高中生物选修一课件集

1.制作果酒制作果酒酵母菌酵母菌2.制作果醋制作果醋醋酸菌醋酸菌菌种菌种名称名称生物学生物学分类分类代谢代谢类型类型适宜适宜温度温度繁殖方繁殖方式式对氧的需求对氧的需求酵母菌酵母菌真核生真核生物物异养异养兼性厌氧兼性厌氧最适最适2020出芽生出芽生殖殖前期需氧，前期需氧，后期不需氧后期不需氧醋酸菌醋酸菌 原核生原核生物物异养异养需氧需氧30303535二分裂二分裂一直需氧一直需氧三、繁殖方式和代谢类型三、繁殖方式和代谢类型（3.33.53.33.5）（5.46.35.46.3）C6H12O6+6O2+6H2O 6CO2+12H2O+能量能量酶酶C6H12O6 2C2H5OH+2 CO2+酶酶酵母菌酵母菌制酒制酒酶酶 C6H12O6 3CH3COOH（醋酸）（醋酸）酶酶酶酶2CH3CHO+O2 2CH3COOH（醋酸）（醋酸）醋酸菌醋酸菌制醋制醋 选择新鲜的葡萄，榨汁前先将葡萄进行冲洗，选择新鲜的葡萄，榨汁前先将葡萄进行冲洗，除去枝梗。除去枝梗。、取葡萄、取葡萄500g500g，去除枝梗和腐烂的叶子。，去除枝梗和腐烂的叶子。、用清水冲洗葡萄、用清水冲洗葡萄1 12 2次除去污物。次除去污物。讨论：讨论：你认为应该先冲洗葡萄还是先除去枝梗？你认为应该先冲洗葡萄还是先除去枝梗？为什么？为什么？应该先冲洗，然后再除去枝梗，以避免除应该先冲洗，然后再除去枝梗，以避免除去枝梗时引起葡萄破损，增加被杂菌污染的机会去枝梗时引起葡萄破损，增加被杂菌污染的机会划分标准划分标准培养基种类培养基种类特点特点用途用途物理性质物理性质化学成分化学成分天然培养基天然培养基合成培养基合成培养基用途用途鉴别培养基鉴别培养基培养基的种类培养基的种类不加凝固剂不加凝固剂加凝固剂，如琼脂加凝固剂，如琼脂工业生产工业生产观察微生物的运动、观察微生物的运动、分类鉴定分类鉴定微生物分离、鉴定、微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌活菌计数、保藏菌种种含化学成分不明确的天然物含化学成分不明确的天然物质质工业生产工业生产培养基成分明确培养基成分明确分类、鉴定分类、鉴定在培养基中加入某种化学物在培养基中加入某种化学物质质,以抑制不需要的微生物以抑制不需要的微生物的生长的生长,促进所需要的微生促进所需要的微生物的生长物的生长培养、分离出特培养、分离出特定微生物定微生物在培养基中加入某种指示剂在培养基中加入某种指示剂或化学药品或化学药品,用以鉴别不同用以鉴别不同种类的微生物种类的微生物鉴别不同种类微鉴别不同种类微生物生物选择培养基选择培养基液体培养基液体培养基半固体培养基半固体培养基固体培养基固体培养基允许允许特定种类特定种类的微生物生长，同时的微生物生长，同时抑制或阻止抑制或阻止其他种类其他种类微生物生长的培养基，叫做微生物生长的培养基，叫做选择培养基选择培养基尿素尿素尿素尿素以尿素为以尿素为唯一氮源唯一氮源的培养基的培养基牛肉膏牛肉膏蛋白胨蛋白胨培养基培养基是是分离分离尿素尿素细菌细菌判断该判断该培养基培养基有无选有无选择性择性实验组实验组对照组对照组培养基类型培养基类型是否是否接种接种目的目的结果结果只生长尿只生长尿素细菌素细菌生长多种生长多种微生物微生物是是在设计实验时，一定在设计实验时，一定要涂布至少要涂布至少3 3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性与准确性。在分析实验结果时，。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验重新实验。计算公式：计算公式：每克样品中的菌株数每克样品中的菌株数=（CV）M某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每克样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1ml）()A.2.34108B.2.34109C.234D.23.4B（三）设置对照（三）设置对照判断培养基中是否有杂菌污染：判断培养基中是否有杂菌污染：将未接种的培养基同时进行培养。将未接种的培养基同时进行培养。判断选择培养基是否具有筛选作用：判断选择培养基是否具有筛选作用：完全培养基（营养成分齐全）接种后培养完全培养基（营养成分齐全）接种后培养观察菌落数目。观察菌落数目。主要目的是排除实验组中非测试因素对实验主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。结果的影响，提高实验结果的可信度。从肥沃、酸碱度接近中性的湿润土壤中取样。先从肥沃、酸碱度接近中性的湿润土壤中取样。