分子生物学实验技术

分子生物学实验分子生物学实验目目 录录实验一、植物染色体实验一、植物染色体DNA的提取及纯度鉴定的提取及纯度鉴定实验二、大肠杆菌质粒实验二、大肠杆菌质粒DNA的提取的提取实验三、琼脂糖凝胶电泳实验三、琼脂糖凝胶电泳实验四、的限制性酶切实验四、的限制性酶切实验五、大肠杆菌感受态细胞的制备及外源实验五、大肠杆菌感受态细胞的制备及外源DNA的转化的转化实验六、实验六、PCR基因扩增技术基因扩增技术实验一、植物染色体实验一、植物染色体DNA的提取的提取 及纯度鉴定及纯度鉴定一、实验目的 掌握真核植物基因组染色体DNA的一种提取方法 学习使用紫外分光光度法鉴定DNA的纯度，估计相对含量。二、实验原理 用低温机械研磨和高浓度、SDS等破坏细胞壁及膜，使蛋白变性使DNA与蛋白分离，用一定浓度的溶液将DNA提取出来，用高浓度乙醇沉淀DNA，氯仿/异戊醇等去除杂质，RN ase降解核酸，得到纯度较高的DNA样品。根据核酸与蛋白质分别在OD260和OD280有吸收峰分别测定之，比较OD260/OD280比值在1.8附近程度估计纯度，依据经验公式计算DNA含量。三、实验材料与试剂物品三、实验材料与试剂物品 1.材料 香椿（香椿（Toona sinensis）黄花苗）黄花苗2、试剂 提取缓冲液（预冷）提取缓冲液（预冷）SSC RNase液液3、仪器设备 高速冷冻离心机（8-316）制冰机（8-312）紫外可见分光计（8-316）冰箱（-86度在8-312，-20度，4度在8-312）水浴锅 电子天平 玻璃仪器等四、实验操作流程 采摘芽苗，洗净剪小段，擦干表面水分放-86度冰箱冻30分钟以上冰浴研磨匀浆（分次加提取液）以下见讲义五、结果与处理五、结果与处理 纯度纯度 含量含量 思考题：影响本实验结果的因素有哪些，要得到高纯度的DNA需要在实验中注意哪些问题？实验二、大肠杆菌质粒实验二、大肠杆菌质粒DNADNA的提取的提取1.目的与要求 通过质粒的一些特性、质粒DNA的提取、测定，学习用碱变性法提取质粒DNA的方法，了解用分光光度计测定DNA含量的方法。2.相关知识及原理质粒质粒(Plasmid)(Plasmid)：独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。是一种环状的双链因子。是一种环状的双链DNADNA分子。分子。存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。在细菌细胞中最多。DNA超螺旋结构超螺旋结构常用的质粒载体 是通过是通过DNADNA重组技术构建而成的。重组技术构建而成的。pUC18,pUC19(500pUC18,pUC19(500700700pUC192686 bpAPrALPHAP(BLA)P(LAC)ORIAvaI(413)BamHI(418)EcoRI(397)HindIII(448)PstI(440)SmaI(415)XmaI(413)ApaLI(178)ApaLI(1121)ApaLI(2367)细菌质粒细菌质粒:细菌质粒是用的最多的质粒类细菌质粒是用的最多的质粒类群，其大小从群，其大小从1Kb-200Kb，它们复，它们复制时利用宿主细胞复制自身基因组制时利用宿主细胞复制自身基因组DNA的同一组酶系。的同一组酶系。严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝；往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝；松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝，份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成才会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒才会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。才能达到更高拷贝数。质粒类型质粒类型：载体载体(Vector)(Vector)：用于携带重组用于携带重组DNADNA，并且能够使外源，并且能够使外源DNADNA一起复制一起复制与表达的质粒与表达的质粒(运载工具运载工具)。具备的条件：具备的条件：易于鉴定；易于鉴定；在受体细胞中可以独立复制；在受体细胞中可以独立复制；易于筛选；易于筛选；易于导入受体细胞。易于导入受体细胞。InsertEcoRIXhoI1.9kb1.1.抗性基因（抗性基因（Antibiotic resistance Antibiotic resistance gene,such as Ampicillin gene,such as Ampicillin resistance gene,Kanamycine resistance gene,Kanamycine resistance gene)resistance gene)2.2.