《蛋白质的化学修饰》PPT课件

化学修饰的原理化学修饰的原理化学修饰的方法学化学修饰的方法学蛋白质侧链的修饰蛋白质侧链的修饰蛋白质肽链的交联蛋白质肽链的交联亲和标记亲和标记蛋白质化学修饰的应用蛋白质化学修饰的应用内内 容容 提提 要要（第九讲）（第九讲）三、羧基的修饰三、羧基的修饰用水溶性碳二亚胺作催化剂，通过胺专一地修饰蛋白质中的羧用水溶性碳二亚胺作催化剂，通过胺专一地修饰蛋白质中的羧基。基。ENZOCO+HNNCRRH+C+ENZHHONCON RRC+ENZHHONCON RR+HXENZOCXC+HHNON RRH+C+ENZHHONCON RRCHNONRRHENZOC+碳二亚胺碳二亚胺形成相应酰胺形成相应酰胺重排重排四、巯基的修饰四、巯基的修饰由于半胱氨酸时蛋白质中反应性最强的残基，所以很多试剂可用由于半胱氨酸时蛋白质中反应性最强的残基，所以很多试剂可用来修饰巯基侧链。来修饰巯基侧链。常用的有三类：常用的有三类：1.碘乙酸、碘乙酰胺或环乙烯亚胺碘乙酸、碘乙酰胺或环乙烯亚胺2.马来酰亚胺或马来酸酐马来酰亚胺或马来酸酐3.有机汞试剂有机汞试剂（一）（一）1类试剂是烷化剂，此类试剂还能与类试剂是烷化剂，此类试剂还能与甲硫氨酸甲硫氨酸、赖氨酸赖氨酸或或 组氨酸组氨酸反应。反应。ENZS+ICH2COO-pH7ENZCH2+SCOO-I-碘乙酸碘乙酸半胱氨酸半胱氨酸副反应：副反应：HENZNN+ICH2COO-ENZCH2NNH+COO-I-+组氨酸组氨酸CH3ENZSICH2COO-+pH=2CH3CH2ENZ+SCOO-I-NH2ENZICH2COO-+甲硫氨酸甲硫氨酸HNCH2HENZ+COO-I-+（二）（二）2类试剂能与类试剂能与巯基巯基形成对形成对酸稳定酸稳定的衍生物，而与其它基团的衍生物，而与其它基团形成的产物则对形成的产物则对酸不稳定酸不稳定。HENZSCH3CH2ONO+pH 5CCH3CHCCH2ONHENZCOSH副反应：副反应：NH2ENZCH3CH2ONO+pH 7CCH3CHNCCH2HONHENZCOH半胱氨酸半胱氨酸（三）（三）3类试剂对类试剂对巯基专一性最强巯基专一性最强。常用的是对氯汞苯甲酸，。常用的是对氯汞苯甲酸，S-汞汞-N-5-二甲氨基萘磺酰半胱氨酸是对氯汞苯甲酸的衍生物，也可与二甲氨基萘磺酰半胱氨酸是对氯汞苯甲酸的衍生物，也可与巯基反应。巯基反应。马来酸酐马来酸酐ENZCH2HSCOO-HgCl+ENZ CH2SCOO-HgH+Cl对氯汞苯甲酸对氯汞苯甲酸+N（CH3）2SO2NHCHCOOHCH2SHg+S-汞汞-N-5-二甲氨基萘磺酰半胱氨酸二甲氨基萘磺酰半胱氨酸ENZSN（CH3）2SO2NHCHCOOHCH2SHgHENZS（四）（四）5，5-二硫双硝基苯甲酸（二硫双硝基苯甲酸（DTNB）也常用于修饰）也常用于修饰巯基巯基，它与半胱氨酸形成混合二硫化物。它与半胱氨酸形成混合二硫化物。HENZS+SCOO-OOCO2NSNO2ENZSCOO-SNO2+H+SCOO-NO2DTNB2-硝基硝基-5-硫代苯甲酸硫代苯甲酸释放出的释放出的2-硝基硝基-5-硫代苯硫代苯甲酸阴离子在甲酸阴离子在412nm处有处有吸收，可用光谱法测定其吸收，可用光谱法测定其含量。含量。五、组氨酸咪唑基的修饰五、组氨酸咪唑基的修饰常用试剂是焦碳酸二乙酯和碘乙酸。