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第二节第二节 培养基及配制培养基及配制一一 培养基的成分培养基的成分 *培养基的种类培养基的种类 *培养基的成分培养基的成分 *培养基的配制培养基的配制（一）培养基的种类一）培养基的种类按性质分按性质分:基本培养基基本培养基-MSMS、MTMT、WhiteWhite等等 完全培养基完全培养基-基本培养基基本培养基+其它成分其它成分按状态分按状态分:固体培养基固体培养基-培养材料与培养基接触不充分、有毒培养材料与培养基接触不充分、有毒物质、容易积累、污染局部、通气好物质、容易积累、污染局部、通气好 液体培养基液体培养基-培养材料与培养基接触充分、有毒物培养材料与培养基接触充分、有毒物质不容易积累、污染全部、通气不好质不容易积累、污染全部、通气不好(二二)培养基的成分培养基的成分*无机盐（大量元素、微量元素）无机盐（大量元素、微量元素）*激素激素 *有机物质有机物质 *琼脂琼脂 *碳源碳源 *水水 用于植物细胞工程的培养基应含有植物细胞、组织生长所用于植物细胞工程的培养基应含有植物细胞、组织生长所必需的各种营养成分，以满足植物正常生长发育的需要。必需的各种营养成分，以满足植物正常生长发育的需要。1 1、大量元素、大量元素(C(C、H H、O O、N N、P P、S S、K K、CaCa、MgMg、ClCl)N N：通常是指硝态氮或铵态氮，而培养过程中常以硝态氮满足培养物对氮素的需：通常是指硝态氮或铵态氮，而培养过程中常以硝态氮满足培养物对氮素的需要；或两者混合使用；有时以硝态氮为主，添加铵态氮满足酸性植物生长的需要；要；或两者混合使用；有时以硝态氮为主，添加铵态氮满足酸性植物生长的需要；它不仅是植物生长必需，也是胚胎发生的必需因素之一；它不仅是植物生长必需，也是胚胎发生的必需因素之一；CaCa：细胞壁稳定：细胞壁稳定MgMg：酶及辅酶的成分：酶及辅酶的成分P P：参与蛋白质和核酸的合成、光合作用等：参与蛋白质和核酸的合成、光合作用等 2 2、微量元素、微量元素(Fe(Fe、MnMn、B B、ZnZn、CuCu、MoMo、Co)Co)用量少用量少(过多容易导致中毒过多容易导致中毒)；一般浓度为；一般浓度为1010-5-51010-7-7mol.Lmol.L-1-1 ；当某种营养元素缺乏时，细胞或组织培养所获得的植株表现出营养缺乏症。当某种营养元素缺乏时，细胞或组织培养所获得的植株表现出营养缺乏症。3 3、激素、激素 是培养基中不可缺少的关键物质，用量虽然少，但对愈伤是培养基中不可缺少的关键物质，用量虽然少，但对愈伤 组组织的诱导和器官分化起重要且明显的调节作用织的诱导和器官分化起重要且明显的调节作用；（1 1）细胞分裂素）细胞分裂素作用：作用：促进细胞分裂、器官分化、延缓器官衰老、增强蛋白质合成；抑制顶端优促进细胞分裂、器官分化、延缓器官衰老、增强蛋白质合成；抑制顶端优势势,促进侧芽生长促进侧芽生长,显著改善其他激素的作用显著改善其他激素的作用;种类：种类：6-BA（6-苄基氨基腺嘌呤苄基氨基腺嘌呤）KT（激动素）（激动素）ZT（玉米素）（玉米素）2-iP（2-异戊烯基腺嘌呤异戊烯基腺嘌呤）TDZ（噻重氮苯基脲）（噻重氮苯基脲）CPPU（吡效隆）（吡效隆）作用强弱作用强弱：TDZCPPU2-iP 6-BA KT（2）生长素）生长素作用：作用：愈伤组织的形成、胚状体的产生和根的分化；更重要的是配合一定比例的愈伤组织的形成、胚状体的产生和根的分化；更重要的是配合一定比例的细胞分裂素诱导腋芽及不定根的产生；细胞分裂素诱导腋芽及不定根的产生；种类：种类：IBAIBA（吲哚丁酸（吲哚丁酸 ）IAAIAA（吲哚乙酸（吲哚乙酸 ）NAANAA（萘乙酸（萘乙酸 ）2,4-D2,4-D（2 2，4-4-二氯苯氧乙酸二氯苯氧乙酸 ）作用强弱比较作用强弱比较：2,4-D 