启始复制子（启始复制子（oriori,Origin of,Origin of replication)replication)；3.3.多克隆位点多克隆位点(MSC,Multiple cloning(MSC,Multiple cloning site or polylinker)site or polylinker)；4.4.标记基因标记基因(Marker gene,such as(Marker gene,such as LacZ gene)LacZ gene)。载体的结构：载体的结构：AmpAmpr r抗性基因抗性基因AmpAmpr r抗性基因编码一种周质酶（抗性基因编码一种周质酶（-内酰胺酶）可特异地内酰胺酶）可特异地切割切割AmpAmp的的-内酰胺环，从而使其失去杀菌能力内酰胺环，从而使其失去杀菌能力pUC192686 bpAPrALPHAP(BLA)P(LAC)ORIAvaI(413)BamHI(418)EcoRI(397)HindIII(448)PstI(440)SmaI(415)XmaI(413)ApaLI(178)ApaLI(1121)ApaLI(2367)二、实验原理二、实验原理 碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异来分离它们，在碱性拓扑学上的差异来分离它们，在碱性P PH H，DNADNA变性，恢复变性，恢复中性时，线性染色体中性时，线性染色体DNADNA不能准确复性，与其它大分子不能准确复性，与其它大分子共沉淀，而质粒共沉淀，而质粒DNADNA却可以准确复性，留在上清中。却可以准确复性，留在上清中。碱性下，变性蛋白是可溶的，酸性、中性下变性蛋白不碱性下，变性蛋白是可溶的，酸性、中性下变性蛋白不溶而沉淀。几乎所有纯化质粒的方法都用到质粒溶而沉淀。几乎所有纯化质粒的方法都用到质粒DNADNA分分子相对较小和共价闭合环状这两个特性。由于操作原因子相对较小和共价闭合环状这两个特性。由于操作原因提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋。提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋。DNA DNA 是具有一定结构的物质，一些特殊的环是具有一定结构的物质，一些特殊的环境会导致境会导致DNADNA的变性，如加热、极端的变性，如加热、极端pHpH值、值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等，而适宜的环有机溶剂、尿素、酰胺试剂等，而适宜的环境又可以使境又可以使DNADNA复性。复性。SDSSDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以裂解，又能使一些蛋白质变性，所以SDSSDS处理细菌处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNADNA以及基因组以及基因组DNADNA从细胞中同时释放出来。释放从细胞中同时释放出来。释放出来的出来的DNADNA遇到强碱性（遇到强碱性（NaOHNaOH）环境，就会变性。）环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒性，质粒DNADNA将迅速复性，而基因组将迅速复性，而基因组DNADNA，由于分，由于分子巨大，难以复性。离心后，质粒子巨大，难以复性。离心后，质粒DNADNA将在上清中，将在上清中，而基因组而基因组DNADNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒部。通过这种方法即可将质粒DNADNA从细菌中提取出从细菌中提取出来。来。细菌裂解的方法：碱裂解法：0.2molNaOH+1%SDS 煮沸裂解法:沸水煮沸40秒 SDS裂解法：10%SDS,一般用于质粒大量提取。提纯的思路提纯的思路 质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量DNADNA 要去除的物质：要去除的物质：蛋白蛋白基因组基因组DNADNA脂类及小分子杂质脂类及小分子杂质RNA RNA 测定测定DNADNA浓度的方法主要有两种，即利用分浓度的方法主要有两种，即利用分光光度计法测定光光度计法测定DNADNA的紫外光吸收值；第二的紫外光吸收值；第二种方法是测定样品中溴化乙锭发射的荧光的种方法是测定样品中溴化乙锭发射的荧光的强度来计算核酸的含量。另外还有一种用于强度来计算核酸的含量。另外还有一种用于粗略检测粗略检测DNADNA浓度的方法是通过凝胶电泳，浓度的方法是通过凝胶电泳，与标准分子量相比较。