好氧亚硝化颗粒污泥中硝化细菌群落结构分析1

AAA第27卷第9期2006年9月环 境 科 学ENV IRONM EN TAL SCIENCE好氧亚硝化颗粒污泥中硝化细菌群落结构分析孙寓姣，左剑恶3，杨洋，鲁颐琼，邢薇，卜德华(清华大学环境科学与工程系，北京100084)摘要:在小试好氧上流式污泥床(AUSB)反应器中，实现了由厌氧颗粒污泥到好氧硝化污泥再到亚硝化颗粒污泥的转化， AUSB反应器的亚硝化率稳定在90 %以上.利用FISH、荧光实时定量PCR等技术，考察了 AUSB反应器中好氧颗粒污泥中硝 化菌群的生态分布.结果表明：好氧亚硝化颗粒污泥呈层状结构，氨氧化细菌(AOB)主要分布在颗粒污泥表层，亚硝酸盐氧化 细菌(NOB)多分布在内层，颗粒内核则无活性细胞；随反应器氨氮负荷逐渐提高，颗粒污泥中AOB的相对含量逐渐升 高，当N H32N负荷分别为0、014、1、212kg/ ( m3 d)，亚硝化率分别为0 %、35 %、50 %、99 %时,污泥中AOB在真细 菌总量中所占比例分别为到0145 %、5120 %、15137 %和 48155 %.入关键词：亚硝化；好氧颗粒污泥;分子生态学;群落结构中图分类号:X70311文献标识码:A 文章编号:025023301 (2006) 0921858204Community Structure of Nitrif ication Bacteria in Aerobic Short2Cut Nitrif icationGranuleSUN Yu2jiao , ZUO J ian2e , YAN G Yang , L U Y2qiong , XIN G Wei , BU De2hua(Department of Environmental Science and Engineering , Tsinghua University , Beijing 100084 , China)Abstract : By using a lab 2scale aerated upflow sludge bed reactor , t he inoculated anaerobic granule was cultivated to aerobic nitrification granule , and t hen converted to short 2cut nitrification granule wit h t he short 2cut nitrification efficiencies above 90 %. Appling real 2time quantity PCR , and florescent i n sit u hybridization techniques , t he ecological community structure of nitrification bacteria in aerobic granules were studied. The results show t hat t here existed a layered structure in t he aerobic granule , t he ammonia oxidizing bacteria (AOB) was mainly located in t he surface area of t he granule , and t he nitrite oxidizing bacteria (NOB) was mainly located in t he inner area of t he granule , was just adjacent to t he AOB. There was no active bacteria in t he inner core area. The amount of AOB in t he granules increased , as t he ammonia loading rate of t he reactor was increased gradually. The percentage of AOB in t he total amount of Eubacteria in t he granule was 0 145 % , 5 120 % , 15 137 % , 48 155 % respectively , as t he ammonia loading rate of t he reactor were 0,0 14,110 and 212 kg/ ( m3 d) respectively , and t he nitrosofication efficiency were 0 % , 35 % , 50 % , 99 % relatively.Key words : short2cut nitrification ; aerobic granular sludge ; molecular ecology ; community structure废水生物脱氮工艺可以有效将废水中的氮素污AAA染物转化为氮气，最终达到去除废水中氮素 污染物的目的，但传统的先硝化再反硝化的工艺流程很 长，而且在硝化过程中还需要消耗大量的氧气和碱度, 在反硝化过程中又需要加入足量的有机碳源，因此 如何缩短生物脱氮途径、简化工艺流程以及降低行能耗是目前废水生物脱氮领域的研究热点.