6第六章鉴定与检测

细菌的鉴定与检测细菌遗传学与基因工程医学细菌学微生物工程细菌的鉴定与检测 分离培养法：营养培养基、选择培养基或鉴别培养基分离纯化得到的细菌。营养培养基、选择培养基或鉴别培养基分离纯化得到的细菌。浓缩接种及离体叶检测：提取液浓缩接种感病植物，观测发病情况。提取液浓缩接种感病植物，观测发病情况。例如：在例如：在1灭菌水琼脂中加灭菌水琼脂中加75106的苯并咪唑，做平板，加感病的苯并咪唑，做平板，加感病植物叶片，针刺摩擦接种，培养（光、温、湿度），短期获得症状。植物叶片，针刺摩擦接种，培养（光、温、湿度），短期获得症状。如水稻细菌性条斑病菌和小麦细菌性黑颖病菌的检测。如水稻细菌性条斑病菌和小麦细菌性黑颖病菌的检测。abcde 24 hpi 36 hpi 72h pi 96 hpi 132 hpi水稻细菌性条斑病菌接种水稻叶片水稻细菌性条斑病菌接种水稻叶片Wheat bacterial black ChaffSelective medium在培养基中加入某种化学物质，使之抑制某些细菌生长，而有利于另在培养基中加入某种化学物质，使之抑制某些细菌生长，而有利于另一些细菌生长，从而将后者从混杂的标本中分离出来一些细菌生长，从而将后者从混杂的标本中分离出来differential medium 利用各种细菌分解糖类和蛋白质的能力及其代谢产物不同，在培养基利用各种细菌分解糖类和蛋白质的能力及其代谢产物不同，在培养基中加入特定的作用底物和指示剂，一般不加抑菌剂，观察细菌在其中中加入特定的作用底物和指示剂，一般不加抑菌剂，观察细菌在其中生长后对底物的作用如何，从而鉴别细菌。生长后对底物的作用如何，从而鉴别细菌。如常用的糖发酵管、三糖铁培养基、伊红如常用的糖发酵管、三糖铁培养基、伊红-美蓝琼脂等。美蓝琼脂等。Xanthomonasstewartii(Smith)Dowson 分离鉴定进口玉米枯萎病菌的选择性培养基-黑色素培养基 菌落菌落中心黑色边缘透明、圆形、表面光滑。这一特异性状是其他选择中心黑色边缘透明、圆形、表面光滑。这一特异性状是其他选择性培养基所没有的，也是与其他细菌区分的重要标志。性培养基所没有的，也是与其他细菌区分的重要标志。选用选用酵母浸膏酵母浸膏的主要原因是它含有多种氨基酸、维生素和矿物质营养的主要原因是它含有多种氨基酸、维生素和矿物质营养元素，对玉米枯萎菌生长有促进作用；元素，对玉米枯萎菌生长有促进作用；甘油作碳源甘油作碳源是合适的，因为它是很多细菌的不良碳源；是合适的，因为它是很多细菌的不良碳源；牛胆酸钠牛胆酸钠能够抑制部分革兰氏阳性和阴性细菌，对枯萎菌生长无害；能够抑制部分革兰氏阳性和阴性细菌，对枯萎菌生长无害；利用枯萎菌利用枯萎菌耐盐耐盐的特点，加大盐的用量，抑制了部分不耐盐的细菌；的特点，加大盐的用量，抑制了部分不耐盐的细菌；选用选用水溶黑色素水溶黑色素作培养基成份，主要是作培养基成份，主要是使枯萎菌吸收黑色素使枯萎菌吸收黑色素，形成独，形成独特的特异性状，便于区分不同细菌。特的特异性状，便于区分不同细菌。选择性较高、菌落容易辨认、抑制真菌效果好、平板效率较高。选择性较高、菌落容易辨认、抑制真菌效果好、平板效率较高。Iron sulphite agar for thermophilic anaerobe detection铁亚硫酸盐琼脂对铁亚硫酸盐琼脂对嗜热厌氧菌检测嗜热厌氧菌检测enterobacteria enrichment broth mossel肠道菌增菌肉汤培养基肠道菌增菌肉汤培养基selective medium for the isolation of enteric pathogens particularly Salmonella and Shigella species.肠道致病菌：沙门氏菌和志贺菌属肠道致病菌：沙门氏菌和志贺菌属Culture media Selective isolation Clostridium perfringens TSC agar选择性分离产气荚膜梭菌选择性分离产气荚膜梭菌differential medium Blood agar is a common differential culture medium used to identify bacteria that causes haemolysis溶血in blood.Culture media Selective isolation Enterobacter sakazakii 选择性分离阪崎肠杆菌选择性分离阪崎肠杆菌Oxoid Brilliance E.coli/coliform Selective Agar now allows improved confirmation of E.coli directly on culture plate Salmonella Growing On XLD Agar沙门氏菌沙门氏菌 原理：原理：结合血清学与平板分离技术，利用结合血清学与平板分离技术，利用与抗原高度亲和与抗原高度亲和性的抗体性的抗体，来捕获目标细菌，样本中其他细菌均被冲洗掉，来捕获目标细菌，样本中其他细菌均被冲洗掉，再将目标细菌转移或释放到培养基上生长。再将目标细菌转移或释放到培养基上生长。方法：方法：平皿免疫吸附评价测定法和免疫吸附稀释培养法平皿免疫吸附评价测定法和免疫吸附稀释培养法 细菌细胞表面具有细菌细胞表面具有蛋白质、脂多糖（蛋白质、脂多糖（LPSLPS）和胞外多糖）和胞外多糖等抗原分子，等抗原分子，利用多克隆抗血清可以鉴定细菌的种。利用多克隆抗血清可以鉴定细菌的种。杂交瘤技术的发展为杂交瘤技术的发展为单克隆抗体（单克隆抗体（MAbsMAbs）的制备提供了方向；该技的制备提供了方向；该技术很快被用于制备病原细菌的单克隆抗体，进行病菌特异性和流行术很快被用于制备病原细菌的单克隆抗体，进行病菌特异性和流行学研究。学研究。