与标准分子量相比较。DNADNA浓度的测定浓度的测定：紫外光吸收法：紫外光吸收法：因为组成核酸的碱基因为组成核酸的碱基(G,A,T,C(G,A,T,C）在）在260nm260nm处处具有强吸收峰，所以通过测定具有强吸收峰，所以通过测定260nm260nm的吸收的吸收峰即可对峰即可对DNADNA进行定量。但有时也会因为所进行定量。但有时也会因为所处溶液的处溶液的pHpH值不同而导致吸光系数的不同。值不同而导致吸光系数的不同。因此，一般在中性因此，一般在中性pHpH值左右的环境中进行值左右的环境中进行测定。这种方法常用于测定比较纯的样品。测定。这种方法常用于测定比较纯的样品。3.材料与试剂材料与试剂材料材料:含有质粒大肠杆菌含有质粒大肠杆菌JM83+。三、实验仪器、材料与试剂三、实验仪器、材料与试剂（一）仪器：恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅一）仪器：恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅（二）材料：（二）材料：含有质粒含有质粒的的大肠杆菌大肠杆菌JM83+、LBLB液体培养基液体培养基（三）试剂：（三）试剂：溶液溶液I I作用：分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活作用：分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活溶液溶液IIII作用：细胞壁肽聚糖碱性下水解，核酸和蛋白质变性。作用：细胞壁肽聚糖碱性下水解，核酸和蛋白质变性。溶液溶液IIIIII作用：酸性下质粒作用：酸性下质粒DNADNA复性，变性蛋白复性，变性蛋白SDSSDS线性线性DNADNA沉淀，沉淀，K K可中和可中和DNADNA溶液溶液1GET缓冲液：缓冲液：50mmol/L葡萄糖，葡萄糖，10mmol/L EDTA，25mMTris-HCl pH8.0。溶液溶液20.2mol/L NaOH,1%SDS溶液溶液3乙酸钾溶液乙酸钾溶液(3M,pH=4.8)：60mL的的5mol/L KAc,11.5ml冰醋酸，冰醋酸，28.5mL H2OTE缓冲液或水（缓冲液或水（+20 g/ml RNase）:10mmol/L，Tris-HCl,1mmol/L，EDTA，pH8.0,100%乙醇，乙醇，70乙醇乙醇平衡酚：氯仿：异戊醇（平衡酚：氯仿：异戊醇（2525：2424：1 1）作用：氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机作用：氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离。平衡酚相的分离。平衡酚pH7.8pH7.8（酸性下（酸性下DNADNA分配于有机分配于有机相，酚的密度大），可使相，酚的密度大），可使DNADNA在上清中。异戊醇在上清中。异戊醇有助于消除抽提过程中出现的泡沫）有助于消除抽提过程中出现的泡沫）注：用时取下层液，酚腐蚀性强，可引起灼伤。注：用时取下层液，酚腐蚀性强，可引起灼伤。无水乙醇：除去无水乙醇：除去DNADNA水化层，使水化层，使DNADNA沉淀沉淀TETE缓冲液：溶解缓冲液：溶解DNADNA四、实验步骤四、实验步骤接含质粒的单菌落于接含质粒的单菌落于3ml LB Amp3ml LB Amp+液体培养基中液体培养基中37370 0C C，190rpm190rpm振荡培养过夜振荡培养过夜取取1.5菌液入菌液入1.5ml的的dorf管中管中 6000rpm6000rpm、离心、离心2min2min，弃上清，收集菌体，弃上清，收集菌体100uL100uL溶液溶液I I悬浮菌体（充分振荡），室温（或冰浴）悬浮菌体（充分振荡），室温（或冰浴）10min10min加入加入200uL200uL溶液溶液IIII（轻轻混匀轻轻混匀），冰上静置），冰上静置5min5min裂解菌体裂解菌体加入加入150uL150uL溶液溶液IIIIII（轻轻混匀轻轻混匀），冰上静置），冰上静置15min15min质粒质粒DNADNA复性复性12000rpm12000rpm，离心，离心15min15min，取上清记录体积到一新管，取上清记录体积到一新管上清加等体积的酚：氯仿：异戊醇（上清加等体积的酚：氯仿：异戊醇（振荡混匀振荡混匀）12000rpm12000rpm，离心，离心15min15min，取上清记录体积到一新管，取上清记录体积到一新管（可省略）上清加等体积的氯仿：异戊醇（可省略）上清加等体积的氯仿：异戊醇（振荡混匀振荡混匀）12000rpm12000rpm，离心，离心15min15min，取上清记录体积到一新管，取上清记录体积到一新管上清加上清加2 2倍体积的无水乙醇（充分混匀），冰浴倍体积的无水乙醇（充分混匀），冰浴 