第五章脂类的测定

第五章 脂类的测定本章主要学习内容有三节。第一节的脂类概述中，对于脂类的种类、存在形式、测定意义及样品预处理进行介绍；第二节脂类测定方法中，以总脂测定为主要学习内容，总脂的测定方法分为两类，一类是直接测定法，主要针对游离态脂类物质的测定，主要学习两种具体方法索氏提取法和氯仿-甲醇提取法，其中索氏提取法是学习重点，对其所有的内容都要掌握，氯仿-甲醇提取法的原理及适用范围要了解；第二类是化学处理后萃取法，针对非游离状态的结合态脂类进行测定，主要掌握酸水解法，了解三种乳脂肪的测定方法，这三种测定方法均为酸水解或碱水解法。第三节食用油脂指标的测定中，只需掌握碘价、酸价、过氧化值、羰基价等概念即可。第一节 脂类的概述一、食品中的脂类物质和脂肪含量：脂类为俗称。检测标准中常以“总脂”或“正乙烷或乙醚可提取物”等术语来体现。脂类分为真脂和类脂。真脂：包括脂肪/油脂；类脂：包括脂肪酸、磷脂、糖脂、甾醇等。多数动、植物食品都含天然脂肪或类脂化合物。食品中脂肪存在形式：食品中脂肪有游离态存在形式的，如动物性脂肪及植物性油脂；也有结合态的，如天然存在的磷脂、糖脂、脂蛋白及某些加工品（如焙烤食品及麦乳精等）中的脂肪，与蛋白质或碳水化合物形成结合态。对大多数食品来说，游离态脂肪是主要的，结合态脂肪含量较少。植物性或动物性油脂中脂肪含量最高，水果蔬菜脂肪含量很低。几种食物100 g中脂肪含量(g)如下：猪肉(肥) 90.3 核桃 66.6花生仁 39.2 青菜 0.2 柠檬 0.9 苹果 0.2牛乳 3 以上 香蕉 0.8全脂炼乳 8 以上 全脂乳粉 2530以上这些脂类含量一般是指用乙醚提取的脂类总量。二、脂类物质的测定意义脂肪是食品中重要的营养成分之一，为人体提供必需脂肪酸；是脂溶性维生素良好溶剂；脂蛋白参与人体代谢；脂肪是一种富含热能营养素，每克脂肪在体内可提供 37.62 kJ (9 kcal) 热能，是食物中能量最高的营养素；在食品加工生产过程中，原料，半成品，成品的脂类含量对产品风味、组织结构、品质、外观、口感等都有直接影响，所以脂肪含量是一项重要控制指标。三、脂类的测定脂类的测定项目很多，我们只介绍脂类总量的测定。不同来源的食品所含的脂肪在结构上有许多差异，所以没有一种通用的提取剂。脂类的共同特点是在水中的溶解度非常小，能溶于脂肪溶剂中，再根据相似相溶的规律具体选择。1. 乙醚：有一定极性，但不如乙醇、甲醇、水等，溶解脂肪的能力强，应用最多。GB中关于脂肪含量的测定都采用它作提取剂。乙醚沸点低（34.6），易燃。乙醚可饱和2%的水，含水乙醚在萃取脂肪的同时，会抽提出糖分等非脂成分。所以必须用无水乙醚作提取剂，被测样品也要事先烘干（原因要清楚）。2. 石油醚：石油醚的沸点比乙醚高，不太易燃，溶解脂肪能力比乙醚弱，吸收水分比乙醚少，允许样品含微量的水分。有时也采取乙醚+石油醚共用。但乙醚、石油醚都只能提取样品中游离态的脂肪。3. 氯仿-甲醇：一种有效的溶剂，对脂蛋白、磷脂提取效率较高。特别适用于水产品、家禽、蛋制品中脂肪的提取。样品预处理：（1）固体样品要粉碎，颗粒大小要合适，注意粉碎过程中的温度，防止脂肪氧化。（2）样品要干燥，但干燥过程中要注意温度的控制，如果温度低酶活力高，脂肪易降解，而温度高脂肪易氧化成结合态。较理想的方法是冷冻干燥法。（3）酸水解：对于乙醚不能渗入内部的或含结合态脂肪采用该法。第二节 脂类的测定方法总脂的测定可分为：直接萃取法：索氏提取法、氯仿-甲醇提取法化学处理再萃取法：酸水解法、碱水解法即罗兹-哥特里法、酸水解法的巴布科克氏及盖勃法减法测定法：（用于脂肪含量超过80%的样品，采用去水法或去不溶杂质法，见P101/102页一、直接萃取法：（一）索氏提取法（索克斯列特抽提法）（该法的所有内容都要掌握）1. 