包括包括凝集检验凝集检验（agglutination assaysagglutination assays）、）、ELISAELISA、Western blotWestern blot、免疫荧光免疫荧光（immunofluorescenceimmunofluorescence，IFIF）或）或免疫荧光菌落染色免疫荧光菌落染色（immunofluorescence colony-stainingimmunofluorescence colony-staining，IFCIFC）以及）以及侧流方法侧流方法（lateral flow deviceslateral flow devices）在内的单克隆抗体和多克隆抗血清对多）在内的单克隆抗体和多克隆抗血清对多种形式的检测应用是有效的。种形式的检测应用是有效的。凝集检验：凝集检验：凝集检验：凝集检验：人畜共患病之布氏杆菌凝集试验：人畜共患病之布氏杆菌凝集试验：待测血清中抗布氏杆菌抗体与胶乳试剂相遇，发生抗原-抗体反应，出现肉眼可见的凝集反应。试剂：羊、牛、猪三型诊断菌液。操作方法：待检血清（用生理盐水作1 25、1 50、l 100、1 200、1 400、l 800倍稀释）0.5ml，分别加诊断菌液0.5ml，混匀。37水浴1620h观察结果。标准：非流行区凝集效价一般大于1:80有诊断意义;流行区和牧民区凝集效价在1:160以上才有诊断意义 ELISA：多数病原细菌：多数病原细菌MAbs的制备开始都是通过的制备开始都是通过 ELISA方法筛选的，然后再用其它免疫诊断检测验证方法筛选的，然后再用其它免疫诊断检测验证(用于番茄溃疡病菌（用于番茄溃疡病菌（C.michiganensis subsp.michiganensis）和番）和番茄细菌性斑点病菌（茄细菌性斑点病菌（X.axonopodis pv.vesicatoria）的检测）的检测)ELISA1971年Engvall和Perlmann发表的酶联免疫吸附剂测定enzyme linked immunosorbent assay原理：使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。共轭共轭包被包被加样加样加酶标抗体加酶标抗体加底物液显色加底物液显色终止反应终止反应结果判定结果判定 免疫荧光（免疫荧光（IFIF）抗体法）抗体法：将荧光染料（异硫氢酸荧光黄或：将荧光染料（异硫氢酸荧光黄或罗丹明）与抗体以化学方法接合，再与抗原反应，形成有罗丹明）与抗体以化学方法接合，再与抗原反应，形成有荧光标记的抗体荧光标记的抗体抗原复合物，在荧光显微镜下，可观察抗原复合物，在荧光显微镜下，可观察到黄绿色荧光。到黄绿色荧光。IFIF在欧洲被广泛用于种子和繁殖材料中病原细菌的检测。在欧洲被广泛用于种子和繁殖材料中病原细菌的检测。(荷兰荷兰 -马铃薯褐腐病的青枯菌（马铃薯褐腐病的青枯菌（R.solanancearumR.solanancearum）法国法国 -马铃薯环腐棒形细菌（马铃薯环腐棒形细菌（C.michiganensisC.michiganensis subsp.subsp.sepedonicussepedonicus）;番茄种子中的细菌性溃疡病菌（番茄种子中的细菌性溃疡病菌（C.michiganensisC.michiganensis subsp.subsp.michiganensismichiganensis）)免疫荧光（免疫荧光（IFIF）抗体法）抗体法直接法：用特异荧光抗体直接滴加于标本上，使之与抗原发生特异性结合。本法操作简便，特异性高，非特异荧光染色因素少缺点是敏感度偏低，每检查一种抗原需制备相应的特异荧光抗体。免疫荧光（免疫荧光（IFIF）抗体法）抗体法间接法：有两种抗体相继作用，第一抗体为针对抗原的特异抗体，第二抗体（荧光抗体）为针对第一抗体的抗抗体。本法灵敏度高，而且在不同抗原的检测中只需应用一种荧光抗体。免疫荧光（免疫荧光（IFIF）抗体法）抗体法补体结合法本法：是间接法的第一步抗原抗体反应时加入补体（多用豚鼠补体），再用荧光标记的抗补体抗体进行示踪。本法敏感度高，且只需一种抗体。但易出现非特异性染色，加之补体不稳定，每次需采新鲜血清，操作复杂，因此较少应用。免疫荧光（免疫荧光（IFIF）抗体法）抗体法标记法：本法用fitc及罗丹明分别标记不同的抗体，而对同一标本作荧光染色。在有两种相应抗原存在时，可同时见到橙红和黄绿两种荧光色泽。流式细胞光度术（流式细胞光度术（Flow cytometerFlow cytometer）：用EPICSELITE型流式细胞仪等设置激光波长488nm、输出功率等参数进行检测。用于检测引起花烛疫病（用于检测引起花烛疫病（anthuriumanthurium blight blight）的）的 X.X.axonopodisaxonopodis pvpv.dieffenbachiaedieffenbachiae，检测油菜（，检测油菜（BrassicaBrassica sp.sp.）的种子提取物中的）的种子提取物中的 X.X.campestriscampestris pvpv.campetriscampetris 以及确定马铃薯种薯中的青枯菌（以及确定马铃薯种薯中的青枯菌（R R.solanacearumsolanacearum）等；）等；免疫磁性分离（免疫磁性分离（ImmunomagneticImmunomagnetic separation separation）利用由特异抗体包利用由特异抗体包被的顺磁聚苯乙烯珠把目标细胞能够从混合液中分离出来，接着进行被的顺磁聚苯乙烯珠把目标细胞能够从混合液中分离出来，接着进行脱洗，被束缚的细胞可用于脱洗，被束缚的细胞可用于PCRPCR，或当它们是活的就可以在选择性培，或当它们是活的就可以在选择性培养基上培养出。养基上培养出。免疫磁性分离免疫磁性分离 原理：噬菌体侵染细菌，裂解寄主原理：噬菌体侵染细菌，裂解寄主细胞。在液体培养时，会使浑浊的细胞。