显微镜的七种观察方法.ppt

） 显微镜的七种观察方法 按观察方法分七种 明场 暗场 荧光 偏光 相差 DIC 霍夫曼 显微观察方式 按观察方法分 7-1 1.明场 :照明光直接通过聚 光镜入射于试样，并透过试样后 进入物镜并最终被观察到。 明 场 明场观察方式 常规观察方式 应用领域： 常规镜检、病理、染色标本 优点： 视野亮度高、均匀， 应用范围广， 操作简单，价格低， 物镜适用于荧光观察 缺点： 透明标本对比度低， 标本没有立体感 按观察方法分 7-2 2.暗场 :照明光通过物镜外 围射于试样，来自试样的干涉及 衍射光进入物镜并最终被观察到。 暗 场 1 原理 丁道尔 (Tyndall)现象，微粒对斜射光反射或衍射，增 大了人眼可见性。 2 特点 观察到极其微小物体，分辨率可达 0.02 0.004 um (明场 0.4um) ”超显微“。 3 缺点 只能观察到物体存在、运动和外部形态 不方便调节 标本要求高（灰尘、盖片、载片） 4 应用： 微小粒子、细菌形态观察 、细菌记数，透明标本观 察等 按观察方法分 7-3 3.荧光 :利用 某些物质在受 到了紫外光或短波长的光激发照 射以后能够发射出比激发光波长 长的荧光的特性的观察方法 荧 光 什么是荧光 ? 物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为 高能状态，再回到低能状态时释放出的光，是非 温度辐射光 冷光。即：物质吸收短波光，发 射出的长波光。 显微镜荧光利用光源激发 光化荧光 荧光的种类 自发（固有）荧光 二次荧光 荧光的性质 吸收光，必需有激发光源 荧光波长激发波长（损失热能） 荧光强度极小于激发光的强度 有不同程度的衰减 荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、 荧光效率 荧光显微镜的优点和用途 优点： 检出能力高（放大作用） 对细胞的刺激小（可以活体染色） 能进行多重染色 用途： 物体构造的观察 荧光素 荧光的有无、色调比较进行物质判别 抗体 荧光等 发荧光量的测定对物质定性、定量分析 荧光显微镜的种类 透射式 荧光显微镜的种类 落射式 荧光显微镜的主要部件 透射式 汞灯光源 激发滤色镜 吸收滤色镜 暗场聚光镜 落射式 汞灯光源 激发滤色镜 分色镜 吸收滤色镜 落射荧光显微镜的构造 吸收滤色镜 激发滤色镜 落射荧光显微镜的构造 荧光显微镜光源 汞灯光源 : 提供激发光 (U、 V、 B、 G) 氙灯光源： 高峰值更宽，更稳定 荧光显微镜激发透镜组 激发 滤色镜 : 激发波长选择 激发透镜组 （激发块） : T% nm BAND PASS 入射光 发射光 激发 滤色镜 分光 滤色镜 吸收 滤色镜 落射荧光显微镜各部件特性和 作用 吸收滤色镜 : 荧光透过 ,阻挡杂光 分色镜 : 反射激发光 ,荧光透过 A 透过 A A 反射 B B 透过 B 阻挡 nm nm T% T% A 落射荧光显微镜各部件特性和 作用 吸收滤色镜 : 荧光透过 ,阻挡杂光 分色镜 : 反射激发光 ,荧光透过 A 透过 A A 反射 B B ， C 透过 nm nm T% T% A C 滤色镜的选择 荧光素 激发波长 发射波长 DAPI 372 456 AMCA 350 450 Hoechst 33258 365 465 FITC 490 520 Acridine Orange 490 590 Acridine Yellow 470 550 CY3 552 565 TRITC 541 572 Propidium Iodide 530 615 荧光素的特性 滤色镜的特性 激发 分色 吸收 带宽对图象的影响 SWB: BP420-480 WB: BP450-480 WIB: BP460-490 NB: BP470-490 FITC+PI 多重染色标本的多色观察 FITC+Texas Red+DAPI 三色滤色镜的特性曲线 激发 分色 吸收 双重染色标本的单色和双色观 察 WU WIB DUAL BAND WIBA WIG WIB DAPI+FITC FITC+PI 单色滤色镜的特性曲线 双色滤色镜的特性曲线 现行显微镜特点和各种滤色镜 自由组合 激 发块 吸收滤色镜 激发滤色镜 分色镜 油 镜 应 使 用 荧 光 油 物镜光栏 的运用 光栏全开启 光栏适当关小 减少杂散光干扰 荧光的衰减 防衰减的方法 使用抗衰减剂 选择衰减小的荧光素 降低激发光强度 降低标本中氧的浓度 有衰减的标本 使用抗衰减剂的效果 汞灯灯箱构造 灯室，上下、左右旋钮，聚光镜旋钮 按观察方法分 7-4 4.