质粒提取原理及步骤

令狐采学质粒提取 原理及步骤令狐采学一、导论已经提出过许多方法用于从细菌中提纯质粒DNA,这些方法都含有以下3 个步骤：1. 细菌培养物的生长。2. 细菌的收获和裂解3. 质粒 DNA 的纯化。（一）细菌培养物的生长从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中（有含有行当抗 生素的液体培养基中生长），然后从中纯化质粒，质粒的提纯几 乎总是如此。现在使用的许多质粒载体（如pUC系列）都能复 制到很高的拷贝数，惟致只要将培养物放在标准 LB 培养基中 生长到对数晚期，就可以大量提纯质粒。此时，不必造反性地 扩增质粒DNA。然而，较长一代的载体（如pBR322）由于不能如 此自由地复制，所以需要在得到部分生长的细菌培养物中加入 氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行性扩增。氯霉素可 抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，令狐采学 松弛型质粒仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续递增。 这样，像pBR3 2 2 类的质粒，从经氯霉素处理和未经处理 的培养物中提取质粒的产量迥然不同，前者大为增高。多年来， 加入足以完全抑制蛋白质合成的氯霉素yg/ml）已成为标准的操 作、用该方法提取的质粒DNA量，对于分子克隆中几乎所有 想象到的工作任务。（二）细菌的收获和裂解细菌的收获可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采用多 种方法中的任意一种，这些方法包括用非离子型或离子型去污 剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。选择哪一种方法 取决于3个因素：质粒的大小、小肠杆菌菌株及裂解后用于纯 化质粒 DNA 的技术。 尽管针对质粒和宿主的每一种组合分别 提出精确的裂解条件不切实际，但仍可据下述一般准则来选择 适当方法，以取得满意的结果。1）大质粒（大于15kb）容易受损， 故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来。将细菌悬于蔗糖等渗 溶液中，然后用溶菌酶和EDTA进生处理，破坏细胞壁和细胞 外膜，再加入SDS 类去污剂溶解球形体。这种方法最大限度 地减小了从具有正压的细菌内部把质粒释放出来所需要的作用 力。2）可用更剧烈的方法来分离小质粒。在加入EDTA后，有时还 在加入溶菌酶后让细菌暴露于去污剂，通过煮沸或碱处理使之 裂解。这些处理可破坏碱基配对，故可使宿主的线状染色体 D 令狐采学令狐采学NA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼 此分开。当条件恢复正常时，质粒DNA链迅速得到准确配置, 重新形成完全天然的超螺旋分子。3）些大肠杆菌菌株（如HB101的一些变种衍生株）用去污剂或 加热裂解时可释放相对大量的糖类，当随后用氯化铯溴化乙 锭梯度平衡离心进行质粒纯化时它们会惹出麻烦。糖类会在梯 度中紧靠超螺旋质粒DNA所占位置形成一致密的、模糊的区 带。因此很难避免质粒DNA内污染有糖类，而糖类可抑制多 种限制酶的活性。故从诸如HB101和TG1等大肠杆菌蓖株中 大量制备质粒时，不宜使用煮沸法。4）当从表达内切核酸酶A的大肠杆菌菌株（endA+株，如HB101） 中小量制备质粒时，建议不使用煮沸法。因为煮沸不能完全灭活内切核酸酶A，以后在温育（如用限制酶消化）时，质粒DNA 会被降解。但如果通过一个附加步骤（用酚：氯仿进行抽提）可以 避免此问题。5）目前这一代质粒的拷贝数都非常高，以致于不需要用氯 霉素进行选择性扩增就可获得高产。然而，某些工作者沿用氯 霉素并不是要增加质粒DNA的产量，而是要降低细菌细胞在 用于大量制备的溶液中所占体积。大量高度粘稠的浓缩细菌裂 解物，处理起来煞为费事，而在对数中期在增减物中加入氯霉 素可以避免这种现象。有氯霉素存在时从较少量细胞获得的质 粒DNA的量以与不加氯霉素时从较大量细胞所得到的质粒DN A 的量大致相等。令狐采学（三）质粒 DNA 的纯化 常使用的所有纯化方法都利用了质粒 DNA 相对较小及共价闭 合环状这样两个性质。例如，用氯化铯溴化乙锭梯度平衡离 心分离质粒和染色体 DNA 就取决于溴化乙锭与线状以及与闭 环 DNA 分子的结合量有所不同。 