在液体培养时，会使浑浊的细菌悬浮液变清，在固体平板上培细菌悬浮液变清，在固体平板上培养，则出现许多边缘整齐、透明光养，则出现许多边缘整齐、透明光亮的噬菌斑。亮的噬菌斑。噬菌体具有专化性，利用此特点，噬菌体具有专化性，利用此特点，可鉴别细菌的种类。可鉴别细菌的种类。非活菌检测的方法很多，下表是检测病原细菌常用的一些非活菌检测的方法很多，下表是检测病原细菌常用的一些方法，前方法，前9 9种血清学方法，均属非活菌检测。种血清学方法，均属非活菌检测。它们既能用于病原鉴定，又能直接用于病种或病株，甚至它们既能用于病原鉴定，又能直接用于病种或病株，甚至是无症感染组织的检测。是无症感染组织的检测。MullisMullis等在等在19851985年创立的年创立的PCRPCR方法灵敏、准确、方便、方法灵敏、准确、方便、快速，可在短时间内扩增出数百万个特异快速，可在短时间内扩增出数百万个特异DNADNA序列的序列的拷贝。拷贝。目前研究人员已在检测种子带菌方面应用目前研究人员已在检测种子带菌方面应用PCRPCR技术做技术做了大量工作，设计得到了大量相关引物。了大量工作，设计得到了大量相关引物。例如，菜豆晕疫病（例如，菜豆晕疫病（Pseudomonas syringae Pseudomonas syringae pv.pv.phaseolicolaphaseolicola），番茄细菌性溃疡病（），番茄细菌性溃疡病（CMMCMM）等。）等。多种以多种以PCRPCR为基础的分析方法，比如，以为基础的分析方法，比如，以rDNArDNA为模板为模板的的PCRPCR：ITS-PCRITS-PCR、tRNA-PCRtRNA-PCR等都已经出现。等都已经出现。19921992由由Sano T.Sano T.等最早使用等最早使用 将血清学中抗原将血清学中抗原-抗体反应的特异性与抗体反应的特异性与PCRPCR的强特异扩增能力结的强特异扩增能力结合起来，可以在短时间内精确的检测某一病原物是否存在。合起来，可以在短时间内精确的检测某一病原物是否存在。原理是：用一段具体的原理是：用一段具体的DNADNA分子标记抗体，应用此抗体去检分子标记抗体，应用此抗体去检测抗原，测抗原，PCRPCR扩增此段扩增此段DNADNA分子，根据扩增产物存在与否判断分子，根据扩增产物存在与否判断抗原是否存在。抗原是否存在。根据反应物的不同，目前可将免疫根据反应物的不同，目前可将免疫PCRPCR分为单分析物免疫分为单分析物免疫PCRPCR、多分析物免疫多分析物免疫PCRPCR、单引物免疫、单引物免疫PCRPCR、和双引物免疫、和双引物免疫PCRPCR。是磁性微球（是磁性微球（magnetic microspheremagnetic microsphere，MMSMMS）载体表面通过化学）载体表面通过化学或物理方法连接上具有一定免疫活性的物质作为配体而研制或物理方法连接上具有一定免疫活性的物质作为配体而研制成的。成的。IMS-PCRIMS-PCR的特点是对目的菌进行了二步检测，一是血清的作用，的特点是对目的菌进行了二步检测，一是血清的作用，二是是二是是PCRPCR的作用。的作用。在检测西瓜细菌性果斑病的试验中在检测西瓜细菌性果斑病的试验中R.R.WalcottR.R.Walcott等证明了等证明了IMS-IMS-PCRPCR的灵敏度比直接的灵敏度比直接PCRPCR高高100100倍，而且不受倍，而且不受PCRPCR抑制因子的影抑制因子的影响。响。实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR（real-time fluorescent quantitative PCR real-time fluorescent quantitative PCR）的）的出现，成为出现，成为DNADNA或或RNARNA检测方法的又一突破性进步。检测方法的又一突破性进步。它实现了它实现了PCRPCR检测从定性到定量的飞跃，运用由计算机控制检测从定性到定量的飞跃，运用由计算机控制的新型、便携设备进行自动化操作，使检测结果更加具有的新型、便携设备进行自动化操作，使检测结果更加具有准确性、专一性和可重复性，已开始在医学、生物学和诸准确性、专一性和可重复性，已开始在医学、生物学和诸多农业科研领域中广泛使用。多农业科研领域中广泛使用。Light CyclerLight CyclerTMTM(Roche Diagnostics(Roche Diagnostics公司公司)RAPIDRAPID（ruggedize advanced pathogen identification deviceruggedize advanced pathogen identification device，Idaho TechnologiesIdaho Technologies公司）公司）Smart CyclerSmart Cycler TD TD（CepheidCepheid公司）公司）iCycler iQiCycler iQTMTM（Bio-RadBio-Rad公司）公司）MX4000MX4000TMTM（StratageneStratagene公司）公司）Rotor GeneRotor Gene（Corbett ResearchCorbett Research公司）公司）ABI 7700ABI 7700和和Gene Amp 5700Gene Amp 5700（Applied BiosystemsApplied Biosystems公司）公司）大多设备能真正做到在每个循环实时监测荧光、收集数大多设备能真正做到在每个循环实时监测荧光、收集数据。据。RAPIDRAPID和和Smart CyclerSmart Cycler 则是手提式设备。则是手提式设备。