原理：将经前处理的、分散且干燥的样品用乙醚或石油醚等溶剂回流提取，使样品中的脂肪进入溶剂中，回收溶剂后所得到的残留物，即为粗脂肪。粗脂肪指残留物中除游离脂肪外，还含有色素、树脂、蜡状物、挥发油等。（引入索氏提取器详细讲解其结构及连接方式）2. 适用范围与特点适用于脂类含量较高，结合态脂类含量少或经水解处理过的（结合态已转变成游离态），样品应能烘干，磨细，不易吸湿结块。此法是经典的脂类测定方法，对于大多数样品的测定结果比较可靠。但缺点是费时长（324h），溶剂用量大，需要专门的仪器索氏提取器进行检测。3. 测定方法（1）滤纸筒的制备：将滤纸裁成8cm15cm大小，以直径2.0cm的大试管为模型，将滤纸紧靠试管壁卷成圆筒型，把底端封口，内放一小片脱脂棉，用白细线扎好定型，在100105烘箱中烘至恒量（准确至0.0002g）。或用直径约15cm的圆片滤纸片按以下图示方法制作滤纸筒。（2）样品处理a、固体样品：精密称取干燥并研细的样品 25g（可取测定水分后的样品)，必要时拌以海砂（防结块），无损地移入滤纸筒内。 b、半固体或液体样品：称取5.010.0g于蒸发皿中，加入海砂约20g于沸水浴上蒸干后，再于95105烘干、研细，全部移入滤纸筒内，蒸发皿及粘附有样品的玻璃棒都用沾有乙醚的脱脂棉擦净，将棉花一同放进滤纸筒内。（3）索氏提取器的准备索氏抽提取器是由回流冷凝管、提脂管、提脂烧瓶三部分所组成，抽提脂肪之前应将各部分洗涤干净并干燥，提脂烧瓶需烘干并称至恒重。（4）抽提将滤纸筒或滤纸包放入提脂管内，连接已干燥至恒重的脂肪接受瓶，由冷凝管上端加入无水乙醚或石油醚（3060沸程），加量约为接受瓶的2/3体积，于水浴(夏天65，冬天80左右)加热使乙醚或石油醚不断的回流提取，控制每分钟滴下乙醚80滴左右，时间一般视含油量高低而定，324h，至抽提完全为止（用滤纸试）。（5）回收溶剂及称重取出滤纸筒，用抽提器回收乙醚，当乙醚在提脂管内将虹吸时（液位接近弯管高度时）立即取下提脂管，将其下口放到盛乙醚的试剂瓶口，使之倾斜，使液面超过虹吸管，乙醚即经虹吸管流入瓶内。按同法继续回收，将乙醚完全蒸出后，取下提脂烧瓶，于水浴上蒸去残留乙醚。用纱布擦净烧瓶外部，于100105烘箱中烘至恒量并准确称量。或将滤纸筒置于小烧杯内，挥干乙醚，在100 105烘箱中烘至恒量，滤纸筒及样品所减少的质量即为脂肪质量。所用滤纸应事先用乙醚浸泡挥干处理，滤纸筒应预先恒量。4、结果计算脂肪()(m2-m1) / m100m2接受瓶和脂肪的质量（或滤纸筒和残留物质量），g； ml接受瓶的质量（或抽提后滤纸筒质量），g； m无水样品的质量，g。5. 注意及说明 样品应干燥后研细，样品含水分会影响溶剂提取效果，而且溶剂会吸收样品中的水分造成非脂成分溶出。装样品的滤纸筒一定要严密，不能往外漏样品，但也不要包得太紧影响溶剂渗透。放入滤纸筒时高度不要超过虹吸回流弯管，否则弯管上部的样品中脂肪不能提尽，造成误差。 对含多量糖及糊精的样品，要先以冷水使糖及糊精溶解，经过滤除去，将残渣连同滤纸一起烘干，再一起放入抽提管中。 抽提用的乙醚或石油醚要求无水、无醇、无过氧化物，挥发残渣含量低。因水和醇可导致水溶性物质溶解，如水溶性盐类、糖类等，使得测定结果偏高。过氧化物会导致脂肪氧化，在烘干时也有引起爆炸的危险。乙醚中过氧化物的检查方法：取6mL乙醚，加2mL 10%的碘化钾溶液，用力振摇，放置1min，若出现黄色，则证明有过氧化物存在。过氧化物如:H2O2、Na2O2、CaO2、BaO2、ZnO2、 MgO2等 提取时水浴温度不可过高，以每分钟从冷凝管滴下80滴左右，每小时回流612次为宜，提取过程应注意防火。 