偏光 :有些 物质在两个呈 一定夹角的偏光滤片之间可现呈 鲜明的对比，或根据双折射性能 和定向呈现颜色 偏 光 1 原理 依据波动光学原理观察和精密测定标本细节 ,或透明物体改变光束的物理参数 ,以 此判别物质结构的一种显微镜 自然光（多 振动面） 偏振器 1 偏振器 2 偏振光（单 一振动面） 各向同性：单折射体，光性质不因照射方向而改变，普 通气体、液体、非结晶固体等 各向异性：双折射体，光速度、折射率、吸收和振动面、 振幅随照射方向不同，晶体、纤维等 应用： 矿物质、化学物品鉴别 鉴别纤维、染色体、淀粉粒、细胞中晶体 植物病理检验 鉴别骨骼、牙齿、胆固醇、神经纤维、肿 瘤细胞、横纹肌和毛发等 偏光显微镜主要用于检测矿石 ,地质大学会用 到 ,特别是可以用来鉴定珠宝 ,另外可以检测生 物内骨骼 ,这个我还没有遇见实例 ,还可以检测 生物化学结晶 ,化学院用来观察结晶液像 ,其他 在纺织物品化学成分上检测上 ,物理芯片上等 , 凡是观察双折射晶体会使用偏光显微镜 。 按观察方法分 7-5 5.相衬（差） :利用光线通 过分别处于聚光镜与物镜的一对互 补的光环后产生干涉（强度叠加或 减弱），即相位差转变成了光强差， 从而可清楚观察到使原来不易看清 的透明类样品（即相位物体，如活 细胞）。 相 差（衬） 相 差（衬） 1 原理 利用被检物体的光程（折射率 x 厚度）差进行镜检，即利用干涉现象，将相位差 变为人眼可以分辨的振幅差 共轭面：吸收光线，直射光通过 补偿面：相位推迟，衍射光通过 物镜相 板 聚光镜环状光阑 2 特点 鉴定活体细胞最实用、最经济的方法 3 缺点 需要光强高 切片不能太厚 (510um) 盖片、载片需符合标准 最好配用单色滤光镜 操作较麻烦 荧光效果不如明场物镜 4 应用： 无色透明活体标本的细微结构，检查 ,鉴定活体细胞 (培养细胞 ,分离细胞 ) 按观察方法分 7-6 6.DIC:照明光由微分干涉对比 棱镜变为两束衍射光，并使样品高 度差异造成在光路上的微小差异， 而光路差异变为利用微分干涉对比 棱镜和检偏振器的明暗对比。有时 也利用敏感色板（波长补偿片）， 加强了高度差异的颜色变化。 DIC 相衬 DIC微分干涉相衬 1 原理 通过特制的棱镜将偏振光分解相互垂直，强度相等的光束，光束载极近的两点 （小于显微镜的分辨率）上通过被检物体，从而在相位上略有差别，使图象呈现 出立体三维感觉。 2 特点 可以使被检物体产生三维立体感觉 观察效果更直观 无须特殊物镜，与荧光观察配合更好 可以调节背景和物体的颜色变化而达到理想的 效果。 3 缺点 需要光强高，双折射物质不能达到 DIC镜检效果，不能应用于塑料容器培养 物的观察，镜检灵敏度有方向性，调节较复杂 4 应用： 无色透明活体标本的细微结构，无色荧光标本， 染色标本，显微操作等 按观察方法分 7-7 7.霍夫曼 :光线穿过设于聚光 镜内的狭缝光阑后并经 “ 相位物体 ” （透明体）折射，再经过专用物镜 内的具有暗、灰、明三个区的一块 滤光片，而最终使光线按折射角的 不同呈明暗的变化，其所成的像也 类似 DIC那样具有浮雕效果。 霍 夫 曼 1 原理 斜射光照射到标本产生折射、衍射，光 线通过物镜光密度梯度调节器产生不同 阴影，从而使透明标本表面产生明暗差 异，增加观察对比度。 2. 历史 1975年， Robert Hoffman 博士发明 2002年，专利到期，各显微镜厂家纷纷推出采用以自己 名义命名的 RC技术产品 3. 特点 提高未染色标本的可见性和对比度； 图象显示阴影或近似三维结构而不会产生光晕； 可检测双折射物质 (岩石切片、水晶、骨头 ) ； 可检测玻璃 ,塑料等培养皿中的细胞 ,器官和组织； 聚光镜的工作距离可以设计的更长； RC物镜也可用于明场 ,暗场和荧光观察 4. 缺点 观察效果与标本方向密切相关 操作较复杂 必须有多元件 ,结构复杂的高数值孔径 RC物镜 观察荧光效果不如明场物镜 5. 应用 所有类型的细胞，组织（无论活体，染色，未 染色），晶体表面细节，透明聚合物，玻璃 和其它类似材料，尤其适用于显微操作