Smart Cycler TDSmart Cycler TD的设计最为独特，它含有的设计最为独特，它含有1616个由微处理器个由微处理器控制的控制的I-COREI-CORE（intelligent cooling-heating optical reactionintelligent cooling-heating optical reaction）模块，可以同时进行模块，可以同时进行1616个不同的个不同的PCRPCR反应。反应。ABI 7700型The portable Smart Cycler TD.RAPIDABI7900型型Gene Amp5700Light Cycler 实时实时PCRPCR与传统与传统PCRPCR相比，有许多优势：相比，有许多优势：1 1、不需、不需SouthernSouthern杂交鉴定杂交鉴定PCRPCR产物。产物。2 2、全能性更强，减少了交叉污染的可能性。、全能性更强，减少了交叉污染的可能性。3 3、需要的劳动力较少。、需要的劳动力较少。4 4、易于操作。、易于操作。5 5、自动提供引物选择所需的数据。、自动提供引物选择所需的数据。6 6、快速优化反应条件。、快速优化反应条件。7 7、可以用于多重、可以用于多重PCRPCR。Drive to the fieldRemove diseased tissue sampleDrive to the labincubate tissue in 50 L water for 20 min.add 1 L sample to reaction tuberun PCR for 20 min.to get resultsN.W.SchaadN.W.Schaad等使用手提式等使用手提式Smart Cycler SC Smart Cycler SC 系统（系统（Cepheid,Sunnyvale,Cepheid,Sunnyvale,CACA）对西瓜中的西瓜细菌性果斑病菌（）对西瓜中的西瓜细菌性果斑病菌（Acidovorax avenae Acidovorax avenae subsp.subsp.citrullicitrulli）、蚕豆中的菜豆假单胞菌（）、蚕豆中的菜豆假单胞菌（Pseudomonas phaseolicola Pseudomonas phaseolicola pv.pv.PhaseolicolaPhaseolicola）、马铃薯中的青枯菌（）、马铃薯中的青枯菌（Ralstonia solanacearumRalstonia solanacearum）进行）进行了快速检测。了快速检测。对于马铃薯青枯病菌（对于马铃薯青枯病菌（Ralstonia solanacearumRalstonia solanacearum）D.E.SteadD.E.Stead等人发现等人发现用实时用实时PCRPCR技术在马铃薯组织中检测青枯菌生理小种技术在马铃薯组织中检测青枯菌生理小种2h2h仍比较灵仍比较灵敏，针对不同小种或生理小种设计的特异引物敏，针对不同小种或生理小种设计的特异引物/探针组合可以提探针组合可以提高反应的专一性。高反应的专一性。类似地，类似地，20002000年，年，WellerWeller等也在检测马铃薯块茎中的青枯菌时借助等也在检测马铃薯块茎中的青枯菌时借助77007700测序系统和测序系统和TaqManTaqMan 系统，分别用种的系统，分别用种的16s16s探针和生理小种探针和生理小种2 2的的特异性探针，成功地检测到了浓度为特异性探针，成功地检测到了浓度为100CFU/ml100CFU/ml的青枯菌纯培养。的青枯菌纯培养。M.T.KingsleyM.T.Kingsley设计了设计了0.554Kb SCAR0.554Kb SCAR（sequence characterized sequence characterized amplified regionamplified region）片段，该片段来自于柑橘黄单胞菌）片段，该片段来自于柑橘黄单胞菌（Xanthomonas citriXanthomonas citri）32133213菌株菌株RAPDRAPD扩增子，鉴于它的唯一性，扩增子，鉴于它的唯一性，可将其作为荧光可将其作为荧光PCRPCR扩增子的潜在来源。扩增子的潜在来源。用用TaqMan TaqMan TMTM对来自全球的对来自全球的3636个个X.c.X.c.菌株进行测定，均呈阳性。而菌株进行测定，均呈阳性。而其他其他1212种异源种异源DNADNA则呈阴性。则呈阴性。N.W.SchaadN.W.Schaad等人首次将实时荧光等人首次将实时荧光PCRPCR应用到皮尔斯葡萄叶烧病病菌应用到皮尔斯葡萄叶烧病病菌（Xylella fastidiosaXylella fastidiosa）的快速检测当中，直接以不显症的树藤作为样本，）的快速检测当中，直接以不显症的树藤作为样本，克服了在发病初期不易发现和分离该菌的困难，并详细介绍了该菌克服了在发病初期不易发现和分离该菌的困难，并详细介绍了该菌的特异探针、引物及反应条件的设计方法，具有较高的参考价值。的特异探针、引物及反应条件的设计方法，具有较高的参考价值。第三节 植物病害鉴定与检测实例18781878年首先由年首先由BurrillBurrill描述，在纽约发生，后描述，在纽约发生，后由由ErwinErwin命名，是第一个被确定的植物细菌命名，是第一个被确定的植物细菌病害。病害。主要分布于北美洲于西北欧，中欧、地中海、主要分布于北美洲于西北欧，中欧、地中海、东南欧及大洋州和亚洲也有分布。大约东南欧及大洋州和亚洲也有分布。大约4040多多个国家。个国家。寄主：梨火疫病菌寄主范围很广，能为害梨、苹果、山楂、木梨火疫病菌寄主范围很广，能为害梨、苹果、山楂、木旬子、李等旬子、李等40多个属多个属220多种植物，大部分属蔷薇科多种植物，大部分属蔷薇科危害性：仁果类果树的一种毁灭性病害。一棵多年生的梨和苹仁果类果树的一种毁灭性病害。一棵多年生的梨和苹果树发病后可在几星期内死亡。果树发病后可在几星期内死亡。