在抽提时，冷凝管上端最好连接一个氯化钙干燥管，这样，可防止空气中水分进入，也可避免乙醚挥发在空气中，如无此装置可塞一团干燥的脱脂棉球。 可凭经验确定抽提是否完全，也可用滤纸或毛玻璃检查，由抽提管下口滴下的乙醚滴在滤纸或毛玻璃上，挥发后不留油迹表明抽提完全。 在挥发乙醚或石油醚时，切忌用直接火加热，应该用电热套，电热水浴锅等。烘前应驱除全部残余的乙醚，因乙醚稍有残留，放入烘箱时，有发生爆炸的危险。 反复加热会因脂类氧化而增重。重量增加时，以增重前的重量作为恒重。另：因为乙醚是麻醉剂，要注意室内通风。6、改进型直滴式抽提法（快速测油器，此部分了解）快速测油器是在索氏提取的基础上发展起来的一种脂类测定仪器，有多种结构形式，基本工作原理是：盛有试样滤纸筒置入抽提筒，用乙醚抽提脂肪，抽净后，取滤纸筒，关三通阀，继续加热直接回收乙醚。效率高于索氏法，但仍需要3-8h，主要的区别在于比索氏法的提取管内径变大、滴口呈锯齿形、抽提筒在烧瓶中，使得温度高、烧瓶口径大，烘干时间短。国外的快速测脂装置特卡托脂肪测定仪是先把被测量的样品放到乙醚中浸煮提出大部分的脂肪，再将样品提升于乙醚的液面以上，用乙醚进行淋洗出样品中残余的油。（二）氯仿-甲醇提取法（又称CM法，掌握原理和应用特性即可）原理：将试样分散于氯仿-甲醇混合溶液中，在水浴中轻微沸腾，氯仿、甲醇和试样中的水分形成三种成分的溶剂，可把包括结合态脂类在内的全部脂类提取出来。过滤除去非脂成分，回收溶剂，残留的脂类可用石油醚提取，蒸馏除去石油醚后定量。本法适用于结合态脂类，特别是磷脂含量高的样品，如鱼、贝、肉、蛋、大豆及其制品。二、化学处理后萃取法某些食品中，脂肪被包含在食品组织内部，或与食品成分结合而成结合态脂类，如，谷物等淀粉颗粒中的脂类，面条、焙烤食品等组织中包含的脂类，用索氏提取法不能完全提取出来。这种情况下，可用强酸将淀粉、蛋白质、纤维素水解，使脂类游离出来，再用有机溶剂提取。（一）酸水解法（要求全掌握）1. 原理：将试祥与盐酸溶液一同加热进行水解，使结合或包藏在组织里的脂肪游离出来，再用乙醚和石油醚提取脂肪，回收溶剂，干燥后称量，提取物的重量即为脂肪含量。2. 适用范围与特点：此法适用于各类、各种状态的食品中脂肪测定。特别是脂肪被包含成结合态或加工后的混合食品，易吸湿，不好烘干的，用索氏提取法不行的样品，效果更好。本法不适于测定含磷脂高的食品、如：鱼、贝、蛋品等。因为在盐酸加热时，磷脂几乎完全分解为脂肪酸和碱，当只测定前者时，使测定值偏低。本法也不适于测定含糖高的食品，因糖类遇强酸易炭化而影响测定。3. 测定方法（1）水解：准确称取固体样品2g于50ml大试管中，加入8mL水，用玻璃棒充分混合，加10ml盐酸。或称取液体样品10g于50mL大试管中，加10mL盐酸。混匀后于7080 的水浴中，每隔510min用玻璃棒搅拌一次至脂肪游离为止，约须4050min，取出静置，冷却。（2）提取：取出试管加入10mL乙醇，混合。冷却后将混合物移入100mL具塞量筒中，用25mL乙醚分次冲洗试管，洗液一并倒入具塞量筒内。加塞振摇1min,将塞子慢慢转动放出气体，再塞好，静置15min，小心开塞，用石油醚-乙醚等量混合液冲洗塞及筒口附着的脂肪。静置1020min,待上部液体清晰，吸出上层清液于已恒重的锥形瓶内，再加入5ml乙醚于具塞量筒内振摇，静置后仍将上层乙醚吸出，放入原锥形瓶内。将锥形瓶于水浴上蒸干，置95105 烘箱中干燥2h，取出放干燥器中冷却30min后称量。