30min 30min12000rpm12000rpm，离心，离心15min15min沉淀用沉淀用75%75%乙醇乙醇1mL1mL洗涤两次（振荡混匀、离心）洗涤两次（振荡混匀、离心）12000rpm12000rpm，离心，离心10min10min沉淀超净台中风干沉淀超净台中风干沉淀用沉淀用20uL RTE20uL RTE溶解，溶解，-20-200 0C C保存保存注意：注意：用移液器操作时，每一步都要格用移液器操作时，每一步都要格外小心，特别是在加入溶液外小心，特别是在加入溶液II II 和和IIIIII后，一定不要剧烈振荡，以免后，一定不要剧烈振荡，以免切碎切碎DNA(DNA(包括质粒包括质粒DNADNA和基因组和基因组DNA)DNA)！1.培养细菌：将带有质粒的大肠杆菌接种到培养细菌：将带有质粒的大肠杆菌接种到1.5-3ml含有相应抗生素的液体培养基，含有相应抗生素的液体培养基，37培养培养1216小时小时;2.取液体培养液取液体培养液1.5-2ml于于Eppendorf管中，管中，10000r/min离心离心1min，去掉上清液，加入，去掉上清液，加入100 l溶液溶液1(GET)，充分混匀放置，充分混匀放置3-5分钟分钟;3.加入加入200 l新配制的新配制的0.2mol/L NaOH+1SDS（变性液），加盖颠倒（变性液），加盖颠倒6-7次使之混匀，冰上次使之混匀，冰上放置放置5min;质粒小量提取的方法（手工提取）：质粒小量提取的方法（手工提取）：4.加入加入150 l乙酸钾溶液乙酸钾溶液(溶液溶液II)，加盖后颠倒，加盖后颠倒6-7次混匀，次混匀，冰上放置5min;5.用冷冻高速离心机，用冷冻高速离心机，10000r/min离心离心7min，上，上清移入另一干净离心管，并加清移入另一干净离心管，并加1ml 100乙醇混乙醇混匀，匀，12000r/min离心离心5min，弃去上清液，弃去上清液;6.沉淀用沉淀用0.5ml 70乙醇清洗一次，乙醇清洗一次，12000r/min离心离心5min，弃去上清液，小管倒置于吸水纸上，弃去上清液，小管倒置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥，除尽乙醇，室温自然干燥;7.加入加入30-50 l含有含有20 g/ml RNase的灭菌蒸馏水的灭菌蒸馏水或或TE 缓冲液溶解提取物，室温放置缓冲液溶解提取物，室温放置15-30min，使，使DNA充分溶解充分溶解(有时需要酚有时需要酚:氯仿抽提氯仿抽提);8.将分离出的质粒将分离出的质粒DNA置于置于-20保存备用。保存备用。B.用分光光度计法定量用分光光度计法定量DNA1.取取2 l提取的质粒提取的质粒DNA，加入，加入98 l蒸蒸馏水对待测馏水对待测DNA样品做样品做1:50(或更高或更高倍数的稀释倍数的稀释);2.蒸馏水作为空白蒸馏水作为空白,在波长在波长260nm、280nm处调节紫外分光光度计读数处调节紫外分光光度计读数至零。至零。3.加入加入DNA稀释液，测定稀释液，测定260nm 及及280nm的吸收值。的吸收值。260nm 读数用于计算样品中读数用于计算样品中核酸的浓度，核酸的浓度，OD260值为值为1相当于约相当于约50 g/ml双链双链DNA，33 g/ml单链。可根据在单链。可根据在260nm以及在以及在280nm的读数的比值的读数的比值（OD260/OD280）估计核酸的纯度。一般）估计核酸的纯度。一般DNA的纯品，其比值为的纯品，其比值为1.8，低于此值说，低于此值说明有蛋白质或其它杂质的污染。明有蛋白质或其它杂质的污染。4.记录记录OD值，通过计算确定值，通过计算确定DNA浓浓度或纯度，公式如下度或纯度，公式如下:dsDNA=50(OD260)稀释倍数稀释倍数以上浓度单位为以上浓度单位为 g/ml实验三、琼脂糖凝胶电泳实验三、琼脂糖凝胶电泳pUC192686 bpAPrALPHAP(BLA)P(LAC)ORIAvaI(413)BamHI(418)EcoRI(397)HindIII(448)PstI(440)SmaI(415)XmaI(413)ApaLI(178)ApaLI(1121)ApaLI(2367)一、实验目的一、实验目的 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNADNA的方法和技术。的方法和技术。二、实验原理二、实验原理 DNADNA在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。核酸为两性分子，在核酸为两性分子，在PH3.5PH3.5时，整个分子带正电；时，整个分子带正电；P PH8H8左右时，碱基几乎不解离，整个分子带负电。左右时，碱基几乎不解离，整个分子带负电。