食品中微生物的检测金黄色葡萄球菌检验

食品卫生微生物学检验食品卫生微生物学检验金黄色葡萄球菌检验金黄色葡萄球菌检验n金黄色葡萄球菌的生物学特性金黄色葡萄球菌的生物学特性n金黄色葡萄球菌的抗原构造及分型简介金黄色葡萄球菌的抗原构造及分型简介n金黄色葡萄球菌的致病性金黄色葡萄球菌的致病性n金黄色葡萄球菌的流行病学金黄色葡萄球菌的流行病学n金黄色葡萄球菌的检验方法金黄色葡萄球菌的检验方法n金黄色葡萄球菌肠毒素的检测金黄色葡萄球菌肠毒素的检测n金黄色葡萄球菌的快速检测方法金黄色葡萄球菌的快速检测方法n金黄色葡萄球菌污染的控制金黄色葡萄球菌污染的控制一、金黄色葡萄球菌的生物学特性一、金黄色葡萄球菌的生物学特性 金黄色葡萄球菌的显微照片 典型的金黄色葡萄球菌为球型，直径典型的金黄色葡萄球菌为球型，直径0.8 m mm左右，显微镜下排列成葡萄串状。左右，显微镜下排列成葡萄串状。金黄色葡萄球菌革兰氏染色显微照片 金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜。金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜。革兰氏染色阳性。革兰氏染色阳性。金黄色葡萄球菌的扫描电镜照片金黄色葡萄球菌的扫描电镜照片Staphylococcus aureus Enhanced sem w:7.9 micron 金黄色葡萄球菌的透射电镜照片金黄色葡萄球菌的透射电镜照片Tem x12000 digitized Staphylococcus aureus 2、培养特性培养特性：金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度37，最适生长，最适生长pH 7.4。平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，边缘整平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，边缘整齐、表面光滑、湿润，直径一般为齐、表面光滑、湿润，直径一般为12 mm。血。血平板菌落周围形成透明的溶血环。平板菌落周围形成透明的溶血环。金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在7.515%NaCl肉汤中生长。肉汤中生长。3、生化特性：生化特性：可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气。甲基红反应阳性，不产气。甲基红反应阳性，VP反应弱阳性。反应弱阳性。许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝酸盐，液化明胶。酸盐，液化明胶。金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力，对磺胺金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力，对磺胺类药物敏感性低，但对青霉素、红霉素等高度敏类药物敏感性低，但对青霉素、红霉素等高度敏感。感。金黄色葡萄球菌的抗原构造和分型金黄色葡萄球菌的抗原构造和分型 对分型进行简单的了解。对分型进行简单的了解。、血清学分型：、血清学分型：金黄色葡萄球菌水解，获得两种抗原成分：蛋白抗原和金黄色葡萄球菌水解，获得两种抗原成分：蛋白抗原和多糖抗原。多糖抗原。蛋白抗原主要为葡萄球菌蛋白抗原主要为葡萄球菌A蛋白（蛋白（SPA)，是一种表面抗，是一种表面抗原，原，90%以上金黄色葡萄球菌有此抗原，无特异性。以上金黄色葡萄球菌有此抗原，无特异性。多糖抗原为半抗原，有型特异性。多糖抗原为半抗原，有型特异性。、噬菌体分型。、噬菌体分型。、根据肠毒素分型。、根据肠毒素分型。、根据血浆凝固酶分型。、根据血浆凝固酶分型。金黄色葡萄球菌的致病性金黄色葡萄球菌的致病性金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓引起局部化脓 感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。