（3）结果计算：式中 脂类质量分数，%； m 试样质量，g; m1 空锥形瓶质量，g; m2 锥形瓶与样品脂类质量，g;（4）说明（要求掌握）开始加入8mL水是为防止后面加盐酸时干试样固化，水解后加入乙醇可使蛋白质沉淀，降低表面张力，促进脂肪球聚合，同时溶解一些碳水化合物如糖，有机酸等。后面用乙醚提取脂肪时因乙醇可溶于乙醚故需加入石油醚降低乙醇在醚中的溶解度，使乙醇溶解物残留在水层，使分层清晰。挥干溶剂后残留物中若有黑色焦油状杂质，是分解物与水一同混入所致，会使测定值增大造成误差，可用等量的乙醚及石油醚溶解后，过滤，再次进行挥干溶剂的操作 若无分解液等杂质混入，通常干燥2h即可恒量。以上的索氏提取法及酸水解法都是国标方法，见GB/T 5009.62003食品的脂肪测定1.索氏提取法 2.酸水解法下面介绍三种乳脂肪的测定方法，都属于化学处理后萃取法的脂类测定。（二）罗兹-哥特里法（Rose-Gottlieb）1. 原理（又可称为碱性乙醚提取法，可掌握其中的一些知识点）利用氨-乙醇溶液破坏乳的胶体性状及脂肪球膜，使非脂成分溶解于氨-乙醇溶液中，而脂肪游离出来，再用乙醚-石油醚提取出脂肪，蒸馏去除溶剂后，残留物即为乳脂肪。脂肪球膜存在的条件是在酪蛋白的等电点 pI4.6（乳液的pH6.56.7）2. 适用范围与特点本法适用于各种液状乳(生乳、加工乳、部分脱脂乳、脱脂乳等)，各种炼乳、奶粉、奶油及冰淇淋等能在碱性溶液中溶解的乳制品，也适用于豆乳或加水呈乳状的食品。本法为国际标准化组织(ISO)，(FAO/WHO)等采用，为乳及乳制品脂类定量国际标准法。3. 测定方法主要仪器抽脂瓶：内径2.02.5cm容积100mL，如图。取一定量样品于抽脂瓶中，分别加入氨水，乙醇，乙醚，石油醚，充分摇匀，待上层液澄清时读取醚层体积，放出一定体积醚层于一已知重量的烧瓶中，蒸馏回收乙醚和石油醚，烘干至恒重，称重。（三）巴布科克法和盖勃氏法（测乳脂肪）1.原理（也是国标方法，见GB/T5009.46） 用浓硫酸溶解乳中的乳糖和蛋白质等非脂成分，将牛奶中的酪蛋白钙盐转变成可溶性的重硫酸酪蛋白，使脂肪球膜被破坏，脂肪游离出来，再利用加热离心，使脂肪完全迅速分离，直接读取脂肪层的数值，便可知被测乳的含脂率。2. 适应范围与特点这两种方法都是测定乳脂肪的标准方法，适用于鲜乳及乳制品脂肪的测定。对含糖多的乳品（如甜炼乳、加糖乳粉等），采用此方法时糖易焦化，使结果误差较大，故不适宜。此法操作简便，迅速。对大多数样品来说测定精度可满足要求，但不如重量法准确。（引入图片讲解两种乳脂瓶的结构）3. 测定方法（以巴布科克为例）精密吸取17.6mL样品，倒入巴布科克氏乳脂瓶中，再取17.5mL硫酸，沿瓶颈缓缓注入瓶中，将瓶颈回旋，使液体充分混合，至无凝块并呈均匀棕色。置乳脂离心机上，以约1000r/min的速度离心5min，取出，加入80C以上的水至瓶颈基部，再置离心机中离心2min，取出后再加入80C以上的水至脂肪浮到2或3刻度处，再置离心机中离心1min，取出后置5560C水溶中，5min后立即读取脂肪层最高与最低点所占的格数，即为样品含脂肪的百分数。4. 说明及讨论 硫酸的浓度要严格遵守规定的要求，如过浓会使乳炭化呈黑色溶液而影响读数；过稀则不能使酪蛋白完全溶解，会使测定值偏低或使脂肪层混浊。 硫酸除可破坏脂肪球膜，使脂肪游离出来外，还可增加液体相对密度，使脂肪容易浮出。 盖勃法会加入异戊醇，作用是促使脂肪析出，并能降低脂肪球的表面张力，以利于形成连续的脂肪层 加热（6570C水浴中）和离心的目的是促使脂肪离析。 巴布科克法中采用17.6mL标准吸管取样，实际上注入巴氏瓶中的样品只有17.5mL，牛乳的相对密度为1.03，故样品重量为17.51.03=18g。