2,4-D NAA IBA IAANAA IBA IAA使用注意问题：使用注意问题：不同的生长素，在作用强弱方面有所差异，在作用效果方面也不同的生长素，在作用强弱方面有所差异，在作用效果方面也有不同；同一生长素对不同种类的植物的作用也不同，因此，在具体使用过程中，有不同；同一生长素对不同种类的植物的作用也不同，因此，在具体使用过程中，一定要注意；一定要注意；（3 3）其它生长调节物质）其它生长调节物质作用：抑制愈伤组织形成，促进芽的形成作用：抑制愈伤组织形成，促进芽的形成种类：种类：赤霉素（赤霉素（GA3 GA3）：打破休眠）：打破休眠 脱落酸（脱落酸（ABAABA）：促进分化）：促进分化 多效唑（多效唑（PP333PP333）：壮苗）：壮苗 细胞分裂素与生长素的比例细胞分裂素与生长素的比例决定形态发生方向决定形态发生方向:比例高时比例高时,细胞分裂素起主要作用，诱导芽的发生；细胞分裂素起主要作用，诱导芽的发生；比例低时比例低时,生长素起主要作用，诱导根的形成。生长素起主要作用，诱导根的形成。4 4、有机物质、有机物质（1 1）碳水化合物）碳水化合物 用来作为碳源，包括糖类、醇类和有机酸。最常采用的碳源用来作为碳源，包括糖类、醇类和有机酸。最常采用的碳源为蔗糖，用量在为蔗糖，用量在1%1%5%5%。为了降低生产成本，在进行相关实验证实。为了降低生产成本，在进行相关实验证实的前提下，也可用砂糖、葡萄糖、果糖代替。的前提下，也可用砂糖、葡萄糖、果糖代替。另外，蔗糖长时间高温处理会发生焦糖化，形成蛋白黑素，另外，蔗糖长时间高温处理会发生焦糖化，形成蛋白黑素，抑制细胞生长。抑制细胞生长。（2 2）维生素）维生素 主要以各种辅酶的形式参与多种代谢活动，对生长、分化有促主要以各种辅酶的形式参与多种代谢活动，对生长、分化有促进作用。进作用。VitVit B B1 1(硫胺素硫胺素)Vit)Vit B B6 6(盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇)Vit Vit B B3 3(烟酸烟酸)VitVit B B5 5(泛酸钙泛酸钙)(以上物质促进细胞对培养基的反应以上物质促进细胞对培养基的反应,一般使用浓度为一般使用浓度为0.11.0mg.L0.11.0mg.L-1-1)肌醇肌醇（环己六醇（环己六醇,有助于活性物质发挥作用有助于活性物质发挥作用,提高提高VitVit B B1 1 的效果的效果,从而促进外植体的生长从而促进外植体的生长,一般使用浓度为一般使用浓度为50100 50100 mg.Lmg.L-1-1）(3)(3)氨基酸氨基酸CH(CH(水解酪蛋白水解酪蛋白)、LHLH(水解乳蛋白水解乳蛋白)（500500 mg.Lmg.L-1-1)：促进胚状体、促进胚状体、不定芽形成不定芽形成GlyGly(甘氨酸甘氨酸)（23 23 mg.Lmg.L-1-1)：促进离体根的生长促进离体根的生长AsnAsn(天冬酰胺天冬酰胺)：有效氮源有效氮源Ser(Ser(丝氨酸丝氨酸)、GlnGln（谷氨酰胺）：（谷氨酰胺）：有利花药胚状体、不定芽分化有利花药胚状体、不定芽分化 氨基酸氨基酸是优良的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。但使用是优良的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。但使用氨基酸极易引起污染，故无特别需要，最好不用。氨基酸极易引起污染，故无特别需要，最好不用。