紫外分光光度法检测欧李多酚方法的建立

紫外分光光度法检测欧李多酚方法的建立(蔡愈杭 1，王小曼 2，赵 珂 3)(1,2,3 上海东锦食品集团有限公司 上海 201812 )摘 要 以没食子酸为对照品，用 Folin-Ciocalteu 比色法测定三种欧李鲜果中的多酚含量。实 验表明，没食子酸在 050mg/L 范围内，吸收值与浓度呈良好的线性关系，回归方程为 y=0.01381x+0.00487 (R2=0.9995),测定方法的平均回收率为98.86%, RSD 为 0.63%。本实验 建立的方法稳定、可靠，为欧李的开发和检测提供了依据。关键词欧李；多酚；Folin-Ciocalteu试剂；分光光度法Establishment of Ultraviolet Spectroscopy forDetermining Cerasus Humilis polyphenol(CAI Yu Hang1 ,WANG Xiao Man2 ,ZHAO Ke 3)( 1,2,3 Tohkin Food Group Corporation Limited Shanghai 201812 )Abstract Gallic acid was used as a standard material , the total polyphenol content in Cerasus Humilis was analyzed by spectrophotometry with Folin-Ciocalteu reagent. In this method ,the concentration of Gallic acid showed a good linearity with absorbance at the range of 050mg/L, the regression equation was Y = 0.01381X+0.00487, with the correlation coefficient of 0.999 5,the average recovery was 98.86%,and RSD was 0.63%.The method was accurate and reliable, It provided the basis for the development and determination of Cerasus Humilis.Key words Cerasus Humilis ; polyphenol ; Folin-Ciocalteu reagent ; spectrophotometry欧李(Cerasus humilis (Bge) Sok)为蔷薇科樱属野生果树，分布于我国的东三省、内蒙 古、河北、山东、山西等地,多生长在向阳山坡或沙丘边缘,资源丰富1。欧李植株根系庞 大，有防沙固土、美化环境的作用，其茎叶、果实、根皮均具有较高的经济价值2。欧李果 实颜色艳红，形似李子，有独特香气，味酸甜，不仅可直接食用，也可用于果酱、果干、果 汁、果酒等深加工产品的开发。欧李果实中维生素、矿物质、蛋白质等营养成分含量丰富， 其中矿物质中钙的含量尤其丰富，远远高于其他常见水果品种，有“高钙果王”、“钙果”的 美称。多酚(Polyphenols),又被称为植物单宁，是一种具有抗氧化活性的次生代谢产物， 在医药、食品、保健、化妆品中有很大的开发前景，具有抗辐射、抗衰老、抗肿瘤、降血脂 等药理作用34。欧李中富含酚类物质，研究表明，欧李多酚能够抑制自由基，从而避免生 物膜、脂蛋白、血清白蛋白的氧化损伤，其机理可能与其花青素富含的可水解单宁单元成分、 活性羟基数目及空间构象有关5。多酚含量的测定方法普鲁士蓝法、酒石酸分光光度法、原子吸收法、紫外分光光度法法 等。较为常用的是紫外分光光度法，本实验参考李静等的方法6并略有改进，以没食子酸为 标准品，采用福林-酚法测定欧李中多酚类物质的含量，建立起精确的欧李多酚检测方法， 旨在为欧李多酚的定量及生物功能评价提供依据。1 材料与方法1.1 材料与仪器京欧2号欧李、山西欧李、内蒙古欧李分别采于河北、山西、内蒙古，于实验室20 C 保存备用。福林酚、没食子酸，均购于国药集团化学试剂有限公司；乙醇、碳酸钠，均为分 析纯；所有用水均为Millin-Q超纯水。主要仪器：Millin-Q超纯水制备机(密理博中国有限 公司)；AL 104电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；UV-2450PC型岛津紫外分光光 度计(日本岛津公司);SK5210LHC型KUDOS超声波清洗仪(上海科导超声仪器有限公司)。1.1 实验方法1.2.1 实验原理在碱性溶液中，钨酸钼可以将多酚化合物定量氧化，自身被还原生成蓝色化合物，蓝色 化合物在最大吸收波长处的吸光值与多酚类化合物含酚基团的数目成正比。1.2.2 标准溶液配制称取O.lOOOg没食子酸，用蒸馏水溶解，定容至100m 1,摇匀备用，此溶液质量浓度为 1000mg/L。1.2.3 标准曲线建立最佳检测波长选择没食子酸标准溶液于600900nm范围内进行扫描，确定多酚的最大 吸收波长。标准曲线建立 精确吸取质量浓度为800mg/L的没食子酸溶液0.00、1.00、2.00、3.00、 4.00、5.00mL至100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，所得没食子酸标准溶液的 质量浓度分别为0.0、8.0、16.0、24.0、32.0、40.0mg/L。