甚至败血症、脓毒症等全身感染。金黄色葡萄球菌的致病力金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶：强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶：a.a.溶血毒素：外毒素，分甲、乙、丙、丁、戊五种，能损伤溶血毒素：外毒素，分甲、乙、丙、丁、戊五种，能损伤血小板，破坏溶酶体，引起肌体局部缺血和坏死；血小板，破坏溶酶体，引起肌体局部缺血和坏死；b.b.杀白细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞；杀白细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞；c.c.血浆凝固酶：当金黄色葡萄球菌侵入人体时，该酶使血液血浆凝固酶：当金黄色葡萄球菌侵入人体时，该酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬细胞或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬细胞的吞噬作用。的吞噬作用。葡萄球菌形成的感染易局部化与此酶有关；葡萄球菌形成的感染易局部化与此酶有关；d.d.脱氧核糖核酸酶：金黄色葡萄球菌产生的脱氧核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶：金黄色葡萄球菌产生的脱氧核糖核酸酶能耐受高温，可用来作为依据鉴定金黄色葡萄球菌；能耐受高温，可用来作为依据鉴定金黄色葡萄球菌；e.e.肠毒素：金黄色葡萄球菌能产生数种引起急性胃肠炎的蛋肠毒素：金黄色葡萄球菌能产生数种引起急性胃肠炎的蛋白质性肠毒素，分为白质性肠毒素，分为A A、B B、C C、D D、E E及及F F六种血清型。六种血清型。当金黄色葡萄球菌污染了含淀粉及水分较当金黄色葡萄球菌污染了含淀粉及水分较多的食品，如牛奶和乳制品、肉、蛋等，在温度条多的食品，如牛奶和乳制品、肉、蛋等，在温度条件适宜时，经过件适宜时，经过810小时即可产生相当数量的肠毒小时即可产生相当数量的肠毒素，肠毒素可耐受素，肠毒素可耐受100煮沸煮沸30分钟而不被破坏。人分钟而不被破坏。人摄食该菌污染的食物摄食该菌污染的食物23小时后可引起中毒症状，小时后可引起中毒症状，它引起的食物中毒症状是呕吐和腹泻。它引起的食物中毒症状是呕吐和腹泻。此外，金黄色葡萄球菌还产生溶表皮素、明胶此外，金黄色葡萄球菌还产生溶表皮素、明胶酶、蛋白酶、脂肪酶、肽酶等。酶、蛋白酶、脂肪酶、肽酶等。金黄色葡萄球菌的流行病学金黄色葡萄球菌的流行病学 金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。作为人和动物的常见病原菌，其主要找到。作为人和动物的常见病原菌，其主要存在于人和动物的鼻腔、咽喉、头发上，存在于人和动物的鼻腔、咽喉、头发上，50%以上健康人的皮肤上都有金黄色葡萄球以上健康人的皮肤上都有金黄色葡萄球菌存在。因而，食品受其污染的机会很多。菌存在。因而，食品受其污染的机会很多。金黄色葡萄球菌的流行病学金黄色葡萄球菌的流行病学近年来，美国疾病控制中心报告，由近年来，美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。次于大肠杆菌。金黄色葡萄球菌的流行病学特点金黄色葡萄球菌的流行病学特点季节分布，多见于春夏季；中毒食品季节分布，多见于春夏季；中毒食品种类多，如奶、肉、蛋、鱼及其制品。此种类多，如奶、肉、蛋、鱼及其制品。此外，剩饭、油煎蛋、糯米糕及凉粉等引起外，剩饭、油煎蛋、糯米糕及凉粉等引起的中毒事件也有报道。的中毒事件也有报道。上呼吸道感染患者鼻腔带菌率上呼吸道感染患者鼻腔带菌率83%，所以人畜化脓性感染部位常成为污染源。所以人畜化脓性感染部位常成为污染源。