酶切注意事项

酶切DNA酶切一般分为质粒直接酶切和PCR产物酶切。DNA酶切及凝胶电泳一. DNA的限制性内切酶酶切分析限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。它 可分为三类：I类和III类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰 （甲基化）作用且依赖于ATP的存在。I类酶结合于识别位点并随 机的切割识别位点不远处的DNA，而III类酶在识别位点上切割 DNA分子,然后从底物上解离。II类由两种酶组成：一种为限制 性内切核酸酶（限制酶），它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种 为独立的甲基化酶，它修饰同一识别序列。II类中的限制性内切 酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大 多数II类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷 酸序列（如EcoR I识别六个核苷酸序列:5- Gl AATTC-3）,有少 数酶识别更长的序列或简并序列。II类酶切割位点在识别序列中, 有的在对称轴处切割，产生平末端的DNA片段（如SmaI :5-CCC l GGG-3）;有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端 的DNA片段称粘性未端，如EcoR I切割识别序列后产生两个互 补的粘性末端。5G|AATTC3 5G AATTC33CTTAAfG5 3CTTAA G5DNA 纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响 限制性内切酶的活性。大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA 的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时,会影响 其进一步使用,因此在吸取限制性内切酶时 ,每次都要用新的吸 管头。如果采用两种限制性内切酶,必须要注意分别提供各自的 最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液 ,则可同时水解。若需要不 同的盐浓度,则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用 ,随后调 节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶 切反应完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加0.1倍体积3mol/L NaAc 和2倍体积无水乙醇，混匀后置-70C低温冰箱30分钟，离心、 干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。DNA 限制性内切酶酶切图谱又称 DNA 的物理图谱，它由一系 列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图 式表示。在DNA序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA的无性 繁殖、基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图谱都是不 可缺少的环节，近年来发展起来的RFLP（限制性片段长度多态性） 技术更是建立在它的基础上。构建 DNA 限制性内切酶图谱有许多方法。通常结合使用多种 限制性内切酶，通过综合分析多种酶单切及不同组合的多种酶同 时切所得到的限制性片段大小来确定各种酶的酶切位点及其相 对位置。酶切图谱的使用价值依赖于它的准确性和精确程度。在酶切图谱制作过程中，为了获得条带清晰的电泳图谱，一 般DNA用量约为0.5-lug。限制性内切酶的酶解反应最适条件 各不相同,各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反应温度 （大多 数为37C）。对质粒DNA酶切反应而言，限制性内切酶用量可按 标准体系lug DNA加1单位酶，消化1-2小时。但要完全酶解则 必须增加酶的用量，一般增加2-3倍，甚至更多，反应时间也要适 当延长。二. 凝胶电泳 琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离鉴定和纯化 DNA 片段 的标准方法。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密 度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌入 染料溴化乙啶（Ethidium bromide, EB染色，在紫外光下至少可 以检出lTOng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位 置。此外，还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以 后的克隆操作。琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼 脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广，不同浓度琼脂糖凝胶可分 离长度从200bp至近50kb的DNA片段。