精确吸取1.00mL没食子酸标准溶 液于10ml比色管中，加入1.00mL福林酚试剂，摇匀，再加入3.00mL7.5%Na2C03溶液， 加蒸馏水定容至10mL，摇匀，室温下显色1h，765nm处测定吸光度，同时以未添加没食子 酸标准溶液作空白对比，以吸光度对没食子酸质量浓度作图。1.2.4 样品测定样品预处理 将欧李鲜果拣选、清洗、晾干，去核，取可食部分切碎，组织捣碎机打碎 成匀浆，备用。样品多酚的提取称取5g欧李匀浆，以80ml60%乙醇溶液洗入100mL容量瓶中，至超 声仪中60C超声30min，取出，冷却，以60%乙醇溶液定容，摇匀，过滤，弃初滤液20mL， 取续滤液备用。测定 精确吸取1.00mL样品滤液(若多酚含量过高，可适当稀释)或没食子酸标准溶 液于10ml比色管中，加入1.00mL福林酚试剂，摇匀，再加入3.00mL7.5%Na2C03溶液， 加蒸馏水定容至10mL，摇匀，室温下显色1h，765nm处测定吸光度，根据稀释倍数和从标 准曲线中查出的浓度，计算样品多酚含量。样品中多酚计算方法 样品中多酚含量(mg/g)=(C-C0)XVXf/ 1000m;式中：C-稀释液中 多酚含量(mg/L),C-空白中多酚含量(mg/L), V】-定容体积(mL), f-稀释倍数，m-样品质量(g)。2 结果与分析2.1最佳检测波长的选择及标准曲线线性关系的考察在765nm的波长处测定吸光度，得到回归方程y=0.01286x+0.00499,相关系数r=0.9996 表明没食子酸在040mg/L范围与吸光度有良好的线性关系。取没食子酸标准溶液，随着放置时间的推移，于1.2.3 中标准曲线建立的测定条件下每20min测定其吸光度，共6次，分析测定多酚含量，并计算标准偏差、相对标准偏差，结果 见表1。标准溶液中多酚含量的RSD小于1%,表明没食子酸标准溶液2h内显色稳定。表1没食子酸标准溶液中多酚2h的稳定性(n=6)项目测定值(mg/L)测定平均值(mg/L)标准差(%)RSD(%)124.80224.87325.0625.0518.630.74425.07525.22625.262.3 精密度和准确度验证 精密称取京欧2号样品6份，分别于1 .2.4中样品多酚的提取和测定的测定条件下测定其吸光度，分析多酚含量，结果见表2。六次测定平均值为7.33mg/g, RSD小于1%,表明 本实验具有良好的重现性。表2 京欧2号中多酚含量测定的精密度项目测定值测定平均值标准差RSD(mg/g)(%)(%)(%)17.3227.3737.447.336.370.8747.2557.3167.312.4 加样回收率实验精确称取5.00g京欧2号样品各数份，分别添加适量没食子酸标准品，以少量60%乙醇 溶液溶解并转移至100ml容量瓶中，其余按分别于1.2.4中样品多酚的提取和测定的测定条件下测定其吸光度，计算多酚含量，以加标测得量减去原样含量，再除以加标量，得到回收率，结果见表3。多酚平均回收率为99.56%, RSD=0.84%,表明本实验方法稳定可靠。表3样品加样回收率实验结果(n=5)样品回收的量(mg/g)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)样品7.33样品+2mg标准品9.3299.3299.560.84样品+4mg标准品11.35100.49样品+5mg标准品12.2898.862.5 测定结果 按1.2.4将三种欧李鲜果进行预处理，各称取三份做平行实验，分别于1.2.4中样品多酚 的提取和测定的条件下处理样品及测定其吸光度，对照标准曲线，计算各样品中多酚含量 结果见图2。京欧2号、山西欧李、内蒙古大欧李中总多酚的含量平均值分别为7.33mg/L、8.67 mg/L、7.50 mg/L。其中京欧2号与内蒙古大欧李中总多酚含量相差不大，山西欧李中 总多酚含量较为突出，值得深入研究和开发利用。图 2 三种欧李的多酚含量3 小结作为一种并不常见的水果，欧李因其易存活、能挂果、可固沙、营养丰富等特点而具有 巨大的经济开发潜质。现阶段在欧李植株栽培方面已积累了相当多的经验，在其相关产品的 工艺研究上也不乏成果，但目前对欧李的理论和应用研究还处于初级阶段，欧李产品要量产， 其营养成分的分析与检测是十分必要的。本实验参考李静等的方法，以没食子酸为标准品，采用福林-酚法测定欧李中多酚类物 质的含量，经过试验分析，摒弃原先略不稳定的显色时间(30min),采用更为稳定的显色时 间(60min),测得京欧2号、山西欧李及内蒙大欧李中多酚的含量分别为7.33mg/L、8.67 mg/L、 7.50 mg/L。多酚的检出限为0.007mg/L,定量限为0.023mg/L。方法稳定可靠，可为欧李中 多酚的测定提供方法和依据。参考文献：1杜俊杰，杨怀义，曹琴，杨海燕.欧李生物学特性的研究J.山西农业大学学报，1992,12(4):311314.2 刘淑琴，常虹，周家华等.我国欧李开发应用研究现状J.食品研究与开发,2009,30(12):167170.3 杨云裳，李帅斌,李春雷，张应鹏.酶法浸提酿酒葡萄果渣中多酚的最优工艺J.兰州理工大学 报， 2013,39(3):6164.4 李欧，李卫东，胡璇等.欧李果实多酚含量的差异比较J.中国实验方剂学杂志,2013,18(22):5355. 程霜.欧李多酚清除自由基活性研究J.食品科学,2007,28(9):5760.6李静,聂继云，李海飞等.Folin-酚法测定水果及其制品中总多酚含量的条件J.果树学报,2008,25(1): 126131.