金黄色葡萄球菌的流行病学金黄色葡萄球菌的流行病学一般说，金黄色葡萄球菌可通过以下一般说，金黄色葡萄球菌可通过以下途径污染食品：途径污染食品：食品加工人员、炊事员或销售人员带食品加工人员、炊事员或销售人员带菌，造成食品污染；食品在加工前本身带菌，造成食品污染；食品在加工前本身带菌，或在加工过程中受到了污染，产生了菌，或在加工过程中受到了污染，产生了肠毒素，引起食物中毒；熟食制品包装不肠毒素，引起食物中毒；熟食制品包装不严，运输过程受到污染；奶牛患化脓性乳严，运输过程受到污染；奶牛患化脓性乳腺炎或禽畜局部化脓时，对肉体其他部位腺炎或禽畜局部化脓时，对肉体其他部位的污染。的污染。*金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生问题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起问题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的的食物中毒占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则更多，占加拿大则更多，占45%，我国每年发生的此，我国每年发生的此类中毒事件也非常多。肠毒素形成条件：类中毒事件也非常多。肠毒素形成条件：存放温度，在存放温度，在37内，温度越高，产毒内，温度越高，产毒时间越短；时间越短；存放地点，通风不良氧分压低易形成肠存放地点，通风不良氧分压低易形成肠毒素；毒素；食物种类，含蛋白质丰富，水分多，同食物种类，含蛋白质丰富，水分多，同时含一定量淀粉的食物，肠毒素易生成。时含一定量淀粉的食物，肠毒素易生成。金黄色葡萄球菌的检验金黄色葡萄球菌的检验1、样品制备、样品制备按无菌操作取检样按无菌操作取检样25 g（mL），加入），加入225 mL灭菌生理盐水，固体样品研磨或置灭菌生理盐水，固体样品研磨或置均质器中制成均质器中制成1:10样品混悬液。样品混悬液。供计数检验时，可按十进位递增稀释法供计数检验时，可按十进位递增稀释法将样品匀液再进行适当稀释。将样品匀液再进行适当稀释。金黄色葡萄球菌的检验金黄色葡萄球菌的检验2、增菌及分离培养、增菌及分离培养 吸取吸取5 mL混悬液，接种于混悬液，接种于7.5%氯化钠氯化钠肉汤或胰酪胨大豆肉汤肉汤或胰酪胨大豆肉汤50 mL培养基内，培养基内，361培养培养24 h，转种血平板和，转种血平板和Baird-Parker平板，平板，361培养培养24 h，挑取血，挑取血平板上金黄色（有时为白色）菌落进行革平板上金黄色（有时为白色）菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。血平板上金黄色葡萄球菌菌落形态 金黄色葡萄球球菌的单个菌落在血金黄色葡萄球球菌的单个菌落在血平板上呈金黄色，有时也为白色，大而平板上呈金黄色，有时也为白色，大而突出、圆形、不透明、表面光滑，周围突出、圆形、不透明、表面光滑，周围有溶血圈。有溶血圈。金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌在在BPBP平板上的菌落形态平板上的菌落形态在在Baird-Parker琼脂平板上菌落呈圆形，表面光琼脂平板上菌落呈圆形，表面光滑、凸起、湿滑、凸起、湿 润，直径润，直径23 mm。灰黑色至黑色，有。灰黑色至黑色，有光泽，常有浅色（非白色）的边缘，周围绕以不透明光泽，常有浅色（非白色）的边缘，周围绕以不透明圈圈（沉淀），其外常有一清晰带。当用接种针触及（沉淀），其外常有一清晰带。当用接种针触及菌落时具有黄油样粘稠感。有时可见到不分解脂肪的菌落时具有黄油样粘稠感。有时可见到不分解脂肪的菌株，除没有不透明圈和清晰带外，其他外观基本相菌株，除没有不透明圈和清晰带外，其他外观基本相同。从长期贮存的冷冻或脱同。从长期贮存的冷冻或脱 水食品中分离的菌落，水食品中分离的菌落，其黑色常较典型菌落浅些，且外观可能较粗糙，质地其黑色常较典型菌落浅些，且外观可能较粗糙，质地较干燥。较干燥。