先铲去表层土铲去表层土3 cm3 cm左右，再取样，将样品装入事先左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。准备好的信封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为稀释倍数为103107。准备准备牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基和和选择培养基。选择培养基。每个稀释每个稀释度下需要度下需要3个选择培养基，个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基。还个牛肉膏蛋白胨培养基。还需要需要8个灭菌试管和个灭菌试管和1个灭菌移液管个灭菌移液管。将稀释相同倍数的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上将稀释相同倍数的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显生长的菌落数目应明显多于多于选择培养基上的数目，因此，选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了基是否起到了选择选择作用。作用。问题：问题：为什么分离不同的微生物要采用不同的稀为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？实验时要实验时要对培养皿作对培养皿作好标记。注好标记。注明培养基类明培养基类型、培养时型、培养时间、稀释度、间、稀释度、培养物等。培养物等。1 1、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。2 2、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。形瓶中，塞好棉塞。3 3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。注明培养基种类、培养日期、平板培养样品注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。的稀释度等。三、三、由高度分化的植物组织或细胞产由高度分化的植物组织或细胞产生愈伤组织的过程。也叫去分化生愈伤组织的过程。也叫去分化脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化成根或芽等器官的过程又可以重新分化成根或芽等器官的过程接种后的锥形瓶最好放在无菌箱中培养。培养接种后的锥形瓶最好放在无菌箱中培养。培养期间应定期消毒。培养温度期间应定期消毒。培养温度18221822，每日用，每日用日光灯光照日光灯光照12h12h专题4酶的研究与应用课题1 果胶酶在果汁 生产中的作用一、课题目标一、课题目标 1.1.简述果胶酶的作用；简述果胶酶的作用；2.2.检测果胶酶的活性；检测果胶酶的活性；3.3.探究温度和探究温度和pHpH对果胶酶活性的对果胶酶活性的影响以及果胶酶的最适用量；影响以及果胶酶的最适用量；4.4.搜集有关果胶酶应用的资料。搜集有关果胶酶应用的资料。二、课题重点与难点二、课题重点与难点 课题重点：课题重点：温度和温度和pHpH对果胶酶活性的影响。对果胶酶活性的影响。课题难点：课题难点：果胶酶的最适用量。果胶酶的最适用量。三、基础知识分析三、基础知识分析 知识要点知识要点:1.1.果胶酶的作用；果胶酶的作用；2.2.酶的活性的定义；酶的活性的定义；3.3.影响酶活性的因素；影响酶活性的因素；4.4.果胶酶的用量。果胶酶的用量。(一)细胞壁的结构及作用：作用是什么？作用是什么？特点？特点？结构组成？结构组成？保护植物细胞；支撑植物细胞弹性小；全透性纤维素、果胶1.1.果胶果胶植物细胞壁及细胞之间胞间层的成分植物细胞壁及细胞之间胞间层的成分 植物细胞壁以及胞间层的主要组成成植物细胞壁以及胞间层的主要组成成分之一，它是由分之一，它是由半乳糖醛酸半乳糖醛酸聚合而成的聚合而成的一种一种高分子化合物高分子化合物，不溶于水。，不溶于水。果胶果胶:在果汁加工中，果胶不仅会影响出汁在果汁加工中，果胶不仅会影响出汁率，还会使果汁浑浊。果胶酶能够分解率，还会使果汁浑浊。果胶酶能够分解果果胶胶，瓦解植物细胞的，瓦解植物细胞的细胞壁细胞壁及及胞间层胞间层，使，使榨取果汁更容易，而果胶分解成可溶性的榨取果汁更容易，而果胶分解成可溶性的半乳糖醛酸半乳糖醛酸，也使得浑浊的果汁变得澄清。，也使得浑浊的果汁变得澄清。