症状：侵害花、果实、枝条和叶片。侵害花、果实、枝条和叶片。花：花：侵染后变深褐色，枯萎。侵染后变深褐色，枯萎。叶片：叶片：从叶缘沿叶脉扩展，先呈水浸状，后黑褐色。从叶缘沿叶脉扩展，先呈水浸状，后黑褐色。嫩稍：嫩稍：先水浸状，后褐色至黑色，向下弯曲，呈鱼钩状。先水浸状，后褐色至黑色，向下弯曲，呈鱼钩状。果实：果实：病部褐色凹陷，扩展到全果，潮湿时病部生粘稠的细菌溢，病部褐色凹陷，扩展到全果，潮湿时病部生粘稠的细菌溢，初乳白色，后红褐色。初乳白色，后红褐色。病枝：病枝：叶片凋萎，幼果僵化，但病叶病果不脱落，远望似火烧状，叶片凋萎，幼果僵化，但病叶病果不脱落，远望似火烧状，故称火疫病。故称火疫病。伤口：伤口：初期水浸状，后下陷，呈溃疡斑，病健交界处产生龟裂纹，初期水浸状，后下陷，呈溃疡斑，病健交界处产生龟裂纹，韧皮部红褐色，有黏液状菌脓。韧皮部红褐色，有黏液状菌脓。严重时，病害从嫩稍很快扩展到枝条、主干，直至根部，全株严重时，病害从嫩稍很快扩展到枝条、主干，直至根部，全株死亡。死亡。Pear fire blight,Erwinia amylovoraAdvanced fire blight on fruit-note bacterial ooze on fruit.主要鉴定特征：梨火疫病最典型的症状是花、果实和叶片受火疫病菌侵梨火疫病最典型的症状是花、果实和叶片受火疫病菌侵害后，很快变黑褐色枯萎，犹如火烧一般，但仍挂在树上害后，很快变黑褐色枯萎，犹如火烧一般，但仍挂在树上不落，故此得名。不落，故此得名。目前国际上将其症状据受侵害的部位，分成个阶段。目前国际上将其症状据受侵害的部位，分成个阶段。（1 1）花枯萎：侵染开放的花引起花枯萎。一般发生于早春，）花枯萎：侵染开放的花引起花枯萎。一般发生于早春，病菌直接从花器侵入，初为水渍状斑，花基部或花柄暗色，不病菌直接从花器侵入，初为水渍状斑，花基部或花柄暗色，不久萎蔫。久萎蔫。（2 2）溃疡枯萎：是指前一季越冬溃疡边缘的病菌重新复活的结）溃疡枯萎：是指前一季越冬溃疡边缘的病菌重新复活的结果。果。（3 3）枝枯萎：细菌直接侵入前）枝枯萎：细菌直接侵入前 1 13 3叶的枝尖，然后杀死整个枝叶的枝尖，然后杀死整个枝条及支持枝。条及支持枝。（4 4）病菌亦可直接从气孔、水孔等自然孔口或蕾苞，或由）病菌亦可直接从气孔、水孔等自然孔口或蕾苞，或由风引起的伤口侵入叶片，初叶边坏死，并向中脉、中柄、风引起的伤口侵入叶片，初叶边坏死，并向中脉、中柄、茎扩展，后变黑，通常有菌脓。茎扩展，后变黑，通常有菌脓。（5 5）损伤枯萎和砧木枯萎：前者主要是由于晚霜、冰雹或）损伤枯萎和砧木枯萎：前者主要是由于晚霜、冰雹或大风损伤引起，如果实大风损伤引起，如果实 很容易引起果实枯萎。后者仅限很容易引起果实枯萎。后者仅限于高感品种于高感品种EMAL-26EMAL-26、EMLA-9EMLA-9和和MARK-39MARK-39砧木。通常是砧木。通常是由感病的接穗在这些砧木上发病后引起，最终成溃疡带而由感病的接穗在这些砧木上发病后引起，最终成溃疡带而杀死树体。杀死树体。病原菌：学名：Erwiniaamylovora（Burrill）Winslow 异名：Micrococcusamylovorus Burril Bacillusamylovorus(Burrill)Trevisan Bacteriumamylovorus(Burrill)Chester 分类地位：原核生物界原核生物界(Procaryotes),(Procaryotes),薄壁菌门薄壁菌门(Gracilicutes),(Gracilicutes),肠杆菌科肠杆菌科(Enterobacteriaceae)(Enterobacteriaceae)欧文氏菌属欧文氏菌属(ErwiniaErwinia)解淀粉欧文氏菌解淀粉欧文氏菌 形态特征：直杆菌，有荚膜，周生鞭毛，能运动，大小为直杆菌，有荚膜，周生鞭毛，能运动，大小为0.9-1.80.9-1.8 0.6-1.5m 0.6-1.5m，多，多数单生，有时成双或短时间内数单生，有时成双或短时间内3-43-4个呈链状。革兰氏染色阴性。个呈链状。革兰氏染色阴性。在蔗糖培养基上在蔗糖培养基上2727下培养下培养3d3d，菌落直径，菌落直径3 34mm4mm，白色至奶油色，半，白色至奶油色，半球形隆起，有黏性，表面光滑，边缘整齐，中心绒环状。球形隆起，有黏性，表面光滑，边缘整齐，中心绒环状。生物学特性：兼性厌氧，过氧化物酶阳性，氧化酶阴性，兼性厌氧，过氧化物酶阳性，氧化酶阴性，好气条件好气条件下下利用葡萄糖产酸不产气，利用葡萄糖产酸不产气，厌氧条件厌氧条件产酸缓慢。产酸缓慢。明胶碟形液化缓慢。不产生硫化氢，不利用丙二酸盐。明胶碟形液化缓慢。不产生硫化氢，不利用丙二酸盐。葡萄糖酸盐氧化和七叶苷水解不稳定。葡萄糖酸盐氧化和七叶苷水解不稳定。氯化钠浓度高于氯化钠浓度高于2 2以上时生长延缓，至以上时生长延缓，至6 67%7%时则完时则完全抑制。抗青霉素，对氯霉素、链霉素和土霉素敏感。全抑制。抗青霉素，对氯霉素、链霉素和土霉素敏感。细菌生长的温度范围细菌生长的温度范围6 637 37，最适温度，最适温度252527.527.5，致死温度致死温度45455050，10 min10 min，最适酸碱度为，最适酸碱度为pH6.0pH6.0。梨火疫病菌以简单的细胞分裂繁殖，一个细胞在条件梨火疫病菌以简单的细胞分裂繁殖，一个细胞在条件适宜时，天内在寄主植物组织中能达到适宜时，天内在寄主植物组织中能达到10109 9细胞，每个细细胞，每个细胞都是一个侵染源，感染寄主而引起病害的发展。胞都是一个侵染源，感染寄主而引起病害的发展。除除蛋白酶蛋白酶外，病菌不产任何有助于侵入寄主的酶，主外，病菌不产任何有助于侵入寄主的酶，主要是在环境条件适宜时，通过胞间组织侵入薄壁组织的病要是在环境条件适宜时，通过胞间组织侵入薄壁组织的病菌产生胞外多糖。菌产生胞外多糖。