石蜡块可以做常规PCR

石蜡块可以做常规PCR一、石蜡包埋组织DNA提取的基本方法从石蜡包埋组织中提取DNA的基本步骤，是在常规DNA提取方法的基础上改良和演变而 业。Goelz等(1985)最先提出的石蜡包埋组织DNA提取技术，是用机械的方法破碎组织， 切除多余的石蜡，进入含SDS和高浓度蛋白酶K (1 mg/ml)的提取缓冲液加温孵育，然后 进行苯酚和氯仿抽提。所得DNA虽不完整，但可被限制性内切酶切割，因而适于点杂交， 印迹杂交等多种分了生物学实验。Dubeau等(1986)在上述方法上作了改进。首先通过组 织切片和二甲苯和脱蜡，保证了组织的完全破碎，使细胞与消化液充分接触，使DNA释放 和蛋白去除更加完全；其次通过两步消化的方法，将不适于做分子杂交的降解的DNA小段 去除，仅保留那些可螺旋化的完整的DNA分子，从而提DNA质量，适于做Sorthern印迹 杂交分析。Moerkerk等(1990)对上述两种方法进行了比较，发现两种方法所提行DNA之 点杂交结果一致，非螺旋化DNA亦不影响杂交分析。Goelz氏DNA提取方法的主要步骤.切除多余石错，暴露组织.将组织切碎(最大径0.5mm)，称重；3. 溶于 TE9 提取液(组织50mg/5ml.50500mg/10ml),高速混悬 2 3min，于 48C放置 24h TE9提取液的制备500mmol/L Tris20mmol/L EDTA10mmol/L NaCl1% SDS500 p g/ml蛋白酶KpH8.04. 再次混悬组织，加入蛋白酶K至终浓度1 mg/ml，SDS至2%，孵育40h；5. 用等体积酚一氯仿溶液抽提3次；6.2.5倍体积乙醇沉淀DNA7,-70C放置 2 4h8.9 000xg 离心1 h9.沉淀物用70%乙醇洗1次0.干燥，TE (pH7.2)溶解。不同类型的基因分析所要求的DNA质量和数量不同。Southern印迹杂交分析需要10 15p g大片段DNA (20kb)，因为杂交前要进行相谓的限制性内切酶消化和凝胶分离不 同片段长度的DNA。故DNA提取要求高，小片段DNA存在会直接影响杂交信号。与之相 反，多聚酶链反应(PCR)则可在相对粗制的小片段DNA存在会直接影响杂交信号。与之 相反，多聚酶链反应(PCR)则可在相对粗制的小片段DNA样本上进行，分析所需的DNA 很少，0.5p g甚至更少即可。PCR的模板DNA制备方法很多，除上述两种方法外，还有更 简便的直接水煮法(Slebos,et al,1990； Smit, et al, 1988 )、蛋白酶消化法(Impraimet al.1987； Brice,et al.1989)。这些方法不经过酚一氯仿一异戊醇抽提、DNA纯化等步骤，直接将组织放在去离子水中煮 沸10min或在蛋白酶K缓冲液中消化4h，DNA即可释放出来。此提取物可直接用作模板， 进行PCR扩增，但是，我们发现直接水煮法和蛋白酶消化法提取的DNA，扩增率较低， 且征对性不好。这可能是由于DNA附着的蛋白质去除不净而影响DNA变性和与引物的结 合，亦可能是由于标本中残留的固定剂等成分对Taq DNA多聚酶的抑制所致。二、影响DNA提取质量的因素1. 固定剂对DNA的影响固定剂的类型直接影响提取DNA的质量。目前大多数实验室常用 的中性缓冲福尔马林固定的标本，DNA保存完好，可以获得高分子量DNAo Watford等（1988） 对甲醛固定过程中DNA变化进行了观察，发现核酸对甲醛反应性可分为两个阶段：早期 出现碱基快速可逆转羟甲基化；数天后碱基对间核酸与蛋白间缓慢地形成亚甲基交联。 DNA提取过程中的蛋白产K消化，酚/氯仿抽提和纯化等步骤，可以消除由于固定所造成的 DNA某些理化性质改变。