Trizol法提取细胞中RNA及逆转录合成cDNA

Trizol 法提 RNA试剂及材料：Trizol （3号冰箱4C 3层）、三氯甲烷、异丙醇（以上二者在有机 厨）、75%乙醇（按DEPC水:无水乙醇=1： 3配制）、DEPC水（以 上二者在3号冰箱一20C3层）、肺动脉平滑肌细胞仪器：4C离心机、移液枪、Nano drip 2000（微量紫外分光光度仪）、1.5mlEP管、200ulEP管、EP管插板、冰盒准备：1、配制DEPC水：取一个500ml蓝盖瓶，用去离子水洗涤，加入超纯水500ml, 想瓶中加入DEPC母液0.5ml，震荡摇匀，在通风厨内常温过夜，灭活RNA酶， 第二天将瓶子盖拧松，高温高压消毒灭菌（121C，30min）,消毒后分装在1.5mlEP 管中，4C保存。2、新鲜标本的保存（备用于RNA提取）：取新鲜标本，先放入液氮中，然后冻存于-80C。3、动物组织提RNA前处理：用PBS冲洗干净后，按50-100mg加入1ml Trizol，用电动匀浆器或者一次性研磨杵充分匀浆，最好在冰上进行。注：均质50-100毫克组织样本需要1毫升的TRIzol试剂，使用特富龙玻璃或强 力均质机 （Polytron, or Tekmars TISSUMIZER TISSUMIZER 或相当的仪 器）。均质时样本体积不应超过TRIzol试剂体积的10%。b.单层细胞 直接在培养皿中裂解细胞，3.5厘米直径的皿中加入TRIzol试 剂1毫升，并通过抽吸几次促进细胞裂解。TRIzol试剂的添加量基于培养的面 积而不是细胞的数目（每10平方厘米加入1毫升）。TRIzol试剂量不足可能会 导致分离出的RNA有DNA的污染。步 骤：1. 将处理完的35mm细胞皿从细胞培养箱中取出，用预冷的PBS清洗1-2 次，迅速加入 已经预冷的Trizol液1ml，室温孵5分钟。2. 收集标本悬浮于1.5ml EP管内，加入200ul三氯甲烷，用手上下震荡15 秒，使之充分混匀成乳状，室温孵育3分钟。3. 标本12000rpm, 4离心15分钟（离心机提前预冷）,然后小心取出离心 管，置于冰上（注意：避免摇晃）。4. 用枪头慢慢吸取上清液（尽可能多吸，但避免吸到中间白色蛋白层），置 于一新EP管中。5. 向管中加入0.5ml异丙醇，混匀，室温孵育10分钟。6. 标本再置于离心机内，12000rpm，4离心10分钟。7. 弃上清，加入事先配好的75%乙醇1ml （用DEPC水和100%乙醇配制）， 震荡，7500rpm 4离心5分钟。8. 倒掉上层乙醇，并保持离心管于倒置状态固定于离心管架上，待酒精挥发 十（干燥5-10min即可）。若管壁残留酒精较多，可用枪头吸干，但避免吸到RNA 沉淀。9. 加入20ulDEPC水，枪尖置于液面下吹打3次，混匀。室温放置5-10分钟， 溶解RNA。10. 置于冰上，吸取1ul RNA样本用紫外核酸蛋白分析仪（14楼）测RNA 浓度。评价标准：260/280接近2，不低于1.8才可用。测RNA浓度步骤：准备一管DEPC水（空白对照）；a、连接nanodrip2000，打开电脑桌面软件b、nuclide-TYPE选择RNA-加1-2ul水-点击Blank来进行空白对照检 测并保存参比图谱，虽然不需要在每个样品之间进行空白校准，但我们建议在检 测多个样品时，最好每30min进行一次空白校准。30min后，最后一次做空白检 测的时间将显示在软件下面的状态栏上。c、用无尘纸擦干上下基座上的样品后，再加1-2ul水-点击measure，结果 应该是差不多为一水平线，吸光值变化应不超过0.04A （10mm光程），显示浓度 在+0.5以内。d、用无尘纸擦干上下基座上的样品后，再加入待测RNA溶液1ul，读数。11.80 C保存或供逆转录用即可。RNA逆转录合成cDNA试剂：TakaRa 试剂盒（#AK5301）仪器：PCR仪步骤：1.计算RNA需要量：反应体系中所需 RNA的量为1000ng，体系为 20ul（10ul+10ul）。用200ulEP管，加入RNA的体积为V=1000ng/RNA浓度。剩余体积用无 RNA酶的水（试剂盒内有）定容至10ul。样本1RNA体积3.33RNA 酶 Fee H2O6.6725.534.4735.644.36NC5.474.536812.627.382.配制反应试剂混合液（Takara试剂盒，2号冰箱，一20C，一层）。RAN Fee H2O3185X Prim Buffer424（最后再加）Prim RT Enzyme16Rando 引物16Oligo 引物16总体积1060（总共配的份数要比需要的多2个体系，原因：有损耗）3.吸取10ul反应混合物加至每管（每管10ul反应试剂混合物+10ulRNA液）， 混匀后置于冰上，14楼行逆转录。（1）37C15分钟（反应时间）（2）85C5秒钟（逆转录酶失活）（3）4C保存（相当于4C冰箱）操作步骤：开机一fiels一preciousCYQ一run （21min）4将cDNA产物稀释10倍（20ul产物+180ulDEPC,根据实际情况，组织样 本可以稀释20倍，RNA提的不好的话可以稀释5倍），-20C保存待用。