在碱性环境下，相同碱基数量的双链在碱性环境下，相同碱基数量的双链DNADNA几乎具有等量几乎具有等量的净负电荷，能以同样的速度向正极方向移动。具有的净负电荷，能以同样的速度向正极方向移动。具有不同的相对分子质量的不同的相对分子质量的DNADNA片段泳动速度不一样，可进片段泳动速度不一样，可进行分离。行分离。DNADNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，可以近似用于估算分子的大小。成反比关系，可以近似用于估算分子的大小。可以分离相对分子质量相同，但构型不同的可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNADNA分子。分子。共价闭环超螺旋共价闭环超螺旋DNADNA（cccDNAcccDNA）直线）直线DNADNA（LDNALDNA，2 2条条链发生断裂）开环的双链环状链发生断裂）开环的双链环状DNADNA（ocDNAocDNA，1 1条链发条链发生断裂）。生断裂）。三、仪器、材料与试剂仪器、材料与试剂（一）（一）仪器仪器（二）材料（二）材料1.1.自已提取的质粒自已提取的质粒DNADNA2.2.相对分子质量标准品相对分子质量标准品（三）试剂（三）试剂 1 15 5 TBE TBE储液储液(P PH8.0)H8.0)使用时稀释使用时稀释 10 10倍成倍成0.50.5TBE TBE（1 1TBETBE也可）。也可）。2 2凝胶加样缓冲液凝胶加样缓冲液0.2%0.2%溴酚蓝，溴酚蓝，50%50%蔗糖蔗糖 3.3.琼脂糖琼脂糖 4.10mg/ml 4.10mg/ml溴化乙锭溶液（溴化乙锭溶液（EBEB），），44保存。用时保存。用时稀释成稀释成5ug/ml5ug/ml的的EBEB。四、实验操作步骤四、实验操作步骤 琼脂糖凝胶的制备（配制浓度依照所提质粒的大琼脂糖凝胶的制备（配制浓度依照所提质粒的大小来确定）小来确定）.凝胶板的制备凝胶板的制备 加样（加样体积在加样（加样体积在1010 30ul30ul）电泳电泳 染色染色 结果观察结果观察 C.C.凝胶电泳检测凝胶电泳检测DNADNA的浓度的浓度0.8%0.8%的琼脂糖凝胶，的琼脂糖凝胶，100V,40100V,40分钟。分钟。NEB NEB 标准分子量片段标准分子量片段(1kb DNA Ladder)(1kb DNA Ladder)1 kb DNA Ladder1 kb DNA Ladder虽然不能虽然不能对对DNADNA质量进行精确定量分质量进行精确定量分析，但可以通过与相近的析，但可以通过与相近的条带进行比较估算出大概条带进行比较估算出大概的数据。每条带大概的量的数据。每条带大概的量如下（按如下（按0.5g0.5g上样量计。上样量计。应按应按1313条带计算，因为条带计算，因为3kb3kb的量是其它片段量的近三的量是其它片段量的近三倍）：倍）：片段碱基对质量110,00242 ng28,00142 ng36,00150 ng45,00142 ng54,00133 ng63,001125 ng72,00048 ng81,50036 ng91,00042 ng10a51742 ng*10b50042 ng*0.5kb 的条带由的条带由500bp和和517bp组组成，这样即使在低分子量区域条成，这样即使在低分子量区域条带的强度也比较均一。带的强度也比较均一。相关知识相关知识 电泳：泳动速度决定于？电泳：泳动速度决定于？琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶天然琼脂（天然琼脂（AgarAgar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（Agarose Agarose，约占，约占8080）及琼脂胶（）及琼脂胶（AgaropectinAgaropectin）组）组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性不带电荷。而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。琼脂糖透明无紫外吸收影响电泳速度及分离效果。琼脂糖透明无紫外吸收，因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系琼脂糖浓度 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0线状DNA大小/kb 5-601-200.8-100.5-70.4-60.2-40.1-3核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系 不同构型不同构型DNADNA的移动速度次序为：共价闭环超螺旋的移动速度次序为：共价闭环超螺旋DNADNA（cccDNAcccDNA）直线）直线DNADNA（LDNALDNA，2 2条链发生断裂）条链发生断裂）开环的双链环状开环的双链环状DNADNA（ocDNAocDNA，1 1条链发生断裂）条链发生断裂）。