Barmwell等（1988）发现，甲醛和戊二醛固定可使得DNA产量 降低，醋酸甲醇（MAA）可导致DNA明显降解。Michels运输保存液或PBS存放组织虽提 取DNA纯度高，但产量得明显降低。Dubeau等也观察到含苦味酸（Bouin氏液）和含氯化 汞的固定液（Zenker，Bs）处理标本不能获得完整的DNA。乙醇被认为是保存核酸的最佳 固定剂。Wu等（1990）用无水乙醇固定标本48h，最长达2年，均可得到中量的高分子DNAo 每mm3乙醇固定标本平均DNA产量为26.6p g，高于新鲜标本（19.4/mm3）。经限制性内切酶消化后，乙醇固定组织DNA均显示由于重复DNA序列存在所产生的特征 性内切酶消化后，乙醇固定组织DNA均显示由于重复DNA序列存在所产生的特性卫星带， 说明DNA被完全消化。Southern印迹杂交结果与冰冻组织一致。Sato等（1990）用AMex 方法处理组织，既可保存许多抗原成分，亦可使大分量DNA完好无损。其基本方法为：将 组织放至4C丙酮浸透，移至一20C过夜。然后再用丙酮分别在4C和室温脱水各15min， 苯甲酸透明两次，每次15min，最后60C真空浸蜡2 3h，石蜡包埋。结果显示，每10mgAMex 法处理的温重组织提得高分子量DNA71.4?4.53|J g，与新鲜组织产量相当（70.473.76p g）。 酶切、电泳和杂交反应亦相同于新鲜组织。提示AMex法是一种多用途组织处理技术，可 以克服由于DNA降解、高分子量DNA减少和内切不完全消化所产生的电泳类型改变，是 一种理想的DNA保存方法，特别适用于对开矿学、免疫表型和基因改变的相关分析。2. 固定时间对DNA的影响固定过程中所发生的组织反应至今尚未被完全理解，虽然理论 上讲室温下福尔马林与DNA几乎不发生的，但已发现碱基与组蛋白之间的甲基交联。这福 尔马林介导的甲基化直接影响DNA提取的效率。如果事实果真如此，那么固定时是一个重 要的变异因素。然而，Goelz等，没有发现固定时间对DNA提取量的明显影响。Dubeau等 认为组织固定时间太短或太长均会导致DNA的降解。该作者对固定12h到5天不同时间间 隔标本的DNA提取显示，随着固定时间的延长，可螺旋化（Spoolable）的高分子量DNA 明显减少。固定5天后可螺旋化DNA提取率仅有8%。Warford等也发现单细胞悬液经30min 福尔马林固定后，DNA产量减少到30%，由此可见，不同标本对不同固定剂所需的最佳固 定时间应模索选定。根据Dubeau等经验，常规组织固定应在12h以上至110h之内。3. 固定温度等其他因素对DNA的影响核酸与固定剂的反应由反应成分、浓度、酸硷度以 及温度等因素的调节，其中温度效应显得特别重要。室温下DNA双股螺旋链表现为两条由 氢键连接的互补多聚核苷酸；加热到65C时，氢键开始断裂；约90C时，产生两条单链分 子。最近，Koshiba等发现福尔马林固定过程中的DNA降解，是由于固定温度高，pH低以 及甲酸的存在所致。通过应用缓冲福尔马林和低温下固定（4C），可以明显改善DNA保存。 酸性环境中DNA的降解已有过深入的研究。一般认为，强酸可导致DNA的完全解聚，而 弱酸也能引起一些结构改变。当pH达到2.5惟下时，几乎所有碱基之间氢键解离，使DNA 双链断裂而产生不可逆的变性；随后出现N一糖苷键水解，使嘌吟残基游离；最多，多聚核 苷之磷酯键缓慢水解，仅残留具有完整嘧啶的多聚脱氧核糖短臂。上述改变亦受温度或离子 强度的影响。加入盐或降低温度可稳定氢键，因而可防止酸性条件下的DNA变性。然而， 既使福尔马林被氢氧化钠中和，在室温下DNA亦发生降解，提示福尔马林本身即可降解 DNA。福尔马林中DNA降解的机理及其预防有待于进一步研究。4. 