16)之间，它们的平均直径在55150之间。通常，氧化还原酶很难与电极进行直接电子交换。第六十九页，编辑于星期一：八点 八分。2、酶直接电荷传输所采用的主要方法：（1）通过对酶的修饰形成电极转移接替体（Electron-transfer relay）-缩短电子隧道的距离；（2）使用电子转移促进剂；（3）酶固定在导电聚合物膜内的直接电化学；（4）酶在电极表面的规律定向吸附。第七十页，编辑于星期一：八点 八分。A.蛋白质膜修饰电极B.蛋白质溶胶/凝胶修饰电极C.蛋白质表面活性剂膜修饰电极D.蛋白质双层类脂膜修饰电极E.蛋白质DNA膜修饰电极F.蛋白质聚合物膜修饰电极G.蛋白质纳米粒子修饰电极(1)基于蛋白质直接电子传递的修饰电极第七十一页，编辑于星期一：八点 八分。A.蛋白质膜修饰电极 由Armstrong 等创立的蛋白质膜伏安法(PFV)具有许多优点:(1)蛋白质膜电极的制备简单,需用蛋白质的量较小;(2)克服了溶液体系中蛋白质的扩散系数较小的限制;(3)能使用快速扫描伏安法研究电子传递过程;(4)通过电化学数据分析可获得丰富的生物化学信息。第七十二页，编辑于星期一：八点 八分。蛋白质膜修饰电极的制备:经过抛光的棱面裂解石墨电极(PEG)表面产生较多的亲水含氧基团。在低温(0C)、低离子强度和共吸附剂(如氨基环多醇)的存在下,通过静电吸附作用,在电极表面形成一层蛋白质膜(吸附量10-1110-12 mo l cm-2)。共吸附剂在荷电的蛋白质和电极之间起着促进电子传递的作用。第七十三页，编辑于星期一：八点 八分。B.蛋白质溶胶蛋白质溶胶/凝胶修饰电极凝胶修饰电极溶胶溶胶-凝胶法一般是以金属盐或半金属盐凝胶法一般是以金属盐或半金属盐(硅酸甲脂硅酸甲脂TMOSTMOS，硅酸乙脂硅酸乙脂TBOSTBOS，钛酸丁脂等）为前驱体，在水，互溶剂，钛酸丁脂等）为前驱体，在水，互溶剂及催化剂的存在下发生水解和缩聚反应，形成及催化剂的存在下发生水解和缩聚反应，形成SiOSiO2 2网状网状结构结构。蛋白质包埋在溶胶凝胶中蛋白质包埋在溶胶凝胶中,一方面与硅酸酯形成氢健一方面与硅酸酯形成氢健,使之构象不易变化使之构象不易变化;另一方面另一方面,与硅酸酯中的甲基等疏水与硅酸酯中的甲基等疏水基团存在相互作用基团存在相互作用,既能保持蛋白质的活性既能保持蛋白质的活性,又可防止蛋又可防止蛋白质从凝胶膜内泄漏白质从凝胶膜内泄漏,而一些小分子、离子则可以自由而一些小分子、离子则可以自由进出溶胶进出溶胶凝胶的孔隙。特别是一些掺杂和衍生的溶胶凝胶的孔隙。特别是一些掺杂和衍生的溶胶凝胶凝胶,克服了生物分子在溶胶克服了生物分子在溶胶凝胶形成过程中凝胶形成过程中,因温因温度、酸度及有机溶剂等不利条件而降低酶活性的问题。度、酸度及有机溶剂等不利条件而降低酶活性的问题。第七十四页，编辑于星期一：八点 八分。C.蛋白质表面活性剂膜修饰电极蛋白质表面活性剂膜修饰电极 生物膜主要由蛋白质和磷脂组成。磷脂分子结构的两性特生物膜主要由蛋白质和磷脂组成。磷脂分子结构的两性特征决定了它们在生物膜中的双分子层排列及其与各种蛋白质相征决定了它们在生物膜中的双分子层排列及其与各种蛋白质相结合的特性。表面活性剂具有类磷脂两性结构结合的特性。表面活性剂具有类磷脂两性结构,它们在电极它们在电极表面能形成稳定的膜表面能形成稳定的膜,并能促进氧化还原蛋白质与电极之并能促进氧化还原蛋白质与电极之间的电子传递。间的电子传递。表面活性剂膜中表面活性剂膜中,蛋白质保持着原始构象不变蛋白质保持着原始构象不变,与电极与电极之间的电子传递速度大大加快。肌红蛋白之间的电子传递速度大大加快。