溴化乙锭通过嵌入奋不顾身 碱基之间而与DNA结合，进而使双螺旋解旋。由此导致线状D NA的长度有所增加，作为补偿，将在闭环质粒DNA中引入超 螺旋单位。最后，超螺旋度大为增加，从而阻止了溴化乙锭分 了的继续嵌入。但线状分子不受此限，可继续结合更多的染料， 直至达到饱和（每2个碱基对大约结合1个溴化乙锭分子）。由 于染料的结合量有所差别，线状和闭环DNA分了在含有饱和 量溴化乙锭的氯化铯度中的浮力密度也有所不同。多年来，氯 化铯-溴化乙锭梯度平衡离心已成为制备大量质粒DNA的首 选方法。然而该过程既昂贵又费时，为此发展了许多替代方法。 其中主要包括利用离子交换层析、凝胶过滤层析、分级沉淀等 分离质粒DNA和宿主DNA的方法。本实验室采用离子交换层 析法已可得到极高纯度的质粒。二、质粒DNA的小量制备质粒DNA的小量制备可米用下述的碱裂解法或煮沸法（一）细菌的收获和裂解令狐采学1 收获1）将2ml含相应抗生素的LE加入到容量为15ml 并通气良好（不盖紧）的试管中，然后接入一单菌落，于30C 剧烈振摇下培养过夜。2）将1.5ml培养物倒入微量离心管中， 用微量离心机于4C以12000g离心30秒，将剩余的培养物贮存 于4C3 ）吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。除去上清 的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，轻缓抽吸， 并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离 细菌沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁的液滴。2.碱裂解法1）将细菌沉淀，所得重悬于100皿用冰预冷的溶 液I中，剧烈振荡。溶液I：50mmol/L 葡萄糖25mmol/L Tris. Cl（pH8.0）10mmol/LEDTA（pH8.0）溶液I可成批配制，每瓶约100ml,在10lbf/in2（6.895Xl04Pa）高 压下蒸气灭菌15分钟，贮存于4C。须确使细菌沉淀在溶液I 中完全分散，将两个微量离心管的管底部互相接触震荡，可使 沉淀迅速分散。2）加200卩l新配制的溶液H。溶液H 0.2mol/L NaOH （临用前用10mol/L贮存液现用现稀释） 1%SDS盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物。应确保离心 管的整个内表面均与溶液H接触。不要振荡，将离心管放置于 冰上。3）加150卩l用冰预冷的溶液川溶液川令狐采学5mol/ L乙酸钾60ml冰乙酸11.5ml水 28.5ml所配成的溶液对钾是3mol/L,对乙酸根是5mol/L。盖紧管口， 将管倒置后和地振荡10秒钟溶液川在粘稠的细菌裂解物中分散 均匀，之后将管置于冰上3 5分钟。4）用微量离心机于4C 12 000g离心5分种，将上清转移到另一离心管中。5）可做可 不做：加等量酚：氯念，振荡混匀，用微量离心机于4 C以 12000g离心2分钟，将上清转移到另一良心管中。有些工作者 认为不必用酚：氯仿进行抽提，然而由于一些未知的原因，省 略这一步，往往会得到可耐受限制酶切反应的DNA6 ）用2 倍休积的乙醇于室温沉淀双锭DNA。振荡混合，于室温放置 2分钟。7）用微量离心机于4C以12 000g离心5分钟。8）小心吸去 上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再 将附于管壁的液滴除尽。除去上清的简便方法是用一次性使用 的吸头与真空管道相连，并用吸头接触液面。当液体从管中吸 出时，尽量使吸头远离核酸沉淀，然后继续用吸头通过抽真空 除去附于管壁的液滴。9）用1 ml70%乙醇于4C洗涤双链DN A 沉淀，按步骤 8）所术方法去掉上清，在空气中使核酸沉淀干 燥10分钟i.此法制备的高拷贝数质粒（如Xf3或pUC）,其 产量一般约为：每毫升原细菌培养物3 5怕。ii如果要通过限制酶切割反应来分析DNA,可取1皿DNA溶 液加到另一含8皿水的微量离心管内，加1皿10X限制酶缓冲令狐采学令狐采学液和1单位所需限制酶，在适宜温育1-2小时。将剩余的D NA贮存于一20C。iii此方法按适当比例放大可适用于100ml细菌培养物：3 煮沸裂解1）将细菌沉淀，所得重悬于350MSTET中。