常用试剂是焦碳酸二乙酯和碘乙酸。NHHONCNNHONCNCH2COO-NHONCNCH2COO-+NHONCNCH2COO-CH2COO-1-羧乙基组氨酸羧乙基组氨酸3-羧乙基组氨酸羧乙基组氨酸1，3-二羧乙基组氨酸二羧乙基组氨酸HENZNN+CCH3CCH2OOOOOCH2CH3pH 47+HOCH2CH3CO2+焦碳酸二乙酯焦碳酸二乙酯碘乙酸碘乙酸ICH2COO-+ICH2COO-+CCH3CH2ENZNNOO用碘乙酸烷化组氨酸用碘乙酸烷化组氨酸残基可得单取代或双残基可得单取代或双取代衍生物。取代衍生物。焦碳酸二乙酯能使咪唑环上的一个氮原子羧乙基化焦碳酸二乙酯能使咪唑环上的一个氮原子羧乙基化.羟胺可使反应可逆进行，回收组氨酸。羟胺可使反应可逆进行，回收组氨酸。NH2OH+pH=7CCH3CH2ENZNNOOHENZNNCCH3CH2HNOHOO+羟胺羟胺六、色氨酸吲哚基的修饰六、色氨酸吲哚基的修饰（一）（一）N-溴琥珀酰亚胺（溴琥珀酰亚胺（NBS）常用来修饰色氨酸。）常用来修饰色氨酸。它氧化吲哚基成为羟吲哚衍生物。酪氨酸也能与它氧化吲哚基成为羟吲哚衍生物。酪氨酸也能与NBS作用。作用。（二）各种苄基卤化物能使吲哚环烷基化（二）各种苄基卤化物能使吲哚环烷基化最常用的是最常用的是2-羟基羟基-5-硝基苄基溴，由于溶解度的问题，常用硝基苄基溴，由于溶解度的问题，常用它的类似物二甲基（它的类似物二甲基（2-羟基羟基-5-硝基苄基）锍盐。硝基苄基）锍盐。应注意应注意的问题的问题该试剂在水介质、高该试剂在水介质、高pH下不稳定，迅速水解为下不稳定，迅速水解为CO2和乙醇。和乙醇。试剂大大过量时可与咪唑环上的两个氮都作用，形成双取代衍试剂大大过量时可与咪唑环上的两个氮都作用，形成双取代衍生物。生物。羟胺不能使双取代物发生可逆反应，而是清除咪唑环。羟胺不能使双取代物发生可逆反应，而是清除咪唑环。NO2CH2BrOHENZNH2-羟基羟基-5-硝基苄基溴硝基苄基溴+NO2ENZNHCH2OH+HBrENZNHNO2ClS醋酸醋酸+NO2ENZNHS+H+Cl-对氯硫硝基苯对氯硫硝基苯带硝基苯取代基的硫基卤化物的专一性与锍盐类似，但能产生单带硝基苯取代基的硫基卤化物的专一性与锍盐类似，但能产生单一产物，避免了锍盐修饰产物的不均一性，而且产物的光谱性质一产物，避免了锍盐修饰产物的不均一性，而且产物的光谱性质可用来定量测定色氨酸。可用来定量测定色氨酸。七、酪氨酸酚基的修饰七、酪氨酸酚基的修饰四硝基甲烷在温和条件下可高度专一地硝化酪氨酸残基，产生可四硝基甲烷在温和条件下可高度专一地硝化酪氨酸残基，产生可电离的发色基团电离的发色基团3-硝基酪氨酸。硝基酪氨酸。色氨酸色氨酸八、甲硫氨酸甲硫基的修饰八、甲硫氨酸甲硫基的修饰用用H2O2和过甲酸可将甲硫氨酸氧化成甲硫氨酸亚砜，用碘乙酸和过甲酸可将甲硫氨酸氧化成甲硫氨酸亚砜，用碘乙酸烷化甲硫氨酸残基，能形成正甲硫盐。烷化甲硫氨酸残基，能形成正甲硫盐。九、丝氨酸羟基的修饰九、丝氨酸羟基的修饰甲苯磺酰氟（甲苯磺酰氟（PMSF)可与丝氨酸残基作用。可与丝氨酸残基作用。