琼脂糖通常用水平装置 在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段 DNA（5-500bp）效果较好,其分辩力极高，甚至相差lbp的DNA片段 就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快，可容纳相对大量的DNA,但 制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进 行电泳。目前，一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质，其密 度取决于琼脂糖的浓度。在电场中,在中性 pH 值下带负电荷的 DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定：1、DNA的分子大小：线状双链 DNA 分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与 DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在 凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。2、琼脂糖浓度一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼 脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性 关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kb 的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb的DNA分子 所需胶浓度为0.3-0.7%, DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓 度为0.8-1.0%。3、DNA分子的构象当DNA分子处于不同构象时，它在电场中移动距离不仅和分 子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超 螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA移动 最快,而线状双链DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现 凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为 含有其他DNA引起时，可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收，用同 一种限制性内切酶分别水解 ,然后电泳 ,如在凝胶上出现相同的 DNA 图谱,则为同一种 DNA。4、电源电压在低电压时,线状 DNA 片段的迁移速率与所加电压成正比。 但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以 不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度 也越大,因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要 使大于 2kb 的 DNA 片段的分辨率达到最大,所加电压不得超过 5v/cm。5、嵌入染料的存在荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料会嵌 入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚 性更强，还会使线状DNA迁移率降低15%。6、离子强度影响电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在 没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶），电导率最小,DNA几乎 不移动，在高离子强度的缓冲液中（如误加10X电泳缓冲液），则 电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。对于天然的双链DNA，常用的几种电泳缓冲液有TAE含EDTA （pH8.0）和 Tris-乙酸,TBE（Tris-硼酸和 EDTA）,TPE（Tris-磷酸 和EDTA），一般配制成浓缩母液，储于室温。第二节 材料、设备及试剂一、材料入DNA:购买或自行提取纯化；重组pBS质料或pUC19质粒； EcoRI酶及其酶切缓冲液：购买成品；Hindlll酶及其酶切缓冲液: 购买成品;琼脂糖(Agarose):进口或国产的电泳用琼脂糖均可。二、设备 水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉或电炉,紫外透射仪, 照相支架, 照相机及 其附件。三、试剂1、5XTBE电泳缓冲液：配方见第一章。2、6X电泳载样缓冲液：0.25%溴粉蓝，40%(w/v)蔗糖 水溶液，贮存于4C。3、溴化乙锭(EB溶液母液:将EB配制成10mg/ml,用铝箔或 黑纸包裹容器,储于 室温即可。第三节 操作步骤一、DNA酶切反应1、将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管(最好0.5ml)编号， 用微量移液枪分别加入DNA lug和相应的限制性内切酶反应 10X缓冲液2ul,再加入重蒸水使总体积为19ul,将管内溶液 混匀后加入1ul酶液,用手指轻弹管壁使溶液混匀，也可用微量 离心机甩一下,使溶液集中在管底。