STET0.1mol/L NaCL10mmol/L Tris.Cl（pH8.0）1mmol/L EDTA（pH8.0）5% Triton X-1002）加25卩1新配制的溶菌酶溶液10mg/ml,用10mmol/L Tris.Cl（p H8.0）配制，振荡3秒钟以混匀之。如果溶淮中pH低于8.0,溶 菌酶就不能有效发挥作用。3）将离心管放入煮沸的水浴中， 时间恰为40秒。4）用微量离心机于室温以12 000g离心10 分种。5）用无菌牙签从微量离心管中去除细菌碎片。6）在 上清中加入40皿5mo1/L乙酸钠（pH5.2）和420卩1异丙醇，振 荡混匀，于室温放置5 分钟。7）用微量离心机于4C以12 000g离心5分种，回收核酸沉淀。8）小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有 液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。除去上清的简便方法是 用一次性使用的吸头与真空管道相连，轻缓抽吸，并用吸头接 触液面。当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离核酸沉淀， 然后继续用吸头通过抽真空除去附于管的液滴。9）加1ml 70%令狐采学乙醇，于4C以12 OOOg离心2分钟。10）按步骤8）所述再次 轻轻地吸去上清，这一步操作要格外小心，因为有时沉淀块贴 壁不紧，去除管壁上形成的所有乙醇液滴，打开管口，放于室 温直至乙醇挥发殆尽，管内无可见的液体（25）分钟。11）用50卩1含无DNA酶的胰血人酶（20yg/ml）的TE（pH8.0） 溶解核酸稍加振荡，贮存于-20C。注：当从表达内切核酸酶A 的大肠杆菌株（endA+株，如HB101 ）中小量制粒尤其DNA 时，建议舍弃煮沸法。因为煮沸步骤不能完全灭活内切核酸酶 A,以后在Mg2+存在下温育（V中用限制酶时）质粒DNA可 被降解。在上述方案的步骤9）之间增加一步，即用酚：氯仿 进行抽提，可以避免这一问题。（二）质粒DNA小量制备的问题与对策裂解和煮佛法都极其可靠，重复性也很好，而且一般没有会 么麻烦。多年来，在我们实验室中日常使用这两种方法的过程 中，只碰到过两个问题：1）有些工作者首次进行小量制备时, 有时会发现质粒 DNA 不能被限制酶所切割，这几乎总是由于 从细菌沉淀或从核酸沉淀中去除所有上清液时注意得不够。大 多数情况下，用酚：氯仿对溶液进行抽提可以去除小量备物中 的杂质。如果总是依然存在，可用离心柱层析注纯化 DNA。2）在十分偶然的情况下，个别小时制备物会出现无质粒 DNA 的现象。这几乎肯定是由于核酸沉淀颗粒已同乙醇一起被弃 去。三、质粒DNA的大量制备（一）在丰富培养基中扩增质粒 许多年来，一直认为在氯霉 素存在下扩增质粒只对生长在基本培养基上的细菌有效，然而 在带有pMBl或ColEl复制子的高拷贝数质粒的大肠杆菌菌株 中，采用以下步骤可提高产量至每 500ml 培养物 25mg 质粒 D NA,而且重复性也很好。1）将30m 1含有目的质粒的细菌培养物培养到对数晚期（DNA 600 约 0.6）。培养基中应含有相应抗生素，用单菌落或从单菌 落中生长起来的小量液体闭关物进行接种。2）将含相应抗生 素的500ml LE或Terrific肉汤培养基（预加温至37C ）施放 入25m 1对数晚期的培养物，于37C剧烈振摇培养25小时（摇 床转速300转/分），所得培养物的OD 600值约为0.4。3） 可做可不做：加2.5ml氯霉素溶液（34mg/m1溶于乙醇），使终 浓度为170yg/ml。像pBR322 一类在宿主菌内只以中等拷贝娄 竿行复的质粒，有必要通过扩增。这些质粒只要从生长达到饷 新一代的质粒（如pUC质粒）可复制达到很高的拷贝数，因此 无需扩增。这些质粒只要从生长达到饱和的细菌培养物即可大 量提纯。但用氯霉素进行处理，具有抑制细菌复制的优点，可 减少细菌裂解物的体积和粘稠度，极大地简化质粒纯化的过程。 所以一般说来，尽管要在生长中的细菌培养物里加入氯霉素略 显不便，但用氯霉素处理还是利大于弊。4）于37C剧烈振摇（300转/分），继续培养12-16小时。(二)细菌的收获和裂解1 收获1)用合适转头于4C以4000转/分离心15分钟，弃 上清，敞开离心管口并倒置离心管使上清全部流尽。2)将细 菌沉淀重悬于100ml用冰预冷的STE中。