ENZOHCHC(NO2)4+ENZOHNO2CH-C(NO2)3+H+四硝基甲烷四硝基甲烷3-硝基酪氨酸硝基酪氨酸试试 剂剂修修 饰饰 的的 侧侧 链链Lys Glu Cys Arg Ser His Tyr Trp Met醋酸酐醋酸酐 酰基酸酐酰基酸酐 醛醛 N-溴琥珀酰亚胺溴琥珀酰亚胺 碳二亚胺碳二亚胺 苯异硫氰苯异硫氰 四硝基甲烷四硝基甲烷 三硝基苯磺酸三硝基苯磺酸 焦碳酸二乙酯焦碳酸二乙酯 碘乙酸碘乙酸 环乙烯亚胺环乙烯亚胺 甲苯磺酰氟甲苯磺酰氟 马来酰胺马来酰胺 常用重要修饰剂的专一性常用重要修饰剂的专一性第四节第四节 蛋白质肽链的交联蛋白质肽链的交联双功能试剂：具有两个反应活性部位，可以在相隔较近的两个氨双功能试剂：具有两个反应活性部位，可以在相隔较近的两个氨基酸残基间搭桥、形成多肽链内、多肽链间或者蛋白质分子之间基酸残基间搭桥、形成多肽链内、多肽链间或者蛋白质分子之间的交联，而不引起蛋白质构象的重大改变的试剂。的交联，而不引起蛋白质构象的重大改变的试剂。一、设计或选择交联剂要考虑的因素一、设计或选择交联剂要考虑的因素（一）反应的专一性（一）反应的专一性交联剂交联剂分为分为同型双功能试剂同型双功能试剂异型双功能试剂异型双功能试剂（二）交联距离（二）交联距离随着交联剂两个功能基之间距离跨度的增加，形成交联的可能性随着交联剂两个功能基之间距离跨度的增加，形成交联的可能性也随之增加。也随之增加。（三）可裂解性（三）可裂解性研制可裂解交联剂有助于分离和表征交联片断。研制可裂解交联剂有助于分离和表征交联片断。（四）反应活性部分（四）反应活性部分可以在某种程度上控制交联剂的反应部位，可以通过交联剂反应可以在某种程度上控制交联剂的反应部位，可以通过交联剂反应活性部位的疏水性、亲水性或电荷来控制反应。活性部位的疏水性、亲水性或电荷来控制反应。二、交联剂的类型二、交联剂的类型交联剂交联剂类型类型同型双功能试剂同型双功能试剂异型双功能试剂异型双功能试剂可被光活化试剂可被光活化试剂.可裂解性可裂解性不可裂解性不可裂解性反应基团反应基团间隔基团间隔基团反应基团反应基团CH3OCNH2CH3OCNH2同型双功能试剂同型双功能试剂(CH2)n，长度可变，长度可变SSN异型双功能试剂异型双功能试剂（-S-（CH2）n-）2可被硫醇裂解可被硫醇裂解长度可变长度可变OCCHOH（）2可被高碘酸裂解可被高碘酸裂解亚氨酯亚氨酯光活化双功能试剂光活化双功能试剂OHN3CNCF3OCNOC Cl能与胺反能与胺反应的基团应的基团能与巯基反能与巯基反应的基团应的基团（一）同型双功能试剂（一）同型双功能试剂交联剂两端具有相同的反应活性部分。交联剂两端具有相同的反应活性部分。双亚氨酯，可与氨基反应。两端间的间隔基团是（双亚氨酯，可与氨基反应。两端间的间隔基团是（CH2）nOCNH2(CH2)nClCH3OC CH3NH2Cl若间隔基团含有二硫桥，则成为可裂解同型双功能试剂。若间隔基团含有二硫桥，则成为可裂解同型双功能试剂。CSCH3ONH2Cl(CH2)2CSCH3ONH2Cl(CH2)2所有同型双功能试剂都对氨基有专一性，但戊二醛例外，它所有同型双功能试剂都对氨基有专一性，但戊二醛例外，它除了与氨基反应外，还可与羟基反应。除了与氨基反应外，还可与羟基反应。双亚氨酸酯（非裂解）双亚氨酸酯（非裂解）二甲基二甲基-3，3-二硫代二硫代-双丙基亚氨酯（可裂解）双丙基亚氨酯（可裂解）（二）异型双功能试剂（二）异型双功能试剂这类试剂的一端与氨基作用，另一端与巯基侧链作用，但用碳二这类试剂的一端与氨基作用，另一端与巯基侧链作用，但用碳二亚胺时，另一端反应基团是羧基。