分子简答题

2011-2012 真题的简答题。1生物体内哪些机制保证了 DNA复制的保真性.答：DNA聚合酶的校对作用；RNA引物起始复制可减少复制错误；修复系统有多种机制 (光修复、切除修复、错配修复、易错修复、SOS修复)和酶。2 有一个被认为是 mRNA 的核苷酸序列，长 3000个碱基，你怎样才能;(1)证明 次RNA是mRNA而不是tRNA或rRNA (2)确定它是真核还是原核mRNA.答：使用oligo DT,对这个RNA做反转录，如果获得相应的cDNA，那这个序列就是 真核mRNA,(或使用oligo DT的柱子检测是否是真核mRNA。如果能被柱子吸附上，就是 真核mRNA。)因为真核mRNA的末端的具polyA尾巴可以和oligoDT互补。否则可能是 tRNA，rRNA或原核mRNA。在被侧序列的5和3端分别加上特异的寡聚接头并用RNA 酶连接，以5端特异寡聚接头设计的引物及3端特异接头序列扩增被测序列。测序并进行序 列比对分析鉴定其是否有SD序列，如果具有SD序列则为原核mRNA.3 真核生物组蛋白修饰有哪些？以目前的研究成果，在活跃转录的基因启动子 区哪种组蛋白修饰最常见？答：真核生物组蛋白修饰有：磷酸化、甲基化、乙酰化、ADP核糖基化。H3、H4修饰作 用较普遍，H2B有乙酰化作用、H1有磷酸化作用。催化蛋白乙酰化反应的是组蛋白乙酰化转移酶(HAT)。HAT主要由2类：一类与转录 有关，另一类与核小体组装以及染色质的结构有关。许多转录激活因子都有HTA活性。TAF II250组蛋白乙酰基转移酶是TAFIID复合酶的一个亚基，它的一个主要功能是与启动子结 合协助起始转录，能使组蛋白H3和H4乙酰化。组蛋白乙酰基转移酶是转录共激活子，通 过与增强子结合蛋白相互作用来调节转录，能使组蛋白乙酰化。乙酰化中和了组蛋白尾巴的 正电荷，降低了它与DNA的亲和性，导致核小体构象发生有利于转录调节蛋白与染色质相 结合的变化，从而提高了基因转录的活性。4说明真核生物表达调控的不同层次。并请说明最重要的调控环节答：(1) DNA和染色体水平的调控。包括：基因重排、基因扩增、DNA修饰、基因封闭、 核小体的修饰(染色体结构)。(2) 录水平的调控：包括转录起始、延伸的弱化、终止都会对mRNA前体水平产生影响， 是重要的调控水平。(3) 转录后RNA前体加工及转运的调控.真核生物转录和翻译不偶联，转录出的mRNA前提 经加工才能成熟为翻译模板mRNA，此过程包括剪切、修饰、编辑、5和3端的修饰及 转运到翻译场所等。(4) 翻译水平的调控：包括核糖体的磷酸化/去磷酸化调节，poly(A)的调节，移码和通读等等。(5) 翻译后水平调控：包括翻译产物的剪切、修饰(如糖基化、磷酸化、切除信号肽、脂化 及构象形成、转运和装配形成复合蛋白体)(6) mRNA 降解的调控，随生长发育和外界环境改变、细胞中蛋白质种类也在不断变化，原 有mRNA要降解并以新mRNA代之，因此mRNA是有一定寿命的、细胞中有控制mRNA 寿命的机制。转录水平的调控是重要的调控水平,真核生物在转录水平上的调节主要是通过反式作用 因子、顺式作用元件和RNA聚合酶的相互作用来完成的。当反式作用因子和顺式元件结合 后，将影响转录起始复合物的形成，从而影响转录的起始和效率。a、启动子和增强子的顺式作用元件真核细胞基因的启动子由一些分散的保守序列组成，其中包括TATA框、CAAT框和多 个GC框等，后两个均属于上游控制元件，由增强子、沉默子及其应答元件进一步调节转录 活性。增强子能促进转录，他由比较集中的保守序列组成，增强子具有组织特异性，他优先 或只能在某种类型的细胞中表现功能，增强子常存在与DNA酶的超敏感部位。增强子与启 动子之间距离对活性并无影响，因为DNA可以弯曲，结合在增强子的反式激活因子能与转 录复合物相作用，位于增强子的应答元件可调节增强子的活性。