胞外多糖胞外多糖在病害发展过程中起重要的作用，其是菌脓在病害发展过程中起重要的作用，其是菌脓的重要成份。的重要成份。菌脓菌脓的理化性质随湿度变化而变化，干时皱、硬，大的理化性质随湿度变化而变化，干时皱、硬，大时膨胀易被雨水扩散，中等湿度的菌脓粘易被昆虫、风传时膨胀易被雨水扩散，中等湿度的菌脓粘易被昆虫、风传播。播。发病规律：病菌在病菌在病株病疤边缘组织处越冬病株病疤边缘组织处越冬，挂在树上的病果也是越，挂在树上的病果也是越冬场所，如果冬季温和，病菌还能在病株树皮上度过，来冬场所，如果冬季温和，病菌还能在病株树皮上度过，来年早春病菌在上年的溃疡处迅速繁殖，遇到潮湿、温和的年早春病菌在上年的溃疡处迅速繁殖，遇到潮湿、温和的天气，从病部渗出大量乳白色粘稠状的细菌分泌物，即为天气，从病部渗出大量乳白色粘稠状的细菌分泌物，即为当年的初侵染源，通过当年的初侵染源，通过昆虫、雨滴、风、鸟类以及人昆虫、雨滴、风、鸟类以及人的田的田间操作将病菌传给健株。间操作将病菌传给健株。病菌亦通过病菌亦通过伤口、自然孔口伤口、自然孔口（气孔、蜜腺、水孔）、（气孔、蜜腺、水孔）、花花侵侵入寄主组织，有一定损伤的花、叶、幼果和茂盛的嫩枝最入寄主组织，有一定损伤的花、叶、幼果和茂盛的嫩枝最易感病。易感病。传播途径近距离传播：近距离传播：雨水是果园短距离传播的主要因子，其次雨水是果园短距离传播的主要因子，其次风亦是中短距离传播的重要因子，往往在沿着盛行风的风亦是中短距离传播的重要因子，往往在沿着盛行风的方向，病原菌被风携带到较远距离。除次之外，昆虫对方向，病原菌被风携带到较远距离。除次之外，昆虫对病菌的传播扩散起一定的作用。传病昆虫包括蜜蜂在内病菌的传播扩散起一定的作用。传病昆虫包括蜜蜂在内有有7777个属的个属的100100多种昆虫，其中密蜂的传病距离约为多种昆虫，其中密蜂的传病距离约为200 200 400 m 400 m。远距离传播：远距离传播：主要是感病寄主繁殖材料，包括种苗、接主要是感病寄主繁殖材料，包括种苗、接穗、砧木、水果、被污染的运输工具、候鸟等。穗、砧木、水果、被污染的运输工具、候鸟等。发生条件：受伤的花朵、幼果和嫩稍最易受病菌侵染。受伤的花朵、幼果和嫩稍最易受病菌侵染。经冰雹袭击，病害蔓延更加迅速。经冰雹袭击，病害蔓延更加迅速。较高气温（较高气温（18182424）和较高的湿度（）和较高的湿度（7070以上）以上）有利于病菌侵染。有利于病菌侵染。检验方法：1.1.产地检验：产地检验：2.2.症状观察：症状观察：梨火疫病的症状很典型，是鉴定的重要方法，梨火疫病的症状很典型，是鉴定的重要方法，但必须与其他症状相似的梨梢枯病区分开。但必须与其他症状相似的梨梢枯病区分开。梨梢枯病仅限于危害花器、叶片和嫩梢，不危梨梢枯病仅限于危害花器、叶片和嫩梢，不危害枝条和茎干，病部无细菌溢脓，叶片上最初为害枝条和茎干，病部无细菌溢脓，叶片上最初为深褐色斑点，周围有红色晕圈，枯死的病叶不会深褐色斑点，周围有红色晕圈，枯死的病叶不会长期挂在树上长期挂在树上3.3.分离培养分离培养可采用选择性培养基和鉴别性培养基进行。MSMS培养基培养基菌落为红橙色，背景为兰绿色菌落为红橙色，背景为兰绿色。配方：琼脂配方：琼脂20g20g，甘露醇，甘露醇10g10g，L-L-天门冬酰胺天门冬酰胺3g3g，牛胆酸钠，牛胆酸钠2.5g2.5g，磷酸氢二，磷酸氢二钾钾2.0g2.0g，烟酸，烟酸0.5g0.5g，MgSOMgSO4 47H7H2 2O0.2gO0.2g，次氮基三乙酸，次氮基三乙酸0.2g0.2g，硫酸十七烷基，硫酸十七烷基钠钠0.1ml0.1ml，0.5%0.5%溴麝香草酚兰水溶液溴麝香草酚兰水溶液9ml9ml，0.5%0.5%中性红中性红2.5ml2.5ml，蒸馏水，蒸馏水970ml970ml，pH7.3pH7.3灭菌后加灭菌后加1%1%放线菌酮放线菌酮5ml5ml，1%1%硝酸铯水溶液硝酸铯水溶液1.75ml1.75ml。CGCG培养基在培养基在2929培养培养4848小时后形成小时后形成典型的火山口状菌落典型的火山口状菌落。配方：水配方：水380ml380ml，蔗糖，蔗糖160g160g，营养琼脂，营养琼脂12g12g，结晶紫，结晶紫0.8ml0.8ml（1%1%乙醇溶液），乙醇溶液），0.1%0.1%放线菌酮放线菌酮20ml20ml。TTC培养基培养基：该培养基是该培养基是Weise(1981)Weise(1981)设计的四氮锉设计的四氮锉-福美联培养基。梨火福美联培养基。梨火疫病菌在疫病菌在2727培养培养2 23 3天后，可产生天后，可产生红色肉疣状菌落红色肉疣状菌落。配方配方：营养琼脂营养琼脂37g37g，蔗糖，蔗糖100g100g，酵母粉，酵母粉5g5g，葡萄糖，葡萄糖15g,15g,水水100ml100ml，pH6.8pH6.87.27.2。灭菌后加灭菌后加0.5%TTC10ml0.5%TTC10ml，福美联，福美联8585250ml250ml。CCT半选择性培养基：TshimaruTshimaru和和KiosKios于于19841984设计的。梨火疫病菌设计的。梨火疫病菌 28 28培养培养4848小小时后，形成时后，形成淡紫色透明菌落，中央颜色略淡紫色透明菌落，中央颜色略深深。配方：蔗糖配方：蔗糖10g10g；山梨醇；山梨醇10g10g；1%SDS30ml1%SDS30ml，0.1%0.1%结晶紫乙醇溶液结晶紫乙醇溶液2ml2ml，营养琼脂，营养琼脂23g23g，蒸馏水，蒸馏水 970ml 970ml。灭菌后加入。灭菌后加入1%1%硝酸铯水溶液硝酸铯水溶液2ml2ml和放线菌酮和放线菌酮0.05g0.05g。Zeller改良高糖培养基：梨火疫病菌在此培养基上梨火疫病菌在此培养基上2727培养培养2 23 3天后，菌落大小天后，菌落大小为为3 37mm7mm，橙红色半球形，高度凸起，中心色深，有蛋橙红色半球形，高度凸起，中心色深，有蛋黄状中心环，表面光滑，边缘整齐黄状中心环，表面光滑，边缘整齐。