（4 4）、有机附加物）、有机附加物麦芽提取物麦芽提取物（5%5%）、酵母浸出物酵母浸出物（5 5%）、椰子汁（椰乳椰子汁（椰乳1010%）、）、番茄汁番茄汁（5%10%5%10%）香蕉泥香蕉泥（100200100200mg.Lmg.L-1-1)马铃薯（马铃薯（150150200g/L200g/L）酵母提取液（酵母提取液（YEYE）（）（0.010.010.5%0.5%）、）、麦芽提取液麦芽提取液（0.010.010.5%0.5%）-提供微量成分、生理活性物质、生长激素提供微量成分、生理活性物质、生长激素 -缓冲缓冲pHpH值值 由于天然提取物的成分复杂而且不确定，很难保证重复由于天然提取物的成分复杂而且不确定，很难保证重复一致，因此，很多人倾向于选择已知的合成有机物；一致，因此，很多人倾向于选择已知的合成有机物；（5 5）、）、培养材料的支持物培养材料的支持物*琼脂：是固体培养的固化剂。它是从海藻中提取的高分子碳水化琼脂：是固体培养的固化剂。它是从海藻中提取的高分子碳水化合物，本身不提供任何营养。市售的琼脂几乎都含有杂质，特别是合物，本身不提供任何营养。市售的琼脂几乎都含有杂质，特别是CaCa2+2+、MgMg2+2+及其它微量元素。因此在进行植物组织或细胞的营养问及其它微量元素。因此在进行植物组织或细胞的营养问题研究时，应不用琼脂。题研究时，应不用琼脂。*其它。有玻璃纤维、滤纸桥、岩棉、玻璃珠等，但这些物质应对其它。有玻璃纤维、滤纸桥、岩棉、玻璃珠等，但这些物质应对培养材料无影响或影响较小。培养材料无影响或影响较小。（6 6）、）、抗生素抗生素 常用的抗生素有青霉素、链霉素、庆大霉素等，用量在常用的抗生素有青霉素、链霉素、庆大霉素等，用量在5 520 20 毫克毫克/升。添加抗生素可防止污染，减少材料的浪费。但升。添加抗生素可防止污染，减少材料的浪费。但要注意抗生素各有其抑菌谱，同时对外植体生长、分化有一定要注意抗生素各有其抑菌谱，同时对外植体生长、分化有一定影响，应选择使用。影响，应选择使用。（7 7）、）、抗氧化物抗氧化物 植物组织在切割时分泌物，接触空气中的氧气后，自动氧植物组织在切割时分泌物，接触空气中的氧气后，自动氧化或由酶类催化氧化为相应的醌类，产生可见的茶色、褐色以化或由酶类催化氧化为相应的醌类，产生可见的茶色、褐色以至黑色，这就是酚污染，在热带木本及少数草本植物中较为严至黑色，这就是酚污染，在热带木本及少数草本植物中较为严重。减少或去掉酚污染的物质叫抗氧化物。常用的有半胱氨酸、重。减少或去掉酚污染的物质叫抗氧化物。常用的有半胱氨酸、维生素维生素C C、二硫苏糖醇、谷胱甘肽、硫乙醇、二乙基二硫氨基甲、二硫苏糖醇、谷胱甘肽、硫乙醇、二乙基二硫氨基甲酸酯等，使用浓度为酸酯等，使用浓度为5 520 20 毫克毫克/升。升。（8 8）、）、活性炭活性炭 为木炭粉碎经加工形成的粉末结构，具有很强的吸水为木炭粉碎经加工形成的粉末结构，具有很强的吸水力和吸附作用，粒度越小，吸附能力越大。在植物细胞、组织力和吸附作用，粒度越小，吸附能力越大。在植物细胞、组织培养时加入活性炭可以防止褐化，防止玻璃化苗的产生，促进培养时加入活性炭可以防止褐化，防止玻璃化苗的产生，促进生长、分化、生根。但活性炭能吸附生长调节物质和其它培养生长、分化、生根。但活性炭能吸附生长调节物质和其它培养基成分，尤其是当较高浓度的活性炭与常量的生长调节物质同基成分，尤其是当较高浓度的活性炭与常量的生长调节物质同时使用时，活性炭常常抵消生长调节物质的作用。一般使用浓时使用时，活性炭常常抵消生长调节物质的作用。一般使用浓度为度为0.10.10.5%0.5%。作用：作用：（1 1）利用其吸附能力，减少一些有害物质对组织培养的影响。防）利用其吸附能力，减少一些有害物质对组织培养的影响。防止褐化发生；止褐化发生；（2 2）（使培养基变黑）有利于某些植物的生根。）（使培养基变黑）有利于某些植物的生根。（3 3）促进形态发生和器官形成。）促进形态发生和器官形成。弊端：弊端：高浓度的活性碳的（无选择性）吸附作用会吸收植物生长调节高浓度的活性碳的（无选择性）吸附作用会吸收植物生长调节物质；物质；一般使用浓度为一般使用浓度为0.02%1.0%0.02%1.0%，常用为，常用为0.1%0.5%0.1%0.5%；二、培养基的选择和配制二、培养基的选择和配制（一）、水和药品（一）、水和药品1 1、水、水 配制培养基要用蒸馏水，大规模生产时可用纯净水。