b、调节转录的反式作用因子 调解和控制转录活性的蛋白质有三类：基本转录因子、上游因子和可诱导因子。基本转 录因子结合在TATA框和转录起点，与RNA聚合酶一起形成转录起始复合物；上游因子结 合在启动子和增强子的上游控制位点；可诱导因子与应答元件相互作用。所有结合DNA的 反式作用因子都有结合DNA的结构域，并由一些共同的结构结合DNA的基序结构主要有： 螺旋-转角-螺旋，锌指结构，亮氨酸拉链，螺旋-环-螺旋等。5分别说出7中以上RNA的功能答：(1) RNA作为病毒基因组。在有些病毒中不含DNA，而是以RNA作为遗传信息的 携带者。(2) RNA在蛋白质生物合成中起重要作用。mRNA起信使和模板的作用,tRNA起转运氨 基酸和信息转换的作用,rRNA起核糖体装配和催化的作用。(3) RNA 参与转录后加工、编辑和修饰。 RNA 转录后加工、编辑和修饰依赖于各类小 RNA 和其蛋白质复合物。(4) RNA 具有重要的催化功能和其它持家功能。(5) RNA对基因表达和细胞功能具有重要调节作用，如RNA干扰。(6) RNA在生物进化中起重要。作用核酶可以自身切割、剪接切割其它RNA，合成肽键。(7) 非编码RNA是一类不编码蛋白质但具有功能的RNA分子，它们在生物体重要生命活 动中发挥着极广泛的调控作用。6.以乳糖操纵子为例画图说明原核基因的组织方式，操纵子的正调控和负调控。乳糖操纵子图：调廿棊因终止于启动子皐凶结构慕因终止于p 1Ji0/acZlacYlac At* 1imTt MA+111厂i o o o o （ 0 o o （ atn ）PU迟蛋白半乳揀晋醋川-半乳糖 疔-半乳衞(1) 操纵子的基本组成(组织方式)：操纵子是原核基因表达调控的一种重要的组织形式。A：结构基因群：乳糖操纵子含有z、y和a 3个结构基因。z基因长3510bp，编码含 1170个氨基酸、分子量为135,000的多肽，以四聚体形式组成有活性的0-半乳糖苷酶，催 化乳糖转变为半乳糖(allolactose),再分解为半乳糖和葡萄糖；y基因长780bp，编码有260 个氨基酸、分子量为30,000的半乳糖透过酶，促使环境中的乳糖进入细菌；a基因长825bp, 编码 275 氨基酸、分子量为32,000的转乙酰基酶，以二聚体活性形式催化半乳糖的乙酰化B： 启动子区：操纵子至少有一个启动子，一般在第一个结构基因5侧上游，控制整 个结构基因群的转录。启动子一般可分为识别(R, recognition)、结合(B, binding)和起始(I, initiation)三个区段。转录起始第一个碱基(通常标记位置为+1)最常见的是A；在-10bp附 近有TATAAT一组共有序列，因为这段共有序列是Pribnow首先发现的，称为Pribnow盒 (Pribnow box)；在-35bp处又有TTGACA 一组共有序列。C：操纵区：乳糖操纵子中，其操纵区6)序列位于启动子(p)与被调控的基因之间, 部分序列与启动子序列重叠。这段双链DNA具有回文(palindrome)样的对称性一级结构, 能形成十字形的茎环(stem loop)构造。阻遏蛋白与操纵区结合，就妨碍了 RNA聚合酶与 启动子的结合及其后B -半乳糖苷酶等基因的转录起始，从而阻遏了这群基因的表达。D：调控基因：调控基因(regulatory gene)是编码能与操纵序列结合的调控蛋白的基因。 调控蛋白有阻遏蛋白(repressive protein)和 激活蛋白(activating protein)。(2) 操纵子的正调控和负调控阻遏蛋白：与操纵区结合后能减弱或阻止其调控的基因转录，其介导的调控方式为负调 控(negative regulation)；激活蛋白(activating protein)：与操纵区结合后能增强或起动其调控的 基因转录，所介导的调控方式为正调控(positive regulation) o当大肠杆菌在没有乳糖的环境中生存时，lac操纵子处于阻遏状态。