配方：牛肉浸膏配方：牛肉浸膏8g8g，蔗糖，蔗糖50g50g，放线菌酮，放线菌酮50mg50mg，0.5%0.5%溴百里酚兰溴百里酚兰9ml9ml，0.5%0.5%中性红中性红2.5ml2.5ml，琼脂，琼脂20g20g，水，水1000ml1000ml，pH7.4pH7.4。4.4.致病性实验致病性实验梨火疫病菌致病性试验可用梨片或梨嫩枝测定，亦可用烟草过敏反映检梨火疫病菌致病性试验可用梨片或梨嫩枝测定，亦可用烟草过敏反映检查。查。NANA上培养上培养4848小时的细菌配成小时的细菌配成10108 8 cells/ml cells/ml的悬液，注入烟草叶片或接种于的悬液，注入烟草叶片或接种于1cm1cm厚梨片、或针刺接种于丈长的枝条，厚梨片、或针刺接种于丈长的枝条，2828下培养，一般下培养，一般10121012小小时后，烟草注射区出现白色坏死斑。时后，烟草注射区出现白色坏死斑。1313天后，梨片或枝条上出现白天后，梨片或枝条上出现白色菌脓，则可确诊。色菌脓，则可确诊。5.5.血清学检验：血清学检验：免疫荧光、免疫荧光、ELISAELISA、ODDODD和凝集实验和凝集实验6.6.分子生物学方法：分子生物学方法：核酸探针和核酸探针和PCRPCR技术技术分布：18891889年纽约首先报道，现已年纽约首先报道，现已2020多个国家。分布于美国、加拿多个国家。分布于美国、加拿大、墨西哥、越南、泰国、马来西亚、前苏联、波兰、瑞大、墨西哥、越南、泰国、马来西亚、前苏联、波兰、瑞士、意大利、前南斯拉夫、罗马尼亚、希腊、哥斯达黎士、意大利、前南斯拉夫、罗马尼亚、希腊、哥斯达黎加、波多黎各、圭亚那、秘鲁、巴西加、波多黎各、圭亚那、秘鲁、巴西。寄主植物 主要是甜玉米，也侵染马齿玉米、粉质玉米、硬主要是甜玉米，也侵染马齿玉米、粉质玉米、硬粒玉米和爆裂玉米。粒玉米和爆裂玉米。危害：维管束病害、毁灭性病害。维管束病害、毁灭性病害。症状：整个生育期都可危害，以开花期症状最明显。整个生育期都可危害，以开花期症状最明显。早期症状表现为植株矮化，萎蔫，雄穗退色早枯，叶片边缘产生波纹早期症状表现为植株矮化，萎蔫，雄穗退色早枯，叶片边缘产生波纹状不规则病斑。状不规则病斑。初期水浸状，黄色，与叶脉平行，贯穿全叶，宽初期水浸状，黄色，与叶脉平行，贯穿全叶，宽1 110mm10mm，严重时病，严重时病叶萎蔫死亡。叶萎蔫死亡。生长后期，叶片产生许多小病斑，结合成大块，火烧状干枯死亡。生长后期，叶片产生许多小病斑，结合成大块，火烧状干枯死亡。髓部有空腔，导管被黄色黏液阻塞，萎蔫植株的下部切口有黄色细菌髓部有空腔，导管被黄色黏液阻塞，萎蔫植株的下部切口有黄色细菌溢脓。溢脓。果穗的菌脓可通过内层包叶的气孔渗出，籽粒表面沾满细菌菌脓，病果穗的菌脓可通过内层包叶的气孔渗出，籽粒表面沾满细菌菌脓，病籽粒变形、皱缩和变色。籽粒变形、皱缩和变色。Necrotic lesions on mature leaves;second phase of Stewarts wilt disease.u病原菌：玉米细菌性枯萎病菌 学名 Pantoeastewartii(Smith)Mertaert et al.异名 Erwiniastewartii(Smith)Dye；Pseudomonasstewartii Smith;Apalnobacterstewartii(Smith)McCulloch;Bacillusstewartii(Smith)Holland;Bacteriumstewartii(Smith)Smith;Phytomonasstewartii(Smith)Bergye et al;Pseudobacteriumstewartii(Smith)Hrasilnikov,1949;Xanthomomasstewartii(Smith)Dowson英文名 Stewarts bacterial wilt of corn 分类地位 原核生物界(Procaryoces)，薄壁菌门(Gracilicutes)，肠杆菌科(Enterobacteri-aceae)，泛菌属(Pantoea)形态特征：好气性短杆菌，两端钝圆，无鞭毛，有荚膜，好气性短杆菌，两端钝圆，无鞭毛，有荚膜，G G，单生，单生或双生，或双生，0.40.80.40.80.92.20.92.2。在牛肉膏培养基上形成黄色圆形菌落，全缘，表面扁平光在牛肉膏培养基上形成黄色圆形菌落，全缘，表面扁平光滑，能利用葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、甘露糖、木糖、滑，能利用葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、甘露糖、木糖、甘油鹤甘露糖、醇等产酸，但不产生气体。在肉汤培养液甘油鹤甘露糖、醇等产酸，但不产生气体。在肉汤培养液中生长微弱，形成灰色环和黄色沉淀物。中生长微弱，形成灰色环和黄色沉淀物。细菌生长温度最低温度细菌生长温度最低温度8 899，最适温度，最适温度3030，最高温度，最高温度3939，致死温度，致死温度53 10min53 10min，适宜，适宜pH4.5pH4.58.58.5，最适，最适6.06.08.08.0。发病规律：初侵染来源初侵染来源带菌的种子和昆虫。带菌的种子和昆虫。土壤和病原残体不能越冬，昆虫是病原细菌的传播介体和重要的土壤和病原残体不能越冬，昆虫是病原细菌的传播介体和重要的越冬场所。越冬场所。最重要的传病昆虫是玉米叶甲，它以成虫带菌越冬，细菌存在于最重要的传病昆虫是玉米叶甲，它以成虫带菌越冬，细菌存在于消化道中。消化道中。越冬后在早播玉米苗上取食，引起初侵染，并产卵发育成新一代越冬后在早播玉米苗上取食，引起初侵染，并产卵发育成新一代成虫，继续向其它植株传病。成虫，继续向其它植株传病。