资源描述
叶片和根系中SOD、POD、CAT、MDA的测定研究表明逆境胁迫可使植物体内活性氧的产生和消除平衡失调，造成植物体内大量的自 由基累计，进而膜脂结构的损伤和加速植物的衰老进程。测定植物体内膜脂过氧化产物MDA 的含量及植物体内抗氧化酶SOD、POD的活性高低，可在一定程度上反映逆境对植物的损 害程度合作植物的衰老进程。关于干旱、渍水、盐害和高温等逆境胁迫对作物候期衰老的影 响的研究已有不少报道，但是在不同根土空间对作物衰老方面的研究尚不多见。张永清等研 究表明高粱在不同根土空间下，根土空间缩写降低了 SOD、POD的含量，而对于不同配置 及水分条件下棉花根系及地上部生理活性的研究较少因此探讨不同根系空间条件下对棉花 根系生理特性、棉花后期衰老的影响。测定部位： 地上部：倒四叶 地下部：上层（0-20cm）中层（20-40cm）下层（40-80 cm）根样一磷酸缓冲液的配制：B液：0.2M的KHP0溶液 称取分析纯KH PO 27.216克，用蒸馏水定容至1000毫升。2 4 2 4A液：0.2M的K HPO溶液 称取分析纯K HPO3H O45.644克，用蒸馏水定容至1000毫升。24242或（B液：0.2M的NaH P0溶液 称取分析纯NaH P02H 0 31.21克，用蒸馏水定容至100024242毫升。A液：0.2M的NaHP 0溶液 称取分析纯Na HPO12H 0 71.64克，用蒸馏水定容至242421000毫升。）二、酶液的制备：称取 0.5g 放入研钵中，加 5 毫升 PH=7.8 的磷酸缓冲液，冰浴研磨，匀 浆倒入离心管中，冷冻离心 20 分钟（10000 转/分钟），上清液（酶液）倒入试管中，置于 04oC下保存待用。SOD （超氧化物歧化酶）的测定：1.SOD 反应液的配制：母液的配制：（1）0.05M 磷酸缓冲液（PH=7.8）： B 液 2125ml+A 液 228.25ml 定容至 1000ml;（2）130mM Met（甲硫氨酸）：取1.9399克Met用磷酸缓冲液定容至100ml；（3）750 uM四氮唑蓝（NBT）：取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml；（4）100 u M EDTA-N:取0.0372g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml，避光保存;（5）20uM FD （核黄素）:0.00753gFD用磷酸缓冲液定容至1000ml。SOD反应液：磷酸缓冲液：Met： NBT： EDTA-N:核黄素（FD）： H2O的比例为15： 3：3：3：3：2.5，按母液顺序配制。2.SOD的测定：取三支试管，取型号相同的试管（以保证一致性），吸取200微升的酶液， 加入3 （试管）X4毫升SOD反应液，4000Lux照光30分钟，一支作对照（不加酶液, 以缓冲液代替）；一支作空白（加酶液和SOD反应液）置暗处，对照（CK）与酶液同 置于4000Lux条件下照光30分钟，遮光保存，以空白调零，560nm比色。3.结果计算SOD 总活性（吸光度/g FW） = （AckAe）XV+ /（WX0.5XAckXV*）单位：NBT光还原50%为单位SOD比活性（酶单位/mg蛋白）=SOD总活性/蛋白质浓度四、pod （过氧化物歧化酶）的测定：1. 0.1m PH6.0磷酸缓冲液的配制：B液219.25+A液30.75，定容至500毫升；2. POD反应液的配制：0.1M PH 6.0的磷酸缓冲液50毫升于烧杯中，加入愈创木酚28微 升，磁力搅拌器加热搅拌使之完全溶解，冷却后加入 30%H2O219 微升混合，保存于冰 箱中。3. POD的测定：100微升酶液+3毫升反应液于比色皿中，在470nm下每隔1分钟读数一 次，共读三次（即4个数据，求平均值），以每分钟吸光度变化值（AA470/min mg pr 或A A470/ mgFW）表示酶活力的大小。4. 结果计算：POD 活性一（A A470/min gFW） = A A470 X V/Va/W= A A470 X 5/0.02/0.5= AA470X500三、MDA （丙二醛）的测定1、原理植物组织中的丙二醛（MDA）在酸性条件下加热可与硫代巴比妥酸（TBA）产生显色反 应，反应产物为粉红色的3, 5, 5 一三甲基恶唑2, 4 一二酮（Trimetnine）。该物质在532nm 波长下有吸收峰。由于硫代巴比妥酸也可与其它物质反应，并在该波长处有吸收，为消除硫 代巴比妥酸与其它物质反应的影响，在丙二醛含量测定时，同时测定600nm下的吸光度，利 用532nm与600nm下的吸光度的差值计算丙二醛的含量。2、材料、仪器、药品2. 1仪器：（1）分光光度计；（2）离心机；（3）水浴锅：（4）天平；（5）研钵；（6）剪刀； （7） 5ml 刻度离心管；（9）刻度试管（10ml）； （10）镊子；（11）移液管（5ml、2ml、1ml）； （12） 冰箱。2.2 MDA反应液的配置：称取3gTBA （硫代巴比妥酸），先用少量1 MNaOH（4gNaOH用蒸馏水定容到100ml）溶解，然 后用10%TCA （三氯乙酸50g定容到500ml）定容到500ml。2、MDA的测定：取1ml酶液，再加1mlPH=7.8的磷酸缓冲液稀释，然后加4mlTBA溶液，煮沸15分钟， 再离心比色（4000转）；空白组加2ml蒸馏水和4mlTBA溶液，也煮沸15分钟。迅速冷却后 于450、532、600nm波长下，以空白调零，测定吸光度。3、结果计算：C （umol/L） =6.45X（A532-A600） - （0.56XA450）MDA （umol/gfw） =C （umol/L）XV （ml）X（V1/V2）/WV:反应体系总体积（ml）6mlV1:提取液总体积（ml）5mlV2：测定时用提取液体积（ml） 1mlW:样品鲜重（g）0.5g四、过氧化氢酶活性的测定（CAT）【原理】H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光 度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。酶促反应体系由3ml 20mmol/LH 0溶液(30%H0 1.794m l稀释至300ml)和100ul酶提取液2 2 2 2组成。以蒸馏水为参比空白,在反应15S时开始记录反应体系在波长240nm处的吸光值，作为 初始值，然后每隔30S记录一次，连续测定，至少获取6个点的数据。重复3次。记录反应体系在240nm处的吸光度，制作OD240值随时间变化曲线，根据曲线的初始线性部分 (从时间1到F)计算每分钟吸光度变化值OD240.OD240=(OD -OD )/(t-t )240F240IF I式中，aOD240为每分钟反应混合物吸光度变化值;AOD为反应混合液吸光度终止值;AOD240F240I为反应混合液吸光度初始值；t为反应终止时间始时(min)； t为反应初始时(min)。Fl以每克植物组织样品(鲜重)每分钟吸光度变化值减少 0.01为反应混合液吸光度 (min); tl为反应初为1个过氧化氢酶活性单位,单位是0.01OD240/(min.g)。计算公式U= OD240XV/0.01XV XmS式中,v为样品提取液总体积(ml);Vs为测定时所取样品提取液体积(ml);m为样品质量(g)。
展开阅读全文