影响迁移率的因素影响迁移率的因素 DNADNA分子的大小、琼脂糖凝胶的浓度、分子的大小、琼脂糖凝胶的浓度、DNADNA的构象、所加电的构象、所加电压压 一般一般5V/cm5V/cm、电场方向、嵌入染料的存在、电泳缓冲、电场方向、嵌入染料的存在、电泳缓冲液的组成。液的组成。常用染料常用染料 EB:EB:溴化乙锭（溴化乙锭（3 3，8-8-二氨基二氨基-5-5-乙基乙基-6-6-苯基菲啶溴盐苯基菲啶溴盐EthidiumEthidiumBromideBromide，EBEB），），EBEB能插入能插入DNADNA分子碱基对之分子碱基对之间，导致间，导致EBEB与与DNADNA结合。结合。DNADNA吸收的吸收的260nm260nm的紫外光传递给的紫外光传递给EBEB，或者结合的，或者结合的EBEB本身在本身在300300和和360360吸收的射线，均可在吸收的射线，均可在可见光区以可见光区以590590波长发射出来，呈橙红色。波长发射出来，呈橙红色。EBEB染料优点：染色操作简便，快速，室温下染料优点：染色操作简便，快速，室温下15-20min15-20min；不会使核酸断裂；灵敏度高，不会使核酸断裂；灵敏度高，10ng10ng或更少的或更少的DNADNA即可检出；即可检出；可以加到样品中可胶中。可以加到样品中可胶中。EBEB是诱变剂，使用时一定要戴手套。是诱变剂，使用时一定要戴手套。EB EB废液要经过处理废液要经过处理才能丢弃。才能丢弃。SYBR:SYBR:新型低毒，高灵敏度染料，加入样新型低毒，高灵敏度染料，加入样 品中，价格较品中，价格较昂贵。昂贵。五、实验结果与讨论五、实验结果与讨论 根据观察结果，绘图。根据观察结果，绘图。分析自提质粒的情况。分析自提质粒的情况。实验四、的限制性酶切实验四、的限制性酶切 一实验目的及背景一实验目的及背景 核酸限制性内切酶是一类能识别双链中特定碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中发现，它们的功能犹似高等动物的免疫系统，用于抗击外来的侵袭。限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的片段端为，端为。限制酶的类型 根据限制酶的识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性可分为、型三大类。类和类限制性内切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依赖ATP的限制性内切酶活性。类限制性内切酶结合于特定识别位点，且没有特定的切割位点，酶对其识别位点进行随机切割，很难形成稳定的特异性切割末端。类限制性内切酶在识别位点上切割，然后从底物上解离下来。故类和类酶在基因工程中基本不用。型酶 型酶就是通常指的限制性内切酶.它们能识别双链的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异的片段；型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识别顺序一般为个碱基对的反转重复顺序；型内切酶切割双链产生种不同的切口端突出；端突出和平末端。正是得益于限制性的内切酶的发现和应用，才使得人们能在体外有目的地对遗传物质进行改造，从而极大地推动了分子生物学的兴旺和发展。酶切反应中应注意以下几个问题：内切酶：不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的污染；注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端；内切酶的用量 根据内切酶单位和用量而定，通常 1u指在适当条件下，1小时内完全酶解ug特定底物所需要的限制性内切酶量，使用中一般以ug DNA对u酶短时间为宜。同时内切酶体积不能超过反应体系，因内切酶中含甘油，体系中甘油超过会抑制内切酶活力；使用时防止操作中对内切酶的污染。：作为内切酶底物，应该具备一定的纯度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、SDS、EDTA、高盐浓度、酒精等，这些因素的存在均不同程度影响限制性内切酶的活力。这种抑制可通过：增加酶作用单位数（1020U/ug DNA）、增大反应体积以稀释可能的抑制剂 或延长反应时间加以克服。反应缓冲液：反应缓冲液主要由TrisHCl、NaCl、Mg2+组成，其中Mg2+为内切酶辅基；TrisHCl维持反应体系pH值在7.2-7.6之间；NaCl浓度不同形成种级别的离子强度：低盐（10mM NaCl)中盐（50mM NaCl）高盐（100mM NaCl）不同的内切酶选择特定的反应缓冲液。