STE0.1mol/L NaCl10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)1mmol/L EDTA(pH8.0)2)按步骤1)所述方法离心，以收集细菌细胞。2，碱裂解法1)将冼过的 500ml 培养物的细菌沉淀物 来自 收获细菌的步骤3重悬于10ml (18ml)溶液I中。溶液I： 50mmol/L 葡萄糖25mmol/L Tris.Cl(pH8.0)10mmol/L EDTA(pH8.0)溶液I可成批配制，在10 lbf/in2(6.895x104Pa)高压下蒸气灭菌 15分钟，贮存于4to2 )加1ml(2ml)新配制的溶菌酶溶液10 mg/ml，溶于 10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)。当溶液的 pH 值低于 8.0 时，溶菌酶不能有效工作。3)加20ml(40ml)新配制的溶液H。 溶液0.2mol/L NaOH(临用前用10mol/L贮存液现用现稀释)1SDS盖紧瓶盖，缓缓颠倒离心瓶数次，以充分混匀内容物。于室温 令狐采学令狐采学放置5-10分钟。4) 口 15nl(20ml)用冰预冷的溶液川。溶液川: 5mol/L 乙酸钾 60ml冰乙酸 11.5ml水 28.5ml所配成的溶液对钾是3mol/L,对乙酸根是5mol/L。封住瓶口， 摇动离心瓶数次以混匀内容物，此时应不再出现分明的两个液 相。置冰上放10分钟，应形成一白色絮状沉淀。于0C放置后 所形成的沉淀应包括染体DNA、高分子量RNA和钾SDS 蛋白质膜复合物。5)用合适转头于4C以4000转/分离心15分钟，不开刹车而 使转头自然停转。如果细菌碎片贴壁不紧，可以 5000 转/分再 度离心20分钟，然后尽可能将上清全部转到另一瓶中，弃去残 留在离心管内的粘稠状液体。未能形成致密沉淀块的原因通常 是由于溶液川与细菌裂解物混合不充分步骤4)O6)上清过 滤至一 250ml 离心瓶中，加0.6 体积的异丙醇，充分混匀，于室 温放置10分钟。7)用合适转头于室温以500转/分离心15分 钟，回收核酸。如于4C离心，盐也会了生沉淀。8) 小心倒掉上清，敞开瓶口倒置离心瓶使残余上清液流尽， 于室温用 70乙醇洗涤沉积管壁。倒出乙醇，用与真空装置相 联的巴期德吸出附于瓶壁的所有液滴，于室温将瓶倒置放在纸 巾上，使最后残余的痕量乙醇挥殆尽。9)用3ml TE(pH8.0) 溶解核酸沉淀。10)纯化。四、质粒DNA的纯化 聚乙二醇沉淀法纯化质粒DNA氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离 心法纯化闭环DNA（一）聚乙二醇沉淀法提取质粒DNA1 ）将核酸溶液所得转 入15mlCorex管中，再加3ml用冰预冷的5mol/L LiCl溶液， 充分混匀，用合适转头于4C下以10 000转/分离心10分钟。 LiCl可沉淀高分子RNA。2）将上清转移到另一 30mlCorex管内，加等量的异丙醇，充 分混匀， 用 SorvallSS34 转头（或与其相当的转尖）于室温以 1 0 000转/分离心10分钏，回收沉淀的核酸。3）小心去掉上清, 敞开管口，将管倒置以使最后残留的液滴流尽。于室温用 70 乙醇洗涤沉淀及管壁，流尽乙醇，用与真空装置相连的巴其德 吸管吸去附于管壁的所有液滴，敞开管口并将管侄置，在纸巾 上放置几分钟，以使最后残余的痕量乙醇蒸发殆尽。4）用50 0皿含无DNA酶的胰RNA酶（20yg/ml ）的TE （pH8.0）溶解 沉淀，将溶液转到一微量离心管中，于室温放置30分钟。5） 加 500卩 1 含 13%（w/v）聚乙二醇（PEG 8000）的 1.6mol/L Na Cl,充分混合，用微量离心机于4C以12000g离心5分钟，以回 收质粒DNAO6 ）吸出上清，用400皿TE（pH8.0）溶解质粒D NA 沉淀。用酚、酚：氯仿、氯仿各抽1次。7）将水相转到另一微量离心管中，加100皿10mo1/L乙醇铵, 充分混匀，加2倍体积（约1ml）乙醇，于室温放置10分钟， 令狐采学令狐采学于4C以12 OOOg离心5分钟，以回收沉淀的质粒DNA。8）吸去上清，加200皿处于4C以12 OOOg离心2分钟。9）吸去上清，敞开管口，将管置于实验桌上直到最后可见的 痕量乙醇蒸发殆尽。10）用500皿TE（pH8.0）溶解沉淀1:100 稀释用TE（pH8.0）后测量OD 260,计算质粒DNA的浓度（1 OD260 = 50yg 质粒 DNA/ml），然后将 DNA 贮于 20C。