果胶酶果胶酶 果胶酶并不特指某一种酶，而是分解果胶酶并不特指某一种酶，而是分解果胶的一类酶的总称，包括果胶的一类酶的总称，包括多聚多聚半乳糖半乳糖醛酸醛酸酶酶、果胶分解酶果胶分解酶和和果胶脂酶果胶脂酶等。等。果胶酶果胶酶:2.2.酶的活性与影响酶活性的因素酶的活性与影响酶活性的因素 指酶催化一定化学反应的能力。酶反指酶催化一定化学反应的能力。酶反应速度用应速度用单位时间单位时间内内单位体积单位体积中中反应物反应物的减少量的减少量或或生成物的增加量生成物的增加量来表示来表示.(1)(1)酶的活性酶的活性(2)(2)影响酶活性的因素影响酶活性的因素 a.a.温度温度b.pHb.pH C.酶的抑制酶的抑制剂剂.果胶酶的用量果胶酶的用量()探究温度和探究温度和pH对酶活性的影响对酶活性的影响四、实验设计1、设计实验方案、设计实验方案 A、确定温度确定温度/PH梯度（梯度（5C0/10C0）/PH5、6、7、8 探究控制温度探究控制温度/PH的方法和措施的方法和措施 你的实验变量是什么？如何设定？你的实验变量是什么？如何设定？B、确定水果的种类、确定水果的种类确定制备果汁的方确定制备果汁的方法法 确定实验用的水果用量确定实验用的水果用量 确定果胶酶的确定果胶酶的用量用量控制测定果胶酶活性的方法控制测定果胶酶活性的方法()探究温度和pH对酶活性的影响 2、实验操作步骤：、实验操作步骤：制备水果泥制备水果泥配制果胶酶配制果胶酶水果泥与果胶酶分别水浴保温水果泥与果胶酶分别水浴保温将水果泥和果胶酶混合保温将水果泥和果胶酶混合保温过滤出果汁过滤出果汁记录果汁量记录果汁量改变不同的温度改变不同的温度/PH后重复以上实验后重复以上实验()探究温度和pH对酶活性的影响3、设计记录数据的表格、设计记录数据的表格4、得出结论与分析：、得出结论与分析：画曲线图；最适温度画曲线图；最适温度/PH是是温度温度/PH果汁果汁量量/ml在实际的操作过程中，还需要注意下列事项：在实际的操作过程中，还需要注意下列事项：1 1与其他工业用酶基本相同，果胶酶的与其他工业用酶基本相同，果胶酶的适宜温度范围也比较宽泛，因此，可以选用适宜温度范围也比较宽泛，因此，可以选用10 10 作为温度梯度，设置的具体温度为作为温度梯度，设置的具体温度为10 10、20 20、30 30、40 40、50 50 和和60 60 等，等，也可以尝试以也可以尝试以5 5 作为温度梯度。作为温度梯度。2 2苹果、橙子和葡萄等水果都可以作为苹果、橙子和葡萄等水果都可以作为反应物，水果不用去皮。如用苹果为原材料，反应物，水果不用去皮。如用苹果为原材料，一般可按每个中等大小的苹果加水一般可按每个中等大小的苹果加水100100200 200 mLmL的比例进行搅拌，获得稀的苹果泥。的比例进行搅拌，获得稀的苹果泥。3 3果泥的用量可以采用果泥的用量可以采用5 mL5 mL左右，果左右，果胶酶的用量可采用质量浓度为胶酶的用量可采用质量浓度为2%2%的果胶酶的果胶酶溶液溶液2 mL2 mL。4 4水浴时间可以为水浴时间可以为202030 min30 min。5 5过滤果汁时，漏斗中应放置滤纸。过滤果汁时，漏斗中应放置滤纸。6 6探究探究pHpH对果胶酶活性的影响，只须对果胶酶活性的影响，只须将温度梯度改成将温度梯度改成pHpH梯度，并选定一个适宜梯度，并选定一个适宜的温度进行水浴加热。反应液中的的温度进行水浴加热。反应液中的pHpH可以可以通过体积分数为通过体积分数为0.1%0.1%的氢氧化钠或盐酸溶的氢氧化钠或盐酸溶液进行调节。液进行调节。()探究果胶酶的用量探究果胶酶的用量 探究果胶酶的用量是建立在探究最适温探究果胶酶的用量是建立在探究最适温度和度和pHpH对果胶酶活性影响的基础之上的。对果胶酶活性影响的基础之上的。此时，研究的变量是此时，研究的变量是 ，其他因素，其他因素都应都应 。果胶酶的用量果胶酶的用量保持不变保持不变方案方案：可以配制不同浓度的果胶酶溶液，：可以配制不同浓度的果胶酶溶液，也可以只配制一种浓度的果胶酶溶液，然也可以只配制一种浓度的果胶酶溶液，然后使用不同的体积即可。需要注意的是，后使用不同的体积即可。需要注意的是，反应液的反应液的pH必须相同，否则将影响实验必须相同，否则将影响实验结果的准确性。结果的准确性。五、结果分析与评价五、结果分析与评价 根据实验数据绘制出的温度和根据实验数据绘制出的温度和pHpH对对果胶酶活性影响的曲线图；果胶酶活性影响的曲线图；不同果胶酶用量对出汁量影响的曲不同果胶酶用量对出汁量影响的曲线图（在浓度和体积相同的条件下）；线图（在浓度和体积相同的条件下）；果胶酶最适温度、果胶酶最适温度、pHpH以及果胶酶以及果胶酶的最适用量。的最适用量。