组织处理过程对DNA的影响我们发现，从常规组织处理的蜡块中提取的DNA，其大部 分分子量晨100bp- 10000bp之间，主要分布于100 1500bp，仅约1/3的组织所提取 DNA20kb。这除与固定剂、固定时间等因素有关以外，可能的原因还有：组织从外科切 除到固定之间的时间长短下一。当组织未固定或固定不充分时，核酸酶可自由作用；不同 肿瘤中核酸酶的水平不一，其在固定前或固定后均不发挥作用;蜡块贮存的地间长短不一。 虽然本所获得的DNA分子量大。可能蜡块中仍存在导致DNA降解的因素。组织的浸蜡和 包埋温度过高或时间过长，均可导致DNA弯性，而产生单链DNA片段。单链DNA不能被 限制性内切酶所消化，可导致电泳时泳动速率变慢。三、提高DNA提取质量的方法1. 蜡块的选择从福尔马林固定的组织中未能提出完整的高分子量DNA的重要原因之一， 是应用了固定不充分的组织。因此，在DNA提取前应检查组织切片。如果有自溶、退变或 组织结构不清，大片出血等改变的蜡块不能用；若有明显坏死存在的蜡块，最好不用或将坏 死部分切去后再用。尽可能地选用新近标本，缓冲福尔马林、丙酮和乙醇固定者最佳。2. DNA提取方法学的改善为了提高石蜡包埋组织DNA提取的质量和效益，人们不同方面 进行了探索。其中在DNA提取液的改良，蛋白酶的消地间的DNA纯化等问题上取得了进 展。DNA提取液主要为含SDS和蛋白酶K的TE缓冲液。固定和包埋组织由于化学修饰 作用，使得DNA与蛋白质不易分离。因此，必须增加SDS和蛋白酶K的浓度和作用时间： SDS可增至1%-2%，蛋白酶K可分次加入，并注意不时震摇，使酶与组织充分接触。Koshiba 等尿素和胍（guanidine）是DNA自然和人工交联最有力的剥脱剂，2巯基乙醇可干扰二 硫键，促进蛋白变性。作者对DNA提取液进行了改良，加入高浓度（4mol/L）尿素和2 羟基乙醇。应用此缓冲液，有效地从包埋组织中获得了高质量DNA0DNA释放率对于不 同蝗组织类型是有差异的，最决于组织细胞密度和细胞外间质的多少。对于细胞丰富、含有 很少间质的组织（例如脾脏），通过24h孵育80%以上DNA可释放出来；相同量的DNA 释放对于富含致密间质的子宫肌瘤则需要6天时间;转移性畸胎瘤含中等细胞密度和疏松的 间质，DNA释放率亦为中等。由此可见，对不同类型的组织DNA提取，蛋白酶K的孵育 时间可作适当调整，以求大量地获取大分子DNA。此外，对于Dubeau等提出的DNA提取 过程中分次消化步骤的必要性，也有人提出异议。因为低、中分子量的核酸存在对限制性内 切酶的消化和杂交不起作用。Dubeau等发现，不适于进行酶切反应和杂交研究的化学修 饰的DNA，可通过搅起完整的DNA而被动除去，因而强调了螺旋化（spooling）在DNA 纯化中的重要性。该作者还发现延长组织固定时间的影响之一就是减少了可螺旋化DNA的 量，杂交分析显示，螺旋化DNA杂交信号强，而未螺旋化DNA信号减弱。因此，增加DNA 螺旋化可提高提取DNA质量和杂交效率。但是，Moerkert等认为未螺旋化DNA不影响进 行点杂交分析。3. 免疫DNA机械性损伤福尔马林固定和石蜡包埋使组织变得坚韧，很难达到匀浆的效果。 经常的做法是将组织切在3 5p m薄片，使每一细胞都被切开但是，我们认为切片太薄， 容易对过多地将DNA切断，影响高分子DNA的获得率。最好是采用15 20p m的厚切片， 高浓度蛋白酶K消24天，使能达到细胞充分破碎、蛋白肖化的目的。并尽可能避免机械 性匀浆过程造成的DNA剪切。此外，在DNA释放出来以后的提取过程中，应尽可能轻柔 操作，避免过多地移管。若必需移管时应选用大口吸管。尽可能避免人为的DNA剪切。纯 化DNA用TE （pH8.0）溶解放4C保存即可，若短其不用时应-20C冻存，但切忌反复冻融， 以免DNA降解。