尽量不用配制培养基要用蒸馏水，大规模生产时可用纯净水。尽量不用自来水，万一要用，要煮沸，并滤去杂质。自来水，万一要用，要煮沸，并滤去杂质。2 2、药品、药品 一定的纯度级别一定的纯度级别 准确称量准确称量 不交叉污染不交叉污染（二）、选择（二）、选择-择材料和种类而异择材料和种类而异-参考前人的研究参考前人的研究MSMS培养基最为基本：培养基最为基本：高浓度的高浓度的N N、K K和和NHNH4 4+-自己试验自己试验（三）、配制顺序（三）、配制顺序配母液配母液取样取样加成分加成分测测pH定容定容加热加热调节调节pH加母液加母液加水加水琼脂琼脂+水水加糖加糖 混合混合加热预溶加热预溶灭菌灭菌玻璃器皿及其他准备玻璃器皿及其他准备冷却冷却接种接种分装分装凝固凝固（四）、母液的配制（四）、母液的配制大量无素大量无素:-浓缩浓缩2020倍（量加大倍（量加大2020倍）倍）-在配制在配制1L1L培养培养基时，只取培养培养基时，只取50ml50ml微量无素微量无素:-浓缩浓缩10001000倍（量加大倍（量加大10001000倍）倍）-在配制在配制1L1L培养培养基时，只取培养培养基时，只取1ml1ml铁盐铁盐:-浓缩浓缩100100倍（量加大倍（量加大100100倍）倍）-在配制在配制1L1L培养培养基时，只取培养培养基时，只取10ml10ml有机元素有机元素:-浓缩浓缩5050倍（量加大倍（量加大5050倍）倍）-在配制在配制1L1L培养培养基时，只取培养培养基时，只取10ml10ml 母液配制过程中，应注意各种化合的组合，以及加入的先后顺母液配制过程中，应注意各种化合的组合，以及加入的先后顺序，以免发生沉淀；通常是把每一种试剂单独溶解后，再混合；序，以免发生沉淀；通常是把每一种试剂单独溶解后，再混合；母液配制后，放在母液配制后，放在24C24C冰箱内短时间存放；冰箱内短时间存放；对于植物生长调节物质，配制成为母液时，通常用对于植物生长调节物质，配制成为母液时，通常用mg/mlmg/ml比较比较方便；一般配制成方便；一般配制成0.51mg/ml0.51mg/ml，既方便计算，也避免冷藏时形成结，既方便计算，也避免冷藏时形成结晶；晶；几种激素的配制方法几种激素的配制方法:细胞分裂素类激素细胞分裂素类激素:一般用一般用0.51mol/L0.51mol/L的盐酸溶解后定容；的盐酸溶解后定容；IAAIAA母液每周制备新鲜备用，容易见光分解（几天内），母液每周制备新鲜备用，容易见光分解（几天内），也容易被植株组织在几小时到几天内分解。生长素也容易被植株组织在几小时到几天内分解。生长素110-120110-120 C C稳稳定保存定保存1 1小时，但小时，但IAAIAA可以被低可以被低pHpH、光、氧和过氧化物破坏。、光、氧和过氧化物破坏。NAANAA和和2,4-D2,4-D比比IAAIAA稳定。稳定。KTKT和和ZTZT在在120120 C C处理处理1 1小时仍能稳定存在，小时仍能稳定存在，BABA在在100100 C C时时2020分分钟。钟。生长素类激素：生长素类激素：先用少量先用少量95%95%的酒精或的酒精或0.1mol/L0.1mol/L的的NaOHNaOH或或KOHKOH溶解，再加水溶解，再加水定容；定容；赤霉素赤霉素:溶于水，溶于水，pH5.7pH5.7但不稳定，用但不稳定，用95%95%的酒精的酒精 在碱性条件下，在碱性条件下，GAGA变成无活性的异构体，在强酸性环境变成无活性的异构体，在强酸性环境和高温下，和高温下，GAGA3 3也变成无活性的形式。也变成无活性的形式。