六、本课题知识小结六、本课题知识小结 课题课题3血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离主要内容：主要内容：一、基础知识一、基础知识二、实验操作二、实验操作一、基础知识一、基础知识-凝胶色谱法（分配色谱法）凝胶色谱法（分配色谱法）1 1、凝胶：、凝胶：一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖）道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖）2 2、概念：、概念：根据相对分子质量的大小分离蛋白质的根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法有效方法3 3、原理：、原理：分子量分子量大大小小直径大小直径大小大于大于凝胶颗粒空凝胶颗粒空隙直径，被阻挡隙直径，被阻挡在颗粒的外面在颗粒的外面小于小于凝胶颗粒空凝胶颗粒空隙直径，可以进隙直径，可以进入颗粒内部入颗粒内部运动方式运动方式垂直向下移动垂直向下移动垂直向下移动，垂直向下移动，无规则扩散进入无规则扩散进入颗粒内部颗粒内部运动速度运动速度较快较快较慢较慢运动路径运动路径较短较短较长较长洗脱次序洗脱次序先从先从凝胶柱洗脱凝胶柱洗脱出来出来后从后从凝胶柱洗脱凝胶柱洗脱出来出来一、基础知识一、基础知识-4 4、具体过程、具体过程一、基础知识一、基础知识-1 1、概念：、概念：在一定的范围内，能对抗外来少在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PHPH发发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。冲作用的溶液叫做缓冲溶液。缓冲溶液：缓冲溶液：2 2、作用：、作用：能够抵制（能够抵制（）对溶）对溶液（液（）的影响，维持）的影响，维持PHPH基本不基本不变。变。外界的酸或碱外界的酸或碱pHpH值值3 3、缓冲溶液的配制、缓冲溶液的配制通常由（通常由（）种缓冲剂溶解于水中）种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的（配制而成。调节缓冲剂的（）就可以制得（就可以制得（）使用的缓冲液。使用的缓冲液。1 12 2使用比例使用比例在不同在不同PHPH范围内范围内思考：说出人体血液中缓冲液。思考：说出人体血液中缓冲液。NaH2PO4/Na2HPO4 H2CO3/NaHCO3磷酸缓冲液，磷酸缓冲液，保证血红蛋白的正常结构和保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察功能，便于观察()和科学研究其和科学研究其()4、在本课题中使用的缓冲液？、在本课题中使用的缓冲液？（三）（三）电泳：电泳：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。许多重要的生物大分子，如多肽、许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的核酸等都具有可解离的基团，在一定的PHPH下，下，这些基团会带上正电或负电。这些基团会带上正电或负电。在电场的作用在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。而实现样品中各种分子的分离。琼脂糖琼脂糖凝胶电泳、凝胶电泳、聚丙稀酰胺聚丙稀酰胺凝胶电泳。凝胶电泳。在电场的作用下，这些带电分子会向着与在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动其所带电荷相反的电极移动 4 4、聚丙稀酰胺凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳（1 1）聚丙稀酰胺凝胶：）聚丙稀酰胺凝胶：是由单体丙烯酰是由单体丙烯酰胺和交联剂胺和交联剂N,NN,N，亚甲基双丙烯酰胺在引发剂亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。状结构的凝胶。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率迁移率取取决于它所带决于它所带净电荷净电荷的多少以及的多少以及分子的大分子的大小小等因素。等因素。为了消除为了消除净电荷对迁移率的影响，净电荷对迁移率的影响，可以可以在凝胶中加入在凝胶中加入SDSSDS。（2 2）原理：）原理：SDSSDS能使蛋白质发生完全变性。能使蛋白质发生完全变性。