亚胺时，另一端反应基团是羧基。这类交联剂的一端含有氨基反应部分，这类交联剂的一端含有氨基反应部分，N-羟琥珀酰亚胺，另一羟琥珀酰亚胺，另一端含有巯基反应部分，马来酰亚胺或联硫基。端含有巯基反应部分，马来酰亚胺或联硫基。COON(CH2)3OO2N-羟琥珀酰亚胺辛二酸酯羟琥珀酰亚胺辛二酸酯（非裂解）（非裂解）CSO(CH2)2SONOONN-琥珀酰胺琥珀酰胺-3-（2-吡啶二硫吡啶二硫代代)丙酸酯丙酸酯（三）可被光活化的试剂（三）可被光活化的试剂这类试剂是异型双功能试剂的扩展。这类试剂是异型双功能试剂的扩展。当交联剂一端的反应基团与蛋白质作用之后，经光照另一端则产当交联剂一端的反应基团与蛋白质作用之后，经光照另一端则产生一个反应活性部分，这部分即可是碳烯，也可是氮烯。生一个反应活性部分，这部分即可是碳烯，也可是氮烯。这类交联剂一端一般含有能与氨基或巯基反应的基团，而另一端这类交联剂一端一般含有能与氨基或巯基反应的基团，而另一端则含有对光敏感的基团。则含有对光敏感的基团。三、交联剂的使用三、交联剂的使用蛋白质与交联剂的反应直接有助于蛋白质构象的稳定性蛋白质与交联剂的反应直接有助于蛋白质构象的稳定性交联剂可用来测定蛋白质亚基的量交联剂可用来测定蛋白质亚基的量能形成分子间的交联键，使蛋白质对变性稳定。能形成分子间的交联键，使蛋白质对变性稳定。两种酶通过交联形成杂化酶。两种酶通过交联形成杂化酶。交联可提高酶分子构象的稳定性。交联可提高酶分子构象的稳定性。可测定齐聚体蛋白质的分子量和亚基数目。可测定齐聚体蛋白质的分子量和亚基数目。测定蛋白质上残基间的距离。测定蛋白质上残基间的距离。测定酶的活性部位。测定酶的活性部位。第五节第五节 亲和标记亲和标记亲和标记：部位专一性标记，是利用酶和底物的亲和性，亲和标记：部位专一性标记，是利用酶和底物的亲和性，使用与酶底物类似的修饰剂，对酶活性部位上的氨基酸使用与酶底物类似的修饰剂，对酶活性部位上的氨基酸残基进行共价标记。残基进行共价标记。亲和试剂作为底物类似物的标准：亲和试剂作为底物类似物的标准：1.在使蛋白质不可逆失活以前，亲和试剂要与酶形成可逆复合物；在使蛋白质不可逆失活以前，亲和试剂要与酶形成可逆复合物；2.亲和试剂的修饰程度是有限的；亲和试剂的修饰程度是有限的；3.没有反应性的竞争性配位体的存在，应减弱亲和试剂的反应速没有反应性的竞争性配位体的存在，应减弱亲和试剂的反应速 度；度；4.亲和试剂的体积不能太大，否则产生空间位阻；亲和试剂的体积不能太大，否则产生空间位阻；5.修饰产物应当稳定，便于表征和定量。修饰产物应当稳定，便于表征和定量。亲和试亲和试剂分类剂分类内生亲和试剂内生亲和试剂外生亲和试剂外生亲和试剂一、内生亲和试剂一、内生亲和试剂IO4-+ENZ-(CH2)4-NH2NaBH4O-ATP与氨基反应与氨基反应过碘酸氧化的过碘酸氧化的ATP（O-ATP）与氨基侧链的可能反应与氨基侧链的可能反应希夫碱化合物希夫碱化合物OOOHOHNH2NNNNCH2OPOOOONH2NNNNCH2POOHHOOPOOOO