GAGA3 3热不稳定，热不稳定，114114 C C处理处理2020分钟降低其活性达分钟降低其活性达90%90%，母液需制备新鲜的，并且采用过滤，母液需制备新鲜的，并且采用过滤灭菌。灭菌。母液种类母液种类成分成分规定用量规定用量/mg.L-1扩大扩大倍数倍数称取量称取量/mg母液定容母液定容体积体积/ml配配1LMS吸吸取量取量/ml大量元素大量元素KNO3NH4NO3MgSO47H20KH2PO4CaCl22H2O19001650370170440203800033000740034008800100050微量元素微量元素MnSO44H2OZnSO47H2OH3BO3KINa2MoO42H2OCuSO45H2OCoCl26H2O22.38.66.20.830.250.0250.02510002230086006200830250252510001铁盐铁盐Na2-EDTAFeSO47H2O37.327.810037302780100010维生素和维生素和氨基酸氨基酸烟酸烟酸甘氨酸甘氨酸Vit.B1Vit.B6肌醇肌醇0.52.00.10.51005025100525500050010MS培养基母液的配制培养基母液的配制 高压灭菌后的培养基凝固后高压灭菌后的培养基凝固后,宜将培养基放置在培养室中宜将培养基放置在培养室中预培养预培养2323天天,如果没有杂菌污染如果没有杂菌污染,才可以放心使用才可以放心使用;暂时不用的培养基应暂时不用的培养基应放置在放置在10C10C下保存下保存,含有生长调节物质的培含有生长调节物质的培养基在养基在45C45C温度下保存更好温度下保存更好;含有含有吲哚乙酸或赤霉素吲哚乙酸或赤霉素的培养基应该在配制的培养基应该在配制灭菌后灭菌后1 1周内使用周内使用;其他培养基应该在灭菌后其他培养基应该在灭菌后2 2周内使用周内使用;最多不超过最多不超过1 1个月个月;三、常用培养基配方三、常用培养基配方（一）、常见的几种培养基（一）、常见的几种培养基 1 1、MSMS培养基培养基-1962-1962年年MurashigeMurashige和和SkoogSkoog为培养烟草材料而为培养烟草材料而设计设计;与其接近的有与其接近的有LSLS(1965),(1965),RMRM(1964)(1964)2 2、改良怀特培养基改良怀特培养基-1943-1943设计设计,1963,1963改良改良;3 3、B B5 5培养基培养基-1968-1968由由GamborgGamborg设计设计;特别适合与双子叶木本特别适合与双子叶木本植物植物;4 4、N6N6培养基培养基-1974-1974年朱至清为谷物类花药培养设计年朱至清为谷物类花药培养设计;5 5、VWVW培养基培养基-1949-1949年年,Schenk,Schenk和和WentWent设计设计,适合气生兰组织适合气生兰组织培养培养;6 6、SHSH培养基培养基-1972-1972年设计年设计,与与B5B5相似相似;7 7、马铃薯简化培养基、马铃薯简化培养基-适合在条件较差的地方开展工作适合在条件较差的地方开展工作;（二）几种培养基特点（二）几种培养基特点1 1、MSMS培养基：培养基：高浓度的高浓度的N N、K K和和NHNH4 4+2 2、改良怀特培养基：改良怀特培养基：低无机盐浓度低无机盐浓度3 3、B5B5培养基：培养基：含有较低的铵盐含有较低的铵盐4 4、N6N6培养基：培养基：KNOKNO3 3和（和（NHNH4 4）2 2SOSO4 4含量高，不含含量高，不含 钼钼5 5、VWVW培养基：培养基：离子强度较低，适于气生兰组培离子强度较低，适于气生兰组培6 6、SHSH培养基：培养基：不用（不用（NHNH4 4）2 2SOSO4 4而用而用NHNH4 4 H H2 2POPO4 47 7、马铃薯简化培养基：、马铃薯简化培养基：经济适用经济适用
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