由几条肽由几条肽链组成的链组成的蛋白质复合体蛋白质复合体在在SDSSDS的作用下会的作用下会，因此测定的结果只是，因此测定的结果只是。SDSSDS能与各种蛋白质能与各种蛋白质形成形成，SDSSDS所带负电所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子荷的量大大超过了蛋白质分子。因而掩盖了因而掩盖了，使电泳迁移率完全取决于分子的，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。大小。（3 3）SDS-SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳作用机理作用机理:4 4、聚丙稀酰胺凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳蛋白质的提取和分离一般分为四步：蛋白质的提取和分离一般分为四步：（1）样品处理：包括洗涤红细胞；血）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白稀释；离心等操作收集到的血红红蛋白稀释；离心等操作收集到的血红蛋白溶液。蛋白溶液。（2）粗分离：透析除去分子较小的杂）粗分离：透析除去分子较小的杂质。质。（3）纯化：通过凝胶色谱法将分子量）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。较大的杂质蛋白质除去。（4）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。电泳鉴定。二、实验操作：二、实验操作：样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定二、实验操作：二、实验操作：样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定知识回顾知识回顾（一）样品处理（一）样品处理1 1、红细胞的洗涤：、红细胞的洗涤：2 2、血红蛋白的释放：、血红蛋白的释放：3 3、分离血红蛋白溶液：、分离血红蛋白溶液：4 4、透析、透析：（：（如何除无机盐离子和小分子有机物质呢？）如何除无机盐离子和小分子有机物质呢？）血液柠檬酸钠血液柠檬酸钠低速短时离心低速短时离心吸出上层血浆吸出上层血浆红细胞红细胞5倍倍体积生理盐水体积生理盐水缓慢搅拌缓慢搅拌10min低速短时离心低速短时离心吸出上清液吸出上清液反复洗涤直至上清液无黄色反复洗涤直至上清液无黄色在蒸馏水和甲苯（？）作用下，红细胞破裂释放在蒸馏水和甲苯（？）作用下，红细胞破裂释放红细胞破碎混合液红细胞破碎混合液中速长时离心（中速长时离心（2000c/min10min）滤纸过滤除去脂质滤纸过滤除去脂质分液漏斗分离出血红蛋白，分液漏斗分离出血红蛋白，得到红色透明得到红色透明液体。液体。装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（PH为为7.0）透析。）透析。二、实验操作：二、实验操作：样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定分离血红蛋白溶液分离血红蛋白溶液有机溶剂有机溶剂无色透明的甲苯层无色透明的甲苯层脂类物质脂类物质白色脂溶性物质沉淀层白色脂溶性物质沉淀层血红蛋白溶液血红蛋白溶液红色透明液体红色透明液体红细胞破碎物沉淀红细胞破碎物沉淀暗红色沉淀物暗红色沉淀物1 1、凝胶色谱柱的制作：、凝胶色谱柱的制作：二、实验操作：二、实验操作：样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定色谱柱的制作过程：准备材料色谱柱的制作过程：准备材料加工橡皮塞加工橡皮塞安装色谱柱安装色谱柱步骤步骤操作要求操作要求操作要求操作要求色谱柱垂直固定在支架上色谱柱垂直固定在支架上计算称量凝计算称量凝胶胶根据色谱柱体积计算凝胶用量根据色谱柱体积计算凝胶用量配制悬浮液配制悬浮液凝胶颗粒蒸馏水凝胶颗粒蒸馏水充分溶胀充分溶胀凝胶颗粒洗脱液凝胶颗粒洗脱液沸水浴沸水浴装填悬浮液装填悬浮液一次性缓慢倒入；轻轻敲打一次性缓慢倒入；轻轻敲打缓冲液洗涤缓冲液洗涤平衡平衡立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h12h装配好的凝胶柱打开下端出口，使柱内缓冲液缓打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。吸管吸吸管吸1ml1ml样品加到色谱柱的顶样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝不要破坏凝胶面。