Corn flea beetle(Chatocnema pulicaria)vector of the Stewarts wilt bacterium(Pantoea stewartii).u流行条件：发病与流行主要决定于冬季气温（发病与流行主要决定于冬季气温（1212、1 1、2 2月）的高月）的高低，若平均气温总和在低，若平均气温总和在3737以上，有利虫媒越冬，带以上，有利虫媒越冬，带菌昆虫成活率高，有可能引起发病。菌昆虫成活率高，有可能引起发病。低于低于3232则很少流行。此外有利于发病的条件包括土则很少流行。此外有利于发病的条件包括土壤氮肥水平偏高，钾肥水平偏低，高温高湿等。壤氮肥水平偏高，钾肥水平偏低，高温高湿等。u检验方法：1.产地检验：2.种植检验：种子长出的植株有明显的症状。3.分离培养：采用伊凡诺夫选择培养基，其成分如下：甘油30ml 柠檬酸铁铵10g 磷酸氢二钾2.5g,氯化钠15g硫酸镁0.1g,琼脂17g 氯化钙0.1g,蒸馏水1000ml,pH7.0 为了抑制杂菌的污染,还可采用选择性黑色素培养基,其成分如下:酵母浸膏 1g 甘油 30ml 制霉菌素 200mg/ml牛胆酸钠 3g 氯化钠 15g 1%水溶性黑色素20ml琼脂 17g 蒸馏水 1000ml pH6.730下培养7d，对光观察，菌落中心呈黑色，边缘透明，菌落圆形，表面光滑，呈粘状。将分离的细菌接种在玉米苗上，验证是否发病。4.噬菌体检验法：用专化性噬菌体，如ZP6、ZP82等检验。5.血清学检验：用酶联免疫法等检验。1.禁止从国外疫区进口玉米种子2.种子处理：（1）微波炉70处理10min，效果很好。（2）环氧乙烷熏蒸：（3）恒温处理：50下处理4d，消灭种子内部细菌效果显著，不影响发芽。（4）抗菌素温浸法：3.防治传播媒介昆虫：4.种植抗病品种：分布：19391939年在中国广东发现该病，现已扩展到亚洲和非洲年在中国广东发现该病，现已扩展到亚洲和非洲4040多多个国家和地区，中国主要发生在广东、广西、福建、台湾、海南、云个国家和地区，中国主要发生在广东、广西、福建、台湾、海南、云南、贵州、四川、浙江、湖南、江西等省。南、贵州、四川、浙江、湖南、江西等省。寄主：主要是柑橘属、金柑属和枳属。草本植物有长春花主要是柑橘属、金柑属和枳属。草本植物有长春花 。？危害：是柑橘的毁灭性病害，感病的柑桔品种得病后可在是柑橘的毁灭性病害，感病的柑桔品种得病后可在3 35 5年内年内丧失结果能力，甚至枯死丧失结果能力，甚至枯死。症状：典型症状是在浓绿的树冠中出现典型症状是在浓绿的树冠中出现1 12 2条或多条的发黄枝梢，条或多条的发黄枝梢，有两种类型：一种是整张叶片均匀黄化有两种类型：一种是整张叶片均匀黄化 ，另一种是叶片呈黄绿相间的斑，另一种是叶片呈黄绿相间的斑驳状驳状 。共同特点是叶质硬化、无光泽，但在黄梢下部的老叶仍呈正常绿。共同特点是叶质硬化、无光泽，但在黄梢下部的老叶仍呈正常绿色。病果小，果皮光滑，畸形，无光泽，味酸，果皮着色时黄绿不均匀色。病果小，果皮光滑，畸形，无光泽，味酸，果皮着色时黄绿不均匀或在果蒂附近变橙红色，而其余部份仍为青绿色的青果或在果蒂附近变橙红色，而其余部份仍为青绿色的青果 叶：老叶斑驳，新叶缺素状；果：叶：老叶斑驳，新叶缺素状；果：“红鼻果红鼻果”、“青果青果”病原Candidatus Liberibacter asiaticus（亚洲种）、Candidatus Liberibacter africanus（非洲种）、Candidatus Liberibacter americanus（美洲种）分类地位：分类地位：原核生物界原核生物界(Procaryoces)(Procaryoces)，薄壁菌门，薄壁菌门(Gracilicutes)(Gracilicutes)，韧皮部杆菌属，韧皮部杆菌属 LiberobacterLiberobacter英文名称：英文名称：Citrus HuanglongbingCitrus Huanglongbing；Citrus Yellow shootCitrus Yellow shoot；Citrus greeningCitrus greening 未能在人工培养基上分离获得纯培养，在电镜下为椭圆形未能在人工培养基上分离获得纯培养，在电镜下为椭圆形或短杆状的细菌，大小为或短杆状的细菌，大小为303060060050050014001400 m m，细胞壁，细胞壁厚度为厚度为252530 30 m m。革兰氏染色阴性，对四环素及青霉素敏。革兰氏染色阴性，对四环素及青霉素敏感。感。根据其对热的反应和传病木虱的不同，分为两个株系：在根据其对热的反应和传病木虱的不同，分为两个株系：在亚洲，其发病的最适温度为亚洲，其发病的最适温度为27273232，传播介体为亚洲木，传播介体为亚洲木虱虱（Diaphorina citriDiaphorina citri），），病原为柑桔黄龙病原亚洲株系病原为柑桔黄龙病原亚洲株系（L.L.asiaticumasiaticum）；）；在非洲，其发病的最适温度为在非洲，其发病的最适温度为202024,24,传播传播介体为非洲木虱介体为非洲木虱 （Trioza aryteaeTrioza aryteae）病原为柑橘黄龙病非洲）病原为柑橘黄龙病非洲株系（株系（L.africanumL.africanum）。）。可以通过嫁接及菟丝子传播，但不能通过汁液和土壤传播。可以通过嫁接及菟丝子传播，但不能通过汁液和土壤传播。传播：远距离传播主要是来自病区调运的苗木、接穗；大田主要依远距离传播主要是来自病区调运的苗木、接穗；大田主要依靠柑橘木虱进行传播，在亚洲是亚洲木虱，在非洲是非洲靠柑橘木虱进行传播，在亚洲是亚洲木虱，在非洲是非洲木虱木虱 。发生条件：亚洲多发生在热带亚热带地区，喜高温；在非洲多在冷凉气亚洲多发生在热带亚热带地区，喜高温；在非洲多在冷凉气候下发生，候下发生，3030以上高温病害受抑制以上