石蜡切片的制作程序

石蜡切片的制作程序1、病料的采集：采集病料要及时，以防组织变质发生自溶。病理组织材料要采取病变典型突出的 部分，最好选病变与健康组织的交界处，以识别和探讨病变的发生和发展。组织块一 般不宜过大，以35mmX35mmX 1015mm为宜。过大过厚的组织块容易影响固定和 浸蜡的质量，不易切出较好的切片。采取病料时应保持器官组织的原来形状，用锋利 的刀剪切取，切勿挤压，损伤或扭折，以免造成人为的损伤。2、固定：固定的目的是使组织和细胞的较粗大的结构尽量保持正常状态，避免发生形态学 结构变化，使细胞保持一定的硬度，以利于切片。采取的病料组织块应及时投入固定 液内进行固定，以防腐败。并做好标记，便于识别。固定液用量一般为组织块体积的 1020倍。固定剂的种类很多，一般能凝固或沉淀蛋白质及脂肪等成分的药品都可以做固定 剂。如：酒精、甲醛、冰醋酸、苦味酸、升汞等等。可以按照不同的目的来选择使用 固定剂，常用的固定剂主要是福尔马林(formalin 3740%的甲醛)，最适合固定的浓 度为10%福尔马林(3.7%4%甲醛)，固定和保存时所用的溶液是指福尔马林的百分比， 而不是甲醛，例10%福尔马林溶液是10毫升的福尔马林加上90毫升的水配成。所以 10%的福尔马林，实际上仅含3.74%的甲醛。福尔马林易被氧化为甲酸，故常带酸性，为得到中性福尔马林可加毗啶、碳酸钙或 碳酸镁的方法使之中和。例如在100毫升的25%福尔林中加5毫升的毗啶；可使它的pH 上升到7.0； 10%的福尔马林可被过量的碳酸钙中和为pH6.4；如果用碳酸镁则为pH7.6。 冲淡的福尔马林(10% )更易氧化，为了保持它的中性，可于其中放入几小块大理石。福尔马林必须为无色透明，若贮藏时间较长或存放在温度太低会变混浊，呈絮状 物。为防止该现象的发生可提前加少许甘油以阻滞其聚合，沉淀物则可加热溶解，如 加热仍不能溶解，则可加等量热的0.8%碳酸钠或0.4%氢氧化钠(约6070C)溶液，在 室温放置23天，沉淀物就会消失。此时福尔马林淡了一倍，稀释时要相对地减少一 半,含有杂质的福尔马林，通常加热至98.7C蒸馏，可得30%的纯净福尔马林,稀释再 用。福尔马林作为单纯固定液，以贝克氏(Bakers)改良为好。其配方如下:蒸馏水90毫升福尔马林(3740%)甲醛10毫升无水氯化钙1 克加氯化钙可改变固定液的渗透效应，更好地保存细胞原形。3、冲洗：材料自固定液中取出后，须立即冲洗，使其中含有的固定液全部除去，一直到洗 净为止。常用的冲洗方法如福尔马林固定的组织可用自来水缓缓冲洗，冲洗时间视固 定时间和组织块大小不同而异。一般挂于水笼头上冲洗624小时。4、脱水：脱水的目的在于使组织中的水分完全除去，并使组织变硬。各种材料经固定与冲 洗后，组织中就含有大量水分，而材料又逐渐变软，不能直接投入石腊中包埋，因为 水和石蜡是不相溶合的，一定要经过脱水剂将水分脱净，透明剂透明后，才能进行包 埋。一般常用脱水剂为酒精、丙酮、二氧六环等。脱水的方法是在室温下将脱水剂用水配成不同的梯度浓度，然后将组织块置入其 逐级进行脱水。如 50%、70%、80%、90%、95%（各 2 小时），100% （I） 100% （II）各 1.5小时。脱水时应注意每级中停留的时间依材料的大小、性质以及固定液的性质而定。但 不十分严格，柔软组织每级可停12小时，坚韧组织可停14小时。如需过夜，应 停留在70%酒精中。5、透明：组织块脱去水分之后，需经透明才能浸蜡。因为酒精等脱水剂与石蜡不能溶合， 必须经过一种既能与酒精等脱水溶合又能与石蜡溶合的溶剂的处理，才能使石蜡易于 浸入组织。常用的这种溶剂有二甲苯、甲苯、苯、氯仿等。一般过程是100%酒精+”二甲苯（1： 1） 20分钟、二甲苯（I） 15分钟、二甲 苯（II） 15分钟。如果组织块有局部不能透明有呈白色混浊状态时，则是因脱水不彻底所致，应退 回重新脱水，然后再透明。6、浸蜡：组织块经透明之后，即可浸入已溶化之石蜡中使石蜡渗入组织内部，这一过程即 称为浸蜡，浸蜡的全过程应在恒温设备中进行，应注意控制温度。温度过低则石蜡凝 固成固相，不利于渗入组织；温度过高则组织受损变脆，不利于切片。一般常用以5456C溶点的石蜡为宜。如能在石蜡中掺入一些纯蜂蜡，更有利于 切片。将恒温箱（或锅）调至58Co一般是二甲苯“ + ”石蜡（1 ： 1）的混合液进行预处理约30分钟（亦在溶蜡的温 度中进行），然后浸入纯石蜡（1）23小时、纯石蜡（纯石蜡11）23小时。