此i基因在其自身 的启动子Pi控制下，低水平、组成性表达产生阻遏蛋白R,每个细胞中仅维持约10个分子 的阻遏蛋白。R以四聚体形式与操纵子o结合，阻碍了 RNA聚合酶与启动子Plac的结合， 阻止了基因的转录起动。R的阻遏作用不是绝对的，R与o偶尔解离，使细胞中还有极低水 平的卩一半乳糖苷酶及透过酶的生成。当有乳糖存在时，乳糖受卩一半乳糖苷酶的催化转变为别乳糖，与R结合，使R构 象变化，R四聚体解聚成单体，失去与o的亲和力，与o解离，从而解除了阻遏蛋白的作用， 基因转录开放，使卩一半乳糖苷酶在细胞内的含量可增加1000倍。这就是乳糖对lac操纵 子的诱导作用。7.如果一种突变的菌株合成的g因子与核心酶不易解离，对RNA合成可能产生什么影响？ 答：RNA聚合酶全酶与DNA模板的结合比核心酶紧密得多。RNA合成起始之后，突变的O因子不能及时解离，极大地降低了 RNA聚合酶沿模板移动的速度。因此该突变株的RNA 合成比野生型慢得多。补充：O因子是一种非专一性蛋白，作为所有RNA聚合酶的辅助因子起作用。O因子是 DNA依赖的RNA聚合酶的固有组分，它识别启动子共有序列且与全酶结合。O因子通常与 DNA结合，且沿着DNA搜寻，直到在启动子碰到核心酶。它与DNA的结合不需依靠核心 酶。10-11真题2简述真核生物和原核生物mRNA转录过程在启动子结构、启动子识别、转录 终止和转录后加工方面的差异。(1) 原核生物mRNA以多顺反子的形式存在，真核生物mRNA 一般以单顺反子形式存在。真 核生物mRNA有5端帽子结构(m7G)和3端的Poly(A)尾巴，真核细胞的前mRNA有许多 内含子(会被加工剪接为成熟的 mRNA)。(2) 原核生物中RNA聚合酶可以直接起始转录合成RNA ，真核生物则不能。在真核生物 中，三种RNA聚合酶都必须在蛋白质转录因子的协助下才能进行RNA的转录。(3) 原核细胞转录终止需要一种终止因子p (四个亚基构成的蛋白质)的帮助。真核DNA 转录单元的3端均含富有AT的序列如AATAA（A）或ATTAA（A）等，在相隔030bp之后 又出现TTTT顺序（通常是35个T）,这些结构可能与转录终止或者与3端添加多聚A 顺序有关。（4）原核生物mRNA的转录与翻译一般是偶联的，真核生物转录的mRNA前体需经过转录后 加工，加工为成熟的mRNA与蛋白质结合生成信息体后才开始翻译。（5）原核生物mRNA半衰期短，一般为几分钟，最长只有数小时。真核生物mRNA的半衰期 较长。3.简述真核生物和原核生物蛋白质翻译过程在mRNA结构、起始密码子识别方面 的差异。原核与真核生物mRNA的结构特点：原核生物mRNA 一般5端有一段不翻译区，称前导顺序，3端有一段不翻译区，中间是蛋 白质的编码区，一般编码几种蛋白质。真核生物mRNA（细胞质中的）一般由5端帽子结构、 5端不翻译区、翻译区（编码区）、3端不翻译区和3端聚腺苷酸尾巴构成分子中除m7G 构成帽子外，常含有其他修饰核苷酸，如m6A等。真核生物mRNA通常都有相应的前体。从 DNA转录产生的原始转录产物可称作 原始前体（或mRNA前体）。一般认为原始前体要经 过hnRNA核不均-RNA的阶段，最终才被加工为成熟的mRNA。起始密码子识别方面的差异：（1）真核生物核糖体是80S（40S+60S）;eIF种类多（10多种）； 起始氨酰-tRNA是met-tRNA（不需甲酰化），mRNA没有SD序列;mRNA在小亚基上需5端帽 子结构和帽结合蛋白以及eIF2;mRNA先于met-tRNA结合到小亚基上.（2）原核生物核糖体是 70S（30S+50S）;IF种类少（3种）；起始氨酰-tRNA是fmet-tRNA（需甲酰化）；需SD序列与 16S-tRNA配对结合,rps-1辩认识别序列;小亚基与起始氨酰-tRNA结合后，才mRNA结合. 