金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌在甘露醇盐平板上的菌落在甘露醇盐平板上的菌落 Staphylococcus aureus on mannitol salts agar 3、血浆凝固酶试验：吸取吸取1:4新鲜兔血浆新鲜兔血浆0.5 mL，放入小试，放入小试管中，再加入培养管中，再加入培养24 h的金黄色葡萄球菌的金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤培养物肉浸液肉汤培养物0.5 mL，振荡摇匀，振荡摇匀，置置 361温箱或水浴内，每半小时观察温箱或水浴内，每半小时观察一次，观察一次，观察6 h，如呈现凝固，如呈现凝固,即将试管倒即将试管倒置或置或 倾斜时，呈现凝块者，被认为阳性结倾斜时，呈现凝块者，被认为阳性结果。同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及果。同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及肉汤作为对照。肉汤作为对照。金黄色葡萄球菌肠毒素的检测金黄色葡萄球菌肠毒素的检测 一、动物学试验主要用幼猫和猴。一、动物学试验主要用幼猫和猴。二、血清学试验肠毒素作为抗原，可以二、血清学试验肠毒素作为抗原，可以和特异性抗体发生结合性反应，产生可见和特异性抗体发生结合性反应，产生可见沉淀。沉淀。用血清学反应检验金黄色葡萄球菌肠用血清学反应检验金黄色葡萄球菌肠毒素，方法主要有：毒素，方法主要有：1.免疫琼脂扩散法免疫琼脂扩散法 2.反向间接血凝试验反向间接血凝试验 3.免疫荧光法免疫荧光法 4.酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法 金黄色葡萄球菌快速检测方法目前，随着研究的深入，一些快速和采用目前，随着研究的深入，一些快速和采用现代技术的检测方法不断出现，这些新的快速现代技术的检测方法不断出现，这些新的快速方法，一般都缩短了传统检测方法的时间，能方法，一般都缩短了传统检测方法的时间，能够较快地得到检测结果，并且操作相对简单。够较快地得到检测结果，并且操作相对简单。比如：法国梅里埃公司生产的比如：法国梅里埃公司生产的RPF培养基培养基、API检测系统等。梅里埃公司生产的检测系统等。梅里埃公司生产的mini VIDAS利用荧光免疫的方法检测葡萄球菌利用荧光免疫的方法检测葡萄球菌肠毒素，在仪器上肠毒素，在仪器上45 min可以得到结果。可以得到结果。法国梅里埃公司生产的法国梅里埃公司生产的RPFRPF培养基培养基凝固酶阳性葡萄球菌凝固酶阳性葡萄球菌:菌落周围形成沉淀圈菌落周围形成沉淀圈-+l将兔血浆包括在培养基中作为直接确认菌落的手段将兔血浆包括在培养基中作为直接确认菌落的手段金黄色葡萄球菌污染的控制金黄色葡萄球菌污染的控制防止食品污染防止食品污染防止带菌人群对各种食物的污染：防止带菌人群对各种食物的污染：定期对生产加工人员进行健康检查，患定期对生产加工人员进行健康检查，患局部化脓性感染（如疥疮、手指化脓等局部化脓性感染（如疥疮、手指化脓等）、上呼吸道感染（如鼻窦炎、化脓性）、上呼吸道感染（如鼻窦炎、化脓性肺炎、口腔疾病等）的人员要暂时停止肺炎、口腔疾病等）的人员要暂时停止其工作或调换岗位。其工作或调换岗位。金黄色葡萄球菌污染的控制金黄色葡萄球菌污染的控制防止食品污染防止食品污染防止金黄色葡萄球菌对奶及其制品防止金黄色葡萄球菌对奶及其制品的污染：如牛奶厂要定期检查奶牛的乳的污染：如牛奶厂要定期检查奶牛的乳房，不能挤用患化脓性乳腺炎的牛奶；房，不能挤用患化脓性乳腺炎的牛奶；奶挤出后，要迅速冷至奶挤出后，要迅速冷至-10以下，以防以下，以防毒素生成、细菌繁殖。奶制品要以消毒毒素生成、细菌繁殖。奶制品要以消毒牛奶为原料，注意低温保存。牛奶为原料，注意低温保存。对肉制品加工厂，患局部化脓感染对肉制品加工厂，患局部化脓感染的禽、畜尸体应除去病变部位，经高温的禽、畜尸体应除去病变部位，经高温或其他适当方式处理后进行加工生产或其他适当方式处理后进行加工生产。应在低温和通风良好的条件下贮藏应在低温和通风良好的条件下贮藏食物，以防肠毒素形成；食物，以防肠毒素形成；在气温高的春夏季，食物置冷藏或在气温高的春夏季，食物置冷藏或通风阴凉地方也不应超过通风阴凉地方也不应超过6小时，并且小时，并且食用前要彻底加热。食用前要彻底加热。