此步操作是整个实验成败的 关键,要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时应尽量减少其离 开冰箱的时间，以免活性降低。2、混匀反应体系后，将eppendorf管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上）,37C水浴保温2-3小时,使酶切反应完 全。3、每管加入2ul O.lmol/L EDTA（pH8.0）,混匀，以停止反 应,置于冰箱中保存备用。二、DNA分子量标准的制备采用EcoR I或Hindlll酶解所得的入DNA片段来作为电泳时 的分子量标准。入DNA为长度约50kb的双链DNA分子，其商品溶 液浓度为0.5mg/ml,酶解反应操作如上述。Hindlll切割DNA后 得到8个片段,长度分别为23.1,9.4,6.6,4.4,2.3,2.0,0.56 和0.12kbEcoRI切割1DNA后得到6个片段，长度 分别为21.2, 7.4, 5.8, 5.6, 4.9 和 2.5kb。三、琼脂糖凝胶的制备1、取5XTBE缓冲液20ml加水至200ml,配制成0.5XTBE 稀释缓冲液,待用。2、胶液的制备：称取0.4g琼脂糖，置于200ml锥形瓶中， 加入50ml 0.5XTBE稀释缓冲液,放入微波炉里（或电炉上）加热 至琼脂糖全部熔化,取出摇匀,此为0.8琼脂糖凝胶液。加热过 程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时 应盖上封口膜,以减少水份蒸发。3、胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏（宽约 lcm）紧密封住。将封好的胶槽置于水平支持物上，插上样品梳子, 注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。向冷却 至50-60C的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭（EB溶液使其终浓度为 0.5ug /ml（也可不把EB加入凝胶中，而是电泳后再用0.5ug/ml 的EB溶液浸泡染色）。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡 皮膏内侧,待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽 内,使胶液形成均匀的胶层。倒胶时的温度不可太低,否则凝固不 均匀,速度也不可太快,否则容易出现气泡。待胶完全凝固后拨出 梳子,注意不要损伤梳底部的凝胶，然后向槽内加入0.5XTBE稀 释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。因边缘效应样品槽附近会 有一些隆起,阻碍缓冲液进入样品槽中,所以要注意保证样品槽 中应注满缓冲液。4、加样：取10ul酶解液与2ul 6X载样液混匀,用微量 移液枪小心加入样品槽中。若DNA含量偏低，则可依上述比例增 加上样量,但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要更 换tip头，以防止互相污染，注意上样时要小心操作，避免损坏凝 胶或将样品槽底部凝胶刺穿。5、电泳：加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源。控制电 压保持在60-80V,电流在40mA以上。当溴酚蓝条带移动到距凝 胶前沿约2cm时，停止电泳。6、染色：未加EB的胶板在电泳完毕后移入0.5ug/ml的 EB溶液中，室温下染色20-25分钟。7、观察和拍照：在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染 色后的或已加有EB的电泳胶板。DNA存在处显示出肉眼可辨的 桔红色荧光条带。紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面 罩,以免损伤眼睛。经照相机镜头加上近摄镜片和红色滤光片后 将相机固定于照相架上，采用全色胶片，光圈 5.6,曝光时间 10-120秒（根据荧光条带的深浅选择）。8、DNA 分子量标准曲线的制作：在放大的电泳照片上,以 样品槽为起点，用卡尺测量入DNA的EcoR I和Hindlll酶切片段的 迁移距离,以厘米为单位。以核苷酸数的常用对数为纵坐标,以迁 移距离为横坐标，在坐标纸上绘出连结各点的平滑曲线，即为该 电泳条件下DNA分子量的标准曲线。9、DNA 酶切片段大小的测定：在放大的电泳照片上，用卡 尺量出DNA样品各片段的迁移距离，根据此数值，在DNA分子量标 准曲线上查出相应的对数值，进一步计算出各片段的分子量大小 （若用单对数坐标纸来绘制标准曲线，则可根据迁移距离直接查 出DNA片段的大小）。反之,若已知DNA片段的大小亦可由标准曲 线上查出它预计的迁移距离。10、DNA酶切片段排列顺序的确定：根据单酶切，双酶切和 多酶切的电泳分析结果，对照DNA酶切片段大小的数据进行逻辑 推理，然后确定各酶切片段的排列顺序和各酶切位点的相对位置 以环状图或直线图表示，即成该DNA分子的限制性内切酶图谱。注意1. 酶切时所加的DNA溶液体积不能太大，否则DNA溶液中其他成 分会干扰酶反应。2、酶活力通常用酶单位（U）表示，酶单位的定义是：在最 适反应条件下，1小时完全降解lmg lDNA的酶量为一个单位， 但是许多实验制备的DNA不象lDNA那样易于降解，需适当增加 酶的使用量。反应液中加入过量的酶是不合适的，除考虑成本外， 酶液中的微量杂质可能干扰随后的反应。3、市场销售的酶一般浓度很大，为节约起见，使用时可事 先用酶反应缓冲液（1X ）进行稀释。