POOCCOOONH2NNNNCH2HHORC(CH2)4ENZCNOOHNH2NNNNCH2OR(CH2)4ENZCH2H2CHN+ENZ-(CH2)4-NH2+ENZ-CH2SHO-ATPO-ATP与巯基反应与巯基反应与氨基反应与氨基反应过碘酸氧化的过碘酸氧化的ATP（O-ATP）与赖氨酸侧链的可能反应）与赖氨酸侧链的可能反应过碘酸氧化的过碘酸氧化的ATP（O-ATP）与巯基侧链的可能反应）与巯基侧链的可能反应吗啉型加合物吗啉型加合物OONH2NNNNCH2POOHHOOPOOOO POOCCOOONH2NNNNCH2POOHHOOPOOOO POOCCOOOOHNH2NNNNCH2OR(CH2)4ENZNHOONH2NNNNCH2HOORCCH2SCHHENZ缺点：产生的缺点：产生的二醛二醛几乎全部与赖氨酸侧链反应，不能与几乎全部与赖氨酸侧链反应，不能与更多类型侧链反应。更多类型侧链反应。嘌呤核苷酸的烷基卤化衍生物也可看作是亲和试剂，各种亲和嘌呤核苷酸的烷基卤化衍生物也可看作是亲和试剂，各种亲和侧链如侧链如Cys、His、Lys、Met等能与试剂上的卤原子反应。等能与试剂上的卤原子反应。OPOOPOOOOPOOOHCH2AdenOCH2OPOOOOPCH2AdenClOCH2OOOPCH2AdenClCH2ATP腺苷腺苷-5-氯代甲烷焦磷酸酯氯代甲烷焦磷酸酯腺苷腺苷-5-(-磷酸磷酸氯乙酯）氯乙酯）Aden-为腺苷为腺苷ATP的烷基卤化衍生物的烷基卤化衍生物由于这两种试剂由于这两种试剂的结构与的结构与ATP相相似，才看作是内似，才看作是内生亲和试剂。生亲和试剂。二、外生亲和试剂二、外生亲和试剂（一）将卤代烷基衍生物通过腺嘌呤的（一）将卤代烷基衍生物通过腺嘌呤的N-6连到腺嘌呤连到腺嘌呤上，则可形成有效的外生亲和试剂。上，则可形成有效的外生亲和试剂。N-6-对对-溴乙酰胺溴乙酰胺-苄基苄基-ADP（二）通过腺嘌呤核苷酸的磷酸基可加入另一类反应（二）通过腺嘌呤核苷酸的磷酸基可加入另一类反应基团。基团。OOOOOPOCH2AdenSF腺苷腺苷-5-(对对-氟磺酰苯酰氟磺酰苯酰磷酸磷酸）这类试剂对赖氨酸这类试剂对赖氨酸和酪氨酸的反应性和酪氨酸的反应性很强。很强。合成具有两个反应基的嘌呤合成具有两个反应基的嘌呤核苷酸衍生物，它既含卤代核苷酸衍生物，它既含卤代烷基部分又含二羰丁基部分，烷基部分又含二羰丁基部分，不仅对能与卤代烷反应的侧不仅对能与卤代烷反应的侧链有专一性，还对精氨酸残链有专一性，还对精氨酸残基有专一性。基有专一性。OOPOOOHNNNNCH2ONHCOCH2BrOHCHNH（三）光亲和试剂是一类特殊的外生亲和试剂。（三）光亲和试剂是一类特殊的外生亲和试剂。优点：光活化产生的自由基（碳烯或氮烯）能无选择地与各优点：光活化产生的自由基（碳烯或氮烯）能无选择地与各类侧链反应。类侧链反应。8-叠氮腺苷三磷酸叠氮腺苷三磷酸芳基叠氮芳基叠氮-丙氨酸丙氨酸NAD试剂中的光亲和基团试剂中的光亲和基团是通过核糖的羟基连是通过核糖的羟基连接的。接的。ONH2OOPOOOPOCOOHNH2NNNNO(CH2)2COOHNHN3NO2NOOHOHNH2OOOOPOOOPOOOOHNNNNCH2OOHN3P叠氮衍生物可看作是内生亲和试剂，而芳基叠氮衍生物叠氮衍生物可看作是内生亲和试剂，而芳基叠氮衍生物是外生亲和试剂。是外生亲和试剂。