胶面。加样后打开下端出口，使样品加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。小心加入小心加入pH=7.0 pH=7.0 的的20mmol/l20mmol/l的磷酸缓冲液到的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每收集流出液，每5ml5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）正确的加样操作：正确的加样操作：1 1、不要触及并破坏凝胶面。、不要触及并破坏凝胶面。2 2、贴壁加样。、贴壁加样。3 3、使吸管管口沿管壁环绕移动。、使吸管管口沿管壁环绕移动。收集得到的纯化后的蛋白鉴定血红蛋白纯度。鉴定血红蛋白纯度。血红蛋白的取和分离凝胶色谱法原理分离过程凝胶电泳法缓冲溶液组成作用蛋白质的提取分离样品处理粗分离纯化纯度鉴定血红蛋白的提取和离蛋白质分子的差异性蛋白质分子的差异性凝胶色谱法原理分离过程凝胶电泳法凝胶色谱法原理分离过程凝胶电泳法缓冲溶液组成作用缓冲溶液组成作用蛋白质的提取分离样品处理粗分离纯化纯度鉴定蛋白质的提取分离样品处理粗分离纯化纯度鉴定观察你处理的血液样品离心后观察你处理的血液样品离心后是否分层是否分层（见教科书图（见教科书图5-5-1818），），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。的提取纯度。1 1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？理后的样品发生了哪些变化吗？2 2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？柱装填得成功吗？你是如何判断的？由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖例如蓝色葡聚糖20002000或红色葡聚糖，或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。以消除气泡，消除不了时要重新装柱。如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。1.1.凝胶色谱法分离蛋白质的的原理是怎样的凝胶色谱法分离蛋白质的的原理是怎样的?2.2.什么是缓冲溶液什么是缓冲溶液?它的作用是什么它的作用是什么?3.3.电泳的作用及其原理是什么电泳的作用及其原理是什么?4.4.你能描述血红蛋白分离的完整过程吗你能描述血红蛋白分离的完整过程吗?5.5.与其他真核细胞相比与其他真核细胞相比,红细胞有什么特点红细胞有什么特点?这一特点对你进行这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义蛋白质的分离有什么意义?凝胶浸泡于蒸馏水充分溶凝胶浸泡于蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液胀后，配成凝胶悬浮液（3）固定：固定：将色谱柱装置固定在支架上将色谱柱装置固定在支架上（4）装填：装填：将凝胶悬浮液一次性的装填入将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。胶填装均匀。装填完毕后，立即用缓冲装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用高的操作压下，用300ml的的20mmol/l的的磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（pH为为7.0）充分洗涤平衡充分洗涤平衡12小时小时。装填时装填时注意：注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。间的空隙。2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。2、不能发生洗脱液流干，、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象露出凝胶颗粒的现象。洗涤平衡时洗涤平衡时注意：注意：4 4、用、用SDS-SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳测定聚丙稀酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的方法蛋白质分子量的方法