7 请结合自己所在实验室的研究工作，说明分子生物学在本专业领域的应用。在分子水平上研究生命现象的科学。通过研究生物大分子（核酸、蛋白质）的结构、功能和 生物合成等方面来阐明各种生命现象的本质，如遗传信息的传递，基因的结构、复制、转录、 翻译、表达调控和表达产物的生理功能，以及细胞信号的转导等。分子生物学理论及技术在各个研究过程中具有重要作用，例如PCR技术。在实验中PCR 技术主要用于在生物体外扩增特定的 DNA 片段，鉴定目的条带等，这种方法简便、快速。 PCR主要由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加 热至94C左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成 为单链，以便它与引物结合；模板DNA与引物的退火：模板DNA经加热变性成单链后， 温度降至55C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模 板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基 互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环 变性-退火-延伸三个过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循 环的模板。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 从而可以用电泳进行 真核生物：翻译与转录不偶联，mRNA在核内合成、经加工修饰到胞液指导蛋白质合成， mRNA半寿期约4-6小时（最短1小时，最长48小时）较稳定，易分离。mRNA为单顺反 子，只有一个起始及一个终止点，一个mRNA分子只合成一种蛋白质；中间有内含子。（插 入顺序）需加工剪掉；起始与肽链延长均需要GTP和ATP。延伸阶段GTP水解后可被ATP 再磷酸化，两种延伸因子可同时与核蛋白体结合，GTP水解后EF-1不掉下来无mRNA时 小亚基先与起始甲酰蛋氨酰，只有一种终止因子，为二聚体，能识别终止密码并与GTP相 互作用。合成速度慢。原核生物：翻译与转录偶联，边转录，边翻译，边降解omRNA半寿期1-3分钟，不稳定, 不易分离。为多顺反子，一个mRNA分子合成几种 蛋白质，需要GTP,?GTP水解后EF-Tu 从核蛋白体上掉下来。有三种终止因子。合成速度快。1. 蛋白翻译起始在原核生物和真核生物中的主要不同是什么？真核生物mRNA具有m7GpppNp帽子结构，mRNA5端的“帽子”和3端的多聚A都参与 形成翻译起始复合物。(2) 原核生物的起始tRNA是fMet-tRNAfMet,而真核生物是Met-tRNAMet；(3) 原核生物中30S小亚基首先与mRNA模板相结合，再与fMet-tRNAfMet结合,最后与50S 大亚基结合。而在真核生物中，40S小亚基首先与Met-tRNAMet相结合，再与模板mRNA 结合，最后与60S大亚基结合生成80SmRNAMet-tRNAMet起始复合物。(4) 原核生物mRNA上5末端通过SD序列与核糖体结合；真核生物核糖体上有专一位点或 因子识别mRNA的帽子，使mRNA与核糖体结合。除了帽子结构以外，40S小亚基还能识 别mRNA上的起始密码子AUG。(5) 真核生物mRNA与核糖体小亚基结合时需要ATP，可能蛋白质合成中消除mRNA二级 结构需ATP水解提供能量。原核生物蛋白质翻译的起始：1.30 S小亚基首先与翻译起始因子IF-1，IF-3结合，通过SD序列与mRNA摸板相结合。2. 在IF-2和GTP的帮助下,fMet-tRNAfMet入小亚基的P位,tRNA上的反密码子与mRNA 上的起始密码子配对，形成中间复合体。3. 