肌红蛋白(M b)(M b)、血红蛋白、血红蛋白(Hb)(Hb)、细胞色素、细胞色素P450(CytP450)P450(CytP450)、辣根过氧化物酶、辣根过氧化物酶(HRP)(HRP)、过氧化氢氧化酶、细胞色素、过氧化氢氧化酶、细胞色素c c 氧化酶等含有血红素的氧化酶等含有血红素的蛋白质蛋白质,都可实现都可实现Fe(Fe(）-Fe(-Fe()电对与电极之间电对与电极之间直接、可逆、快速的电子传递过程。直接、可逆、快速的电子传递过程。第七十五页，编辑于星期一：八点 八分。制备这类蛋白质表面活性剂修饰电极有两种方法:(1)在电极表面蘸涂含表面活性剂的氯仿溶液,氯仿挥发后,形成表面活性剂膜电极,该电极可从溶液中吸附蛋白质;(2)将蛋白质与表面活性剂的微囊分散混合,取混合液蘸涂至电极表面,空气干燥。第七十六页，编辑于星期一：八点 八分。D.蛋白质双层类脂膜修饰电极蛋白质双层类脂膜修饰电极 双层类脂膜在结构上与天然生物膜相似双层类脂膜在结构上与天然生物膜相似,能能将生物分子嵌入其中同时保持其生物活性。利用将生物分子嵌入其中同时保持其生物活性。利用各种固相载体支撑的自组装双层类脂膜或混合层各种固相载体支撑的自组装双层类脂膜或混合层类脂膜的高度有序且稳定性良好的特点类脂膜的高度有序且稳定性良好的特点,作为仿作为仿生膜生膜,可以模拟氧化还原蛋白质生物代谢过程的可以模拟氧化还原蛋白质生物代谢过程的特性特性。第七十七页，编辑于星期一：八点 八分。E.蛋白质DNA膜修饰电极 DNA 和氧化还原蛋白质同存在于线粒体内,研 究氧化还原蛋白质与DNA 的作用,对理解生物呼吸链能量转换具有极其重要的意义。Rusling 等采用逐层组装的方法,将DNA-M b 和DNA-Cyt P450固定在电极表面,得到Fe(）-Fe()电对的可逆电化学反应,应用于环境污染物的检测与转化。第七十八页，编辑于星期一：八点 八分。F.蛋白质聚合物膜修饰电极 1995年，Yuri Lvov用逐层吸附的方法将蛋白质固定在离子聚合物中实现蛋白质的直接电化学响应以来，人们开始用不同类型的聚合物来固定蛋白质。如聚胺类，纤维素类等第七十九页，编辑于星期一：八点 八分。用于固定蛋白质的常用聚合物：离子聚合物。如PSS（聚苯乙烯磺酸钠）PDDA（氯化聚二甲基二烯丙基胺），PASA（聚苯胺磺酸钠）等。生物高分子。如甲基纤维素，琼脂糖，甲壳素等。第八十页，编辑于星期一：八点 八分。F.蛋白质纳米粒子修饰电极纳米粒子具有比表面积大、催化活性高、亲和力强的特点,用于固定生物组分备受关注。HRP 固定于金纳米粒子表面,制得HRP-A u 胶粒修饰电极,不需媒介体便能催化还原H2O 2,说明金微粒与HRP 作用,缩短了酶活性中心与电极表面的距离,实现了直接电子传递过程。用自组装膜吸附纳米金粒,再固定HRP 或Hb,其辅基血红素直接与电极传递电子,且能催化还原H2O 2。HRP 或Hb 在电极表面的覆盖量和催化能力与金粒直径大小有关,直径越小,催化效率越高.第八十一页，编辑于星期一：八点 八分。除了纳米金以外，一些纳米氧化物也广泛用于固定和催化蛋白质的直接电化学。如纳米氧化钛，纳米氧化锆，纳米氧化锌，纳米氧化硅，纳米氧化锰，碳纳米管等。随着纳米粒子与蛋白质作用机理研究的深入,各种新型纳米粒子的制备,特别是量子点的引入及制备微型传感器和芯片实验室技术的发展,可望从分子水平动态研究生物体系,揭示其内在规律。第八十二页，编辑于星期一：八点 八分。此外还有一些复合膜来固定蛋白质。纳米粒子与聚合物复合膜（层层吸附法依 次吸附PSS，PDDA，二氧化硅和蛋白质）纳米粒子与DNA纳米粒子与表面活性剂聚合物和DNA等第八十三页，编辑于星期一：八点 八分。思考题思考题1.1.、简述生物传感器中酶的主要固定方法、简述生物传感器中酶的主要固定方法2 2、简述生物传感器的基本原理和电化学生、简述生物传感器的基本原理和电化学生物传感器的主要类型物传感器的主要类型第八十四页，编辑于星期一：八点 八分。