酶解温度与时间：大多数限制酶反应温度为，如EcoR,Hind,BamH,Pst等，也有如Bcl需在下进行反应，反应时间根据酶的单位与用量之比来定，原则是酶：=：小时即可，充分酶解。二、实验试剂二、实验试剂 限制性内切酶（和质粒）buffer:50mM Tris HCl pH7.5 100mM NaCl 10mM MgCl2 无菌水三实验方法三实验方法 按下表分别加入各试剂（注意限制性内切酶最后加入且在冰上操作）于Eppendorf管中。DNA 10buffer 2l 无菌水 20l 内切酶 2 总体积：25l 将反应体系充分混匀，并于台式离心机上短暂离心。Eppendorf管封上封口膜于水管中反应1小时。反应结束后加入4l的10XLoading buffer以终止反应。混匀后0.8琼脂糖凝胶上60伏电泳小时。紫外透射仪上检查实验结果。四结果与分析四结果与分析记录紫外透射仪上观察到的结果。记录紫外透射仪上观察到的结果。分析实验结果的成因。分析实验结果的成因。问题与讨论：问题与讨论：在整个酶切反应过程中应注意哪些问题？在整个酶切反应过程中应注意哪些问题？如何选择和限制性内切酶的用量？如何选择和限制性内切酶的用量？反应体系中为何内切酶用量不能超过整个反应体系反应体系中为何内切酶用量不能超过整个反应体系的？的？实验五、实验五、大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌感受态细胞的制备 及外源及外源DNA的转化的转化实验目的实验目的 1.了解转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。2.学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。3.学习将外源质粒 DNA 转入受体菌细胞并筛选转化体的方法。实验原理实验原理 转化(Transformation)是将异源 DNA 分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究的基本实验技术。转化中的受体细胞 转化过程所用的受体细胞一般是限制性修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，常用 RM 符号表示。转化方法：电击法、CaCl2、RuCl等化学试剂法 感受态细胞处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源 DNA 分子通过时细胞的状态。转化细胞(转化子)：带有异源 DNA 分子的受体细胞(Transformant)。实验原理实验原理实验原理实验原理 本实验以本实验以 E.coli JM83-E.coli JM83-菌株为受体细胞，用菌株为受体细胞，用 CaClCaCl2 2 处理受体菌使其处于为感受态，然后与处理受体菌使其处于为感受态，然后与 质粒共保温，实现转化。质粒共保温，实现转化。因质粒携带有抗氨因质粒携带有抗氨苄青霉素的基因，因而使接受了该质粒的受体苄青霉素的基因，因而使接受了该质粒的受体菌具有抗氨苄青霉的特性，用菌具有抗氨苄青霉的特性，用 Ap Apr r符号表示。符号表示。将经过转化后的全部受体细胞经过适应稀释，将经过转化后的全部受体细胞经过适应稀释，在含氨苄青霉素的平板培养基上培养，只有转在含氨苄青霉素的平板培养基上培养，只有转化体才能存活，而未受转化的受体细胞则因无化体才能存活，而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨苄青霉素的能力而死亡。抵抗氨苄青霉素的能力而死亡。影响转化率的因素 细胞生长状态和密度。转化的质粒 DNA 的质量和浓度。试剂的质量。防止杂菌和其它外源 DNA 的污染。实验仪器实验仪器 实验试剂实验试剂v 大肠杆菌JM83-v LB培养基，v 0.1mol/LCaCl2溶液（预冷）v 氨苄青霉素v JM83+质粒 实验步骤 菌株活化 感受态细胞制备 外源DNA的转化实验步骤实验步骤 菌株活化1用接种环直接取冻存的大肠杆菌JM83-，在LB培养基平板表面划线，于37培养16小时2挑取一个单菌落，转到35mlLB培养基中，于37培养35小时3将培养液全部转到100mlLB培养基中培养23小时，到OD6000.30.4实验步骤实验步骤 感受态细胞制备4将培养液转入1.5ml离心管中，在冰上放置1530min54000rpm离心5min,弃上清6加入0.8ml预冷的0.1mol/l CaCl2,悬浮沉淀，冰上预冷10min74000rpm离心5 min,弃上清8加入0.2ml预冷的0.1mol/l CaCl2,悬浮沉淀，即可使用。