带有tRNA, mRNA，三个翻译起始因子的小亚基复合物与50 S大亚基结合，GTP水解， 释放翻译起始因子。真核生物蛋白质翻译的起始：真核生物蛋白质生物合成的起始机制与原核生物基本相同，其差异主要是核糖体较大，有较 多的起始因子参与，其mRNA具有m7GpppNp帽子结构，Met-tRNAMet不甲酰化，mRNA 分子有5端的帽子和3端的多聚A都参与形成翻译起始复合物。2. 细菌和原核生物的起始因子有哪些？它们的作用是什么？ 翻译起始因子，即翻译起始所必需的特异蛋白因子。与核糖体、信使核糖核酸、起始转 移核糖核酸等组成动态翻译起始复合体。原核起始因子(1) PIF1：增强PIF2和PIF3的活化，并稳定起始复合物。进入核糖体30S小亚基的A位 点。(2) PIF2:引导起始的氨基酰-tRNA进入核糖体30S小亚基的P位点。(3) PIF3:阻止核糖体大、小亚基的结合,mRNA与30S小亚基结合所必需(mRNA起始 密码子AUG上游的SD序列与16S rRNA 3端富含嘧啶的区域识别结合)。进入30S小亚基 的 E 位点。真核起始因子真核生物的翻译起始因子目前已鉴定的有12种，如下：eIF1：识别AUG起始密码子； elFlA：结合到核糖体40S亚基上以助于形成游离的40S亚基，阻止60S亚基的结合；协助 三联体复合物结合到40S亚基，与IF1同源；eIF2：参与形成eIF2GTPMet-tRNAimet三联 体复合物；eIF2A：抑制IRES介导的翻译起始；eIF2B： eIF2的鸟苷酸交换因子；eIF3:结 合到 40S 亚基上以助于形成游离的 40S 亚基，阻止 60S 亚基的结合；作为结构中心，帮助 其他eIF结合到40S亚基上；帮助eIF4FmRNA的复合物定位到40S亚基上；eIF4B：激活 eIF4F的活性；eIF4F：识别mRNA的5端帽子；RNA解旋酶；作为结构中心，帮助其他 eIF结合到40S亚基上；eIF4H：激活eIF4F的活性；eIF5：三联体复合物的GTP酶激活蛋 白，参与多因子复合物的组装；eIF5A：激活60S亚基的结合，协助80S亚基构象的改变； eIF5B：核糖体依赖的GTP酶，结合60S亚基，与IF2同源；eIF6：结合60S亚基以阻止40S 亚基的结合？原核生物翻译起始因子的作用：IF-1:结合到30s亚基的A位点上，阻止氨酰 tRNA与A位结合，阻止30s亚基和50s亚基结合。IF-2：使fMet-tRNA特异的结合到P位 点上，与GTP结合为70亚基的形成提供能量。IF-3:使30S亚基与mRNA的特异位点结 合，能保持30s亚基的稳定性，阻止30s亚基和50s亚基结合。3.蛋白翻译是怎么终止的？蛋白质翻译的基本过程为：识别、水解、解离肽链的延伸过程中，当终止密码子UAA、UAG或UGA出现在核糖体的A位时，没有 相应的AA- tRNA能与之结合，而释放因子RF能识别这些密码子并与之结合，水解P位上 多肽链与tRNA之间的二酯键。接着，新生的肽链和tRNA从核糖体上释放，核糖体大、小 亚基解体，蛋白质合成结束。释放因子RF具有GTP酶活性，它催化GTP水解，使肽链与 核糖体解离。释放因子有两类。I类释放因子识别终止密码子，并能催化新合成的多肽链从P位点的tRNA 中水解释放出来；II类释放因子在多肽链释放后刺激I类释放因子从核糖体中解离出来。细 菌细胞中存在三种不同的释放因子，其中RF1和RF2为I类释放因子。RF1能识别并作用 与UAG和UAA，RF2识别并作用于UGA和UAA。RF3：促进RF1和RF2从核糖体中释 放，具有GTP酶活性。一旦RF与终止密码子结合，它们就能诱导肽基转移酶把一个水分 子而不是氨基酸加到延伸中的肽链上。RF3为II类释放因子，与核糖体的解离有关。真核细 胞的I类和II类释放因子分别只有一种，eRF1和eRF3oI类释放因子eRF1能够识别三个 终止密码子。