质粒中提说明书

质粒中提实验步骤（EZ.NA.tmEndoFreePlasmidMidiKit）实验前准备1. 使用前,将RNaseA全部加入SolutionI中并于4度保存。2. 按下表用无水乙醇稀释DNAWashBuffer,并于室温保存。D6915-01:加入80ml无水乙醇D6915-03:每瓶加入200ml无水乙醇D6915-04:每瓶中加入200ml无水乙醇离心操作方案1. 将带有质粒的Ecoli接种于30-50mlLB/抗生素培养液中，37C搖床培养1216h；2. 取30-50ml的菌液，室温下3,500-5,000xg离心10min收集细菌。3. 倒弃培养基。加入25mlSolutionI/RNaseA混和液，漩涡振荡使细胞完全悬浮。4. 往重悬混和液中加入25mlSolutionIi，轻轻颠倒混匀7-10次后可将混合液室温放置2min以提高产量。避免剧烈混和裂解液且裂解反应不要超过5min。5. 加入125ml冰浴BufferN3,并温和颠倒离心管数次至形成白色絮狀沉淀。准备好过滤器。6. 把HiBind中量柱套在收集管中，加入2mlBufferGPS至柱子中，静置3-10min。室温3000-5000xg离心5分钟。去滤液，把柱子重新放回收集管中。7. 将裂解液倒进预先准备好的针筒过滤器中（针筒开口朝上，下面出口处接收集管），静置2min。8. 插入并轻推活塞使裂解液流进下面的收集管中。9. 在过滤澄清的裂解液中加入1/10体积的ETR，颠倒7-10次后溶液变得浑浊,冰浴10-20min。1042C水浴5min后,25C,3,000-5,000xg离心5min，ETR溶液将在管底形成蓝色分层。离心后,如果溶液中有大量的液滴悬浮，静置10分钟让液滴自然沉降。11. 转移上清液移至离心管中，加入0.5倍体积无水乙醇（室温），混匀后室温静置1-2min。12. 将HiBind中量柱裝在15ml收集管中。转移20ml混合液至柱子內，室温下3,000-5,000xg离心3-5min，倒去滤液。13. 重复该第12步骤，把剩余的过滤液转移至柱子，直至所有的溶液都从柱子滤出。14. 把柱子重新装回收集管，加入3mlHBBuffer，按上述条件离心，弃滤液。15把柱子重新装回收集管，加入35mlDNAWashBuffer，按上述条件离心，弃滤液。16. 重复步骤15一次。17. 弃去滤液，把柱子重新装回收集管，最大速度（v6000xg）离心10-15min以甩干柱子基质。18.（可选）进一步干燥柱子,将柱子从收集管中取出，用真空抽滤装置抽干柱子10min后，也可在真空烘箱或65C干燥10min后重复步骤17。19.把柱子装在干净的15ml离心管上，加入70C预热的05-1mlEndotoxinfreeElutionBuffer到柱子基质上（所加的量取决于预期终产物浓度），室温下静置2min后最大速度离心5min以洗脱DNA。