也可加入总体积15的甘油 在70长期保存实验步骤实验步骤 转化9、取目的DNA加入大肠杆菌感受态细胞中，于冰上放置30min10、于42水浴90S11、冰上放置2min12、加入800lLB液体培养基于37培养1小时13、将培养液均匀涂布在含Amp+的培养基平板上14、将平板放置于37恒温培养箱中培养12-14个小时，然后观察结果对照组对照组 对照组对照组1:1:以同体积的无菌双蒸水代替以同体积的无菌双蒸水代替DNADNA溶液溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的下在含抗生素的LBLB平板上应没有菌落出现。平板上应没有菌落出现。对照组对照组2:2:以同体积的无菌双蒸水代替以同体积的无菌双蒸水代替DNADNA溶液溶液,但涂板时只取但涂板时只取5l 5l 菌液涂布于不含抗菌液涂布于不含抗生素的生素的LBLB平板上，此组正常情况下应产生大平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。量菌落。转化率统计每个培养皿中的菌落数。统计每个培养皿中的菌落数。转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：转化子总数菌落数转化子总数菌落数稀释倍数稀释倍数转化反应原液总体积转化反应原液总体积涂板菌液体积涂板菌液体积 转化频率（转化子数每转化频率（转化子数每mgmg质粒质粒DNADNA）转化子总数质）转化子总数质粒粒DNADNA加入量加入量(mg)(mg)感受态细胞总数对照组菌落数感受态细胞总数对照组菌落数稀释倍数稀释倍数菌液总体菌液总体积涂板菌液体积积涂板菌液体积 感受态细胞转化效率转化子总数感受态细胞总数感受态细胞转化效率转化子总数感受态细胞总数 实验结果实验结果实验报告实验报告 写明实验目的、实验原理、仪器、材料与写明实验目的、实验原理、仪器、材料与试剂试剂 详细列出实验步骤；详细列出实验步骤；画出实验结果的示意图并做分析，计算转画出实验结果的示意图并做分析，计算转化效率。化效率。实验六 PCR基因扩增技术实验目的 通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。实验原理 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。在待扩增的DNA片断两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。PCR技术的原理 1.变性：在加热或碱性条件下可使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA，称之为变性。2.退火：是模板与引物的复性。引物是与模板某区序列互补的一小段DNA片段。3.延伸：从结合在特定DNA模板上的引物为出发点，将四种脱氧核苷酸以碱基配对形式按53的方向沿着模板顺序合成新的DNA链。ParameterConcentrationTemplatepHdNTPsGelatinPrimersMg2+oncentrationEnzymeTotal volume10 attomoles(1106 molecules)8.4（10mM Tris-Hcl）200 M(each one)100 g/ml(optional)0.5 M(each one);(0.11.0M)0.5mM 10mM1 unit25100l实验仪器电泳仪电泳仪PCR仪仪移液器移液器实验材料 1、DNA模板 2、4种dNTP 3、引物1、引物2 4、Taq酶 5、琼脂糖 6、DNA相对分子质量标准物 7、吸头、50ul PCR管试剂 10PCR缓冲液(含Mg2)4dNTP(每种1mmol)Taq酶 1U/ul DNA模板 引物1:5-GGGGAATTCATGGTGAGCAAGGGC-3 引物2:5-GACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGC-3 引物溶液浓度 10pmol/ul实验步骤 1在0.5ml RCR管内配置20ul反应体系：CK(ul)1#(ul)模板01引物10.40.4引物20.40.410 PCR Buffer22Taq酶0.50.5dNTPs0.40.4ddH2O14.315.3Total2020PCR反应程序反应程序实验报告 要求：1、写出本实验目的、原理；2、实验器材及实验步骤；3、列出实验结果示意图并分析原因。实验结果PCR结果。1、对照(无模板)；26、PCR产物（5ul样品）谢谢观看/欢迎下载BY FAITH I MEAN A VISION OF GOOD ONE CHERISHES AND THE ENTHUSIASM THAT PUSHES ONE TO SEEK ITS FULFILLMENT REGARDLESS OF OBSTACLES.BY FAITH I BY FAITH