第六节第六节 蛋白质氨基酸的敏化光氧化蛋白质氨基酸的敏化光氧化蛋白质的敏化光氧化：当敏化剂与蛋白质共存时，若用可见光蛋白质的敏化光氧化：当敏化剂与蛋白质共存时，若用可见光照射，则敏化剂产生化学变化，使蛋白质侧链氧化。照射，则敏化剂产生化学变化，使蛋白质侧链氧化。敏化光氧化需分子氧，而启动光氧化反应的是处于激发三重态的敏化光氧化需分子氧，而启动光氧化反应的是处于激发三重态的敏化剂。敏化剂。敏化光氧化的反应机理，有两种解释：敏化光氧化的反应机理，有两种解释：1.敏化光氧化并不决定于敏化剂与蛋白质之间的结合。敏化光氧化并不决定于敏化剂与蛋白质之间的结合。2.蛋白质先与三重态的敏化剂发生专一性的结合反应，产生蛋白质先与三重态的敏化剂发生专一性的结合反应，产生自由基离子，再与分子氧反应，形成蛋白质氧化产物。自由基离子，再与分子氧反应，形成蛋白质氧化产物。影响光敏化反应效率和选择性的主要因素是敏化剂对蛋白质的影响光敏化反应效率和选择性的主要因素是敏化剂对蛋白质的结合作用。结合作用。使用能与蛋白质共价结合的敏化剂，可以了解某些氨基酸残基使用能与蛋白质共价结合的敏化剂，可以了解某些氨基酸残基在蛋白质空间构象中配置情况，也可测定蛋白质中包埋的和暴在蛋白质空间构象中配置情况，也可测定蛋白质中包埋的和暴露的基团。露的基团。第七节第七节 蛋白质化学修饰的应用蛋白质化学修饰的应用一、用来测定蛋白质分子中某种氨基酸的数量一、用来测定蛋白质分子中某种氨基酸的数量常用方法常用方法:对氯苯甲酸与巯基作用；对氯苯甲酸与巯基作用；三硝基苯磺酸与氨基作用三硝基苯磺酸与氨基作用;荧光胺与氨基作用等。荧光胺与氨基作用等。二、在蛋白质序列分析中的应用二、在蛋白质序列分析中的应用（一）控制酶解程度（一）控制酶解程度用三氟乙酰法将用三氟乙酰法将Lys的的-NH2保护起来保护起来变成酶不能水解的产物。变成酶不能水解的产物。通过化学修饰将通过化学修饰将Cys转变成转变成S-氨乙酰氨乙酰-Cys通过化学修饰将通过化学修饰将Ser转变成转变成S-氨乙酰氨乙酰-Cys例如用胰蛋白酶只水解精氨酸形成的肽键。例如用胰蛋白酶只水解精氨酸形成的肽键。如果要增加胰蛋白酶水解位置。如果要增加胰蛋白酶水解位置。NHCH CONHSSCH2CH2CHNHCONH还原剂还原剂胱氨酸胱氨酸NHCH CONHSHCH2半胱氨酸半胱氨酸CH2CH2NHNHCH CONHSNH2CH2CH2CH2S-氨乙酰氨乙酰-半半胱氨酸基胱氨酸基环乙烯亚胺环乙烯亚胺NHCH CONHOHCH2XClNHCH CONHOXCH2SHNH2CH2CH2丝氨酸基丝氨酸基（二）化学裂解（二）化学裂解用化学方法裂解肽键是常用方法。用化学方法裂解肽键是常用方法。普遍采用的是用溴化氰专一裂解普遍采用的是用溴化氰专一裂解Met的羧基所形成的肽键。的羧基所形成的肽键。用硫醇、硼氢化钠、亚硫酸盐等裂解蛋白质中的二硫键。用硫醇、硼氢化钠、亚硫酸盐等裂解蛋白质中的二硫键。三、在杂化实验中的应用三、在杂化实验中的应用催化亚基催化亚基Cn四硝基甲烷四硝基甲烷硝化亚基硝化亚基（活力保持（活力保持8090%）磷酸吡哆醛磷酸吡哆醛吡哆醛化亚基吡哆醛化亚基四氢邻苯四氢邻苯二甲酸酐二甲酸酐酰化催化亚基酰化催化亚基催化亚基催化亚基Cn调节亚基调节亚基R修饰亚基修饰亚基Ct重组重组CnRCnCnRCtCtRCt（活力丧失（活力丧失90%）重组分子（杂化分子）重组分子（杂化分子）