浸蜡必须彻底，否则组织内残留透明剂会造成切片过程的困难和影响切片的质 量。控制时间和温度，既要彻底浸蜡，又要时间短。7、包埋：将浸蜡完毕的组织块凝封在小蜡块中，这一过程你为包埋。在一定容器内（小纸 盒、包埋框、小玻璃皿等）注入溶化之石蜡，将已浸的组织块置入其内（应使欲切之组 织面向下），使蜡块迅速冷却硬固，组织块在蜡块中可长期保存。8、石蜡块的整修：整修蜡块的目的在于使切成的蜡带成一直线，不发生弯曲，以便于镜检或作连续 切片，为了达到这一目的，整修时，须将石蜡块上下两面修成平等的面，这样切成的 蜡带就成直线。整修时应将上下左右多余的石蜡修掉，但也必须注意不要太靠近组织， 把组织裸露在外又会造成切片时易破碎的不良后果，所以组织四周的蜡层不应少于2 毫米。此外，为了便于在蜡带上分开每一切片，可将石蜡块的一角切去。9、切片与展片旋转式切片机的切片方法：先进行用具的准备：滑行切片机，切片刀，毛笔二枝，培养皿一套。然后将带有 蜡块的木块固定在切片机的标志夹内。将切片刀安装妥当，与组织块成15夹角，调节 切片机上的微动装置，使厚度计达到所需切的厚度，一般为68um，调节好刀口与组 织块的距离便可开始切片。转动旋转轮柄，摇动一转可切下一片，弃去前几刀的切片， 待切片均匀平展时，用毛笔将切片粘下，置于温水（4245C）中展片，切片完毕后， 切片刀和切片机必须注意清理和擦洗干净。10、贴片及烤片：待石蜡切片自然伸展平之后，用预先均匀涂一层贴片液（1 : 1蛋白甘油液）的载玻 片轻轻地从水中捞取切片，拨正位置，控干水分，然后放入温箱内烘干（3745C）约 需24小时，或在温室中自然干燥（约需一夜），亦可将切片置于玻片上，再加少量 水，然后持玻片在灯上加温切片伸展。11、染色：染色的目的在于使组织或细胞的不同成分之间有明显的对比色，以利于显微镜下 观察。石蜡切片常用苏木精，伊红对比色法（简称H-E染色）进行染色。苏木精本身不是染料，需经氧化以后形成氧化苏木精才有染色作用。苏木精染料 一种配方如下：哈里斯（Harriss ）苏木精：配方：甲液 苏木精0.5克95%酒精5毫升乙液： 甲矶或铵矶（硫酸铝铵）10克蒸镏水100毫升氧化汞0.25克冰酸酸几滴配法：（1）将0.5克苏木精溶解于5毫升95%酒精中。（2）溶解10克钾矶或铵矶于100毫升的蒸镏水并加热煮沸。（3）将上述两液混合煮沸半分钟，并加入0.25克氧化汞。（4）很快地在冷水浴锅中冷却。（5）冷却液过夜后用双层滤纸过滤，并加入冰醋酸几滴，以加强核的染色。此液 配制后可保存一、二个月。伊红为染胸浆，胶原纤维，肌纤维及嗜酸性颗粒等常用染料，是一种酸性染料， 伊红的种类很多，名称也不统一。有伊红Y，乙基伊红（醇溶伊红）、伊红W（水溶性）等。 使用浓度一般用0.51%，染色时间30秒至数分钟。H - E染色操作方法序列如下：脱蜡：将欲染的切片（贴附于载玻片上）浸入二甲苯（I）以溶去石蜡（15分钟）， 再入二甲苯（II）洗涤（15分钟）、二甲苯“ + ”100%酒精（1： 1）2分钟用无水酒精（I） 2分钟、无水酒精（II） 2分钟以除去二甲苯。依次在95%、85%、70%、50%各级酒精中浸泡各2分钟，再入蒸馏水2分钟，使 切片不致从高浓度酒精中骤然进水而脱落。切片以Harris氏苏木液染10分钟。-用自来水泡洗2分钟，以洗去多余的染液及浮色。用盐酸酒精分化（约1分钟，需摸索条件），使切片呈砖红色，然后水洗（约 1分钟），以脱去细胞质染上的苏木色素。 1%氨水兰化（约1分钟）或自来水15min，使组织返回兰色，镜下检查可见细 胞核染成兰色，胞浆无色，用蒸馏水泡洗约1分钟。将玻片置于50%、70%、85%、95%酒精逐级脱水（约2分钟）。浸入95%醇溶伊红染色5分钟，再经两次无水酒精各2分钟，以彻底脱水。经二甲苯（I）、二甲苯（II）透明，各8分钟，以除尽组织中的酒精成分，并 使切片呈透明状，以利观察。树胶封固：切片在二甲苯（II）中取片，不等二甲苯干燥即滴上一滴中性加拿大 树胶，用右手持细镊轻轻地夹住盖玻片的右侧，并把它的左边放在树胶的左边，然后 左手持一解剖针扶住盖玻片的左边，右手将镊子松开逐渐下降，慢慢抽出，这样树胶 在盖玻片均匀地展开并将其中气泡排出。甲二甲苯擦干净出盖片周边多余溢出的树胶， 将切片置于平稳，干燥之处，稍加重压，待树胶干燥凝固，切片即可长期保存观察。 观察时应注意的事项：