巴氏瓶颈的刻度（0-10%）共10个大格，每大格容积为0.2mL，在60C左右，脂肪的平均相对密度为0.9，故当整个刻度部分充满脂肪时，其脂肪重量为0.2100.9=1.8g。18g样品中含有1.8g脂肪，即瓶颈全部刻度表示为脂肪含量10%，每一大格代表1%的脂肪。故瓶颈刻度读数即为样品中脂肪百分含量。 每组样品取两只乳脂瓶进行测定。放入离心机时，必须对称放置。 硫酸的浓度和用量必须严格按照规定，沿瓶壁缓慢加入，回旋摇动，使充分混合 ，否则易时脂肪层产生黑色块粒。注：三种测定乳脂肪方法的准确度比较： 罗兹-哥特里法巴布科克法盖勃法第三节 食用油脂的指标检测（掌握概念）一、酸价的测定1. 概述酸价 中和 1 g 油脂中的游离脂肪酸所需氢氧化钾的质量 （mg)。酸价是反映油脂酸败的主要指标。2.操作（1）称取均匀的油样注入锥形瓶。（2）加入中性乙醚-乙醇溶液50ml，摇动，使油样完全溶解。（3）加2-3滴酚酞指示剂，用0.1mol/L的碱液滴定至出现微红色在30秒内不消失，记下消耗的碱液毫升3.结果计算以酸价表示油脂酸价按下列公式计算酸价（mg KOH /g 油）=V C56.1 /W用游离脂肪酸的百分含量来表示 FFA% = AV 脂肪酸分子量/56.1081/10对于某一脂肪酸，其分子量为常数，于是 f =脂肪酸分子量/56.108 1/10 则FFA%=fAV我国制定的油脂“酸价”标准为：一级不超过0.3，二级不超过0.5，三级不超过1，四级不超过3。也就是说，酸价在3以下对人体是安全的 。 油脂酸败后会产生强烈的异味，营养价值降低，脂溶性维生素（维生素A、D、E）受到破坏。酸败的油脂用于烹调时，食物中的易氧化维生素也会受到破坏。油脂酸败后产生的氧化物对人体的酶系统，如琥珀酸氧化酶、细胞色素酶等有破坏作用。实验表明，动物长期食用酸败油脂可出现体重减轻、发育障碍、肝脏肿大等现象，并可诱发肿瘤。二、碘价的测定碘价（碘值）100 g 油脂所吸收的氯化碘或溴化碘换算成碘的质量 （g)。碘价在一定范围内反映油脂的不饱和程度。三、过氧化值的测定1.概述过氧化值 滴定 1 g 油脂所需用( 0.002 mol/L ) Na2S2O3 标准溶液的体积（mL)。过氧化值的大小是反映油脂是否新鲜及酸败程度。2.操作（1）称取混合均匀的油样2-3g于碘量瓶中，或先估计过氧化值，再按表称样。（2）加入氯仿-冰乙酸混合液30ml，充分混合。（3）加入饱和碘化钾溶液1ml，加塞后摇匀，在暗处放置3分钟。（4）加入50ml蒸馏水，充分混合后立即用0.01mol/L硫代硫酸钠标准溶液滴定至浅黄色时，加淀粉指示剂1ml，继续滴定至蓝色消失为止。（5）同时做不加油样的空白试验。3.计算过氧化值(I2%)=(V1-V2)N0.1269/W 100 V1-油样用去的硫代硫酸钠溶液体积ml V2-空白试验用去的硫代硫酸钠溶液体积ml N-硫代硫酸钠溶液的当量浓度 W-油样重g 0.1269-1mg当量硫代硫酸钠相当于碘的克数用过氧化物氧的毫克当量数表示时，可按下式计算 过氧化值（meq/kg）= (V1-V2)N/W1000两种表示法间的换算关系 meq/kg=I2%78.9四、皂化价的测定皂化价中和 1 g 油脂中的全部脂肪酸（游离+ 结合的）所需氢氧化钾的质量 （mg)。皂化价可对油脂的种类和纯度进行鉴定。五、羰基价的测定用羰基价来评价油脂中氧化物的含量和酸败程度。总羰基价 用比色法测定。本章要掌握的知识点：1. 脂类测定提取剂的种类、优缺点。2. 索氏提取法的原理、方法、注意事项。3. 乳脂肪的测定方法有哪几种？比较检测准确性4. 食用油脂特性（酸价、碘价、氧化值、过氧化值、皂化价、羰基价）的定义。8