另外，酶通常保存在50% 的甘油中，实验中，应将反应液中甘油浓度控制在1/10之下， 否则，酶活性将受影响。4、观察DNA离不开紫外透射仪,可是紫外光对DNA分子有 切割作用。从胶上回收DNA时，应尽量缩短光照时间并采用长波 长紫外灯（300-360nm）,以减少紫外光切割DNA。5、EB是强诱变剂并有中等毒性,配制和使用时都应戴手套， 并且不要把EB洒到桌面或地面上。凡是沾污了 EB的容器或物品 必须经专门处理后才能清洗或丢弃。6、当EB太多，胶染色过深,DNA带看不清时,可将胶放入蒸 馏水冲泡,30分钟后再观察。酶切反应建议一、 建立一个标准的酶切反应 目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切 割lug不同来源和纯度的DNA。通常，一个50ul的反应体系 中，1ul的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1 小时即可降解lug已纯化好的DNA。如果加入更多的酶，则可 相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延 长反应时间（不超过16小时）也可完全反应。二、选择正确的酶不言而喻，选择的酶在底物DNA上必须至少有一个相应的识别位 点。识别碱基数目少的酶比碱基数目多的酶更频繁地切割底物。假设一个GC含量50%的DNA链，一个识别4个碱基的酶将平均 在每44（256）个碱基中切割一次；而一个识别6个碱基的酶将 平均在每 46（4096）碱基切割一次。内切酶的产物可以是粘端 的（3或5突出端），也可以是平端的片段。粘端产物可以与相 容的其它内切酶产物连接，而所有的平端产物都可以互相连接。 相关信息参见目录的 Compatible Cohesive Ends And Recleavable Blunt Ends 一文。三、酶 内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。酶应当是最后一个被 加入到反应体系中（在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经 加好并已预混合）。酶的用量视在底物上的切割频率而定。例如， 超螺旋和包埋法切割的DNA通常需要超过1U/ug的酶才能被完 全切割。参见目录第244和264之切割质粒DNA和包埋法切割DNA。四、DNA待切割的DNA应当已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污剂或过多 盐离子的污染，以免干扰酶的活性。DNA的甲基化也应该是酶切 要考虑到的因素。关于甲基化的内容，参见第252页至253页之 甲基化相关内容。五、缓冲液对于每一种酶NEB都提供相应的最佳缓冲液，可保证几乎100% 的酶活性。使用时的缓冲液浓度应为IX。有的酶要求100ug/ml 的BSA以实现最佳活性。在这种情况下，我们也相应提供100X 的BSA (10mg/ml)。不需要BSA的酶如果加了 BSA也不会受太大 影响。关于缓冲液更详细的信息参见第234页。六、反应体积内切酶活力单位的定义是：1小时内，50u l反应体积中，降解 1ug的底物DNA所需的酶为一个活力单位。因此酶：DNA的反应 比例可以由此确定。较小的反应体积更容易受到移液器误差的影 响。为了将甘油的浓度控制在 5%以下，要注意酶的体积不要超 过总体积的10%(一般酶都贮存于50%的甘油中)。七、混合 这是非常重要然而常常被忽略的一步。想要反应完全，必须使反 应液充分混合。我们推荐用枪反复吸取混合，或是用手指轻弹管 壁混合，然后再快速离心一下即可。注意：不可振荡！八、反应温度大部分酶的反应温度为37C；从嗜热菌中分离出来的内切酶则 要求更高的温度。一般为50-65C不等。参看第244页Activity of thermophiles at 37C。九、反应时间 1酶活单位的定义时间为1小时。如果加入的酶较多，可以相应 地缩短反应时间；反之，如果加入的酶量较少，也可以延长时间 以使反应达到完全。参见第241页酶在反应中的存活时间。十、 终止反应如果不进行下一步酶切反应，可用终止液来终止反应。在NEB我 们使用如下反应终止液：50%的甘油，50mM EDTA （pH8.0）,和 0.05%溴酚蓝（10ul/50ul反应液）。如果要进行下一步酶切反 应，可用热失活法终止反应（65C或85C, 20分钟）。热失活并 不能适用于所有的酶，详情参见第240页热失活表。此外，酚/ 氯仿抽提也可以用于终止反应。十一、贮存大部分酶应贮存于-20C。少部分酶则须在-70C长期保存。详情 请参见相关酶的DATA SHEET或目录相关部分。10X BUFFER和 100XBSA于-20C保存。BSA不能与NEBuffer混合后保存，否则 将会出现BSA沉淀。十二、稳定性 每隔1-2个月都会对所有的酶有一个活性检测；最近的一次检测 结果将被贴在售出的每一管酶上。通过三十多年来的经验，我们 发现大部分酶在推荐的保存缓冲液里在-20C条件下十分稳定。 高于-20C条件下稳定性将有所降低。十三、对照反应如果发现您的 DNA 底物不能被成功切开，可以进行对照实验以查 明原因。具体方法如下：将不加内切酶的底物DNA （待切底物） 与加入了内切酶的对照DNA （有多个已知酶切位点）同时进行反 应。若实验结果表明底物DNA降解，则说明DNA在纯化过程中或 反应液里引入了核酸酶污染；若实验结果发现底物DNA保持完整, 而对照DNA被成功切开，则可以排除酶质量的原因，此时可以将 对照DNA和待切底物DNA混合起来再次进行反应，以确定样品中 是否有抑制剂。如果有抑制剂存在（通常是盐、EDTA或酚），则 混合物里的对照DNA也无法被切开。