实现入1材料与方法11 颗粒污泥样品试验中共采集了 4个颗粒污泥样品，均取11个接种厌氧颗粒污泥与少量好氧硝化污泥的小试AU SB反应器该反应器的总容积3 05L，其中反应 L底部安装曝气装区1, 置，全无机含氨氮自配水1 1入稳定高效的亚硝化工艺是缩短生物脱氮途径、简化 从底部进入反应器，经污泥床进入沉淀区后排出，工艺流程的关键第一步，也是众多新型生物脱氮工 过长期运行，逐渐实现了稳定的亚硝化功能，并成功 艺的关键步骤1 ,2 .本研究以厌氧产甲烷颗粒污泥地使接种的厌氧颗粒污泥转化为好氧硝化颗粒污和少量好氧硝化污泥接种启动1个好氧上流式污泥 床(Aerated Upflow Sludge Bed , AU SB)反应器，实 现了由厌氧颗粒污泥到硝化颗粒污泥，再到亚硝化颗粒污泥的转化，亚硝化颗粒污泥反应器运行稳定； 利用分子生物学技术对该反应器运行过程中4个不泥，并最终转化为好氧亚硝化颗粒污泥.1 2仪器与试剂( )DNA提取试剂天为时代 ；DNA盒DP301纯1入收 基金项 作者简同阶段的颗粒污泥样品中的微生物种群结构进行了 研究.C 1994-2009 China Academic Journal ElectroniL Publishing House. All rights reseivcd.AA化试剂盒（鼎国A014）;杂交仪（Thermo Hybaid Biorad）;激光共聚焦显微镜（Olympus） ; Promega公司pGET Vector System I ; S YBR Green 荧光定M量试剂（）；博日荧光定量PCR盒天为时代FP201仪（Bioer FQD 33A）.13 方法与步骤1 3 1 颗粒污泥基因组DNA的提取采用冻融破壁法提取颗粒污泥样品的总基因组DNA，首先利用蛋白酶K水解,Tris饱和酚萃取与 异丙醇沉淀分离3 ，最后采用DNA纯化试剂盒进 行纯化.1 3 2 荧光原位杂交（F ISH）采集污泥样品，立即用新配制的4 %多聚甲醛溶液固定，PBS缓冲液洗涤后，于PBS缓冲液和无 水乙醇等体积混合液中在-20 C保存.利用石蜡包埋切片技术对颗粒污泥进行处理4，5 ，首先将颗粒 污泥固定，之后采用乙醇、水、叔丁醇混合物处理，再 用石蜡进行包埋后切片，切片厚度为8“m，展片之 后移入涂有Vectaboud的载玻片上，干燥后用TBA、 乙醇及二甲苯等进行脱蜡.采用ROX （红色）标记的氨氧化细菌N SO190 探（）针（绿色）标记G的亚硝硝酸盐氧化杆菌3n和T31探针（5，CCT GT GCTCCA T GCTCC &3 6 对颗粒污泥切进行双重杂交7 ，杂交温度46 C，甲酰胺浓度分别 为55 %和 40 %，同时利用DA PI染色作为背景，最 后在激光共聚焦显微镜上扫描成像.1 3 3 荧光定量 PCR （ R TQ PCR）分别选用2对针对真细菌和氨氧化细菌I 物，经运行PCR确定各自的最佳运行条件和参数， 如表1所示.以氨氧化细菌16S rDNA的189654序列片段的T质粒载体克8隆 作为定量标准品用TA粘末端克隆法制备重组质粒，并将其进行倍 比稀释，稀释度分别 、为:1061（7 、108、109 copies/ m在荧光定量PCR检测中，利用标准品扩增得到定量 标准曲线，并结合标准曲线对样品进行定量分析.表1 RTQ PCR的引物及运行参数细菌种类Table 1Primers and parameters of RTQ PCR 引物名称 序列 运行条件95 3 ACTCCTACGGGA GGcAP338fG3预变性 94 C 3min，变性 94 C 10s，复性 55 C5 3 A TTACCGCGGCT GCTP518rGG3315s，延伸 72 C30s，35 个循环氨氧化细菌P189f10 预变性 94 C 3min，变性 94 C 10s，复性 57 C5 GGA GRAAA GCA GGCTA3GCYTT GTAP654rGTTTCAAACGC320s，延伸 72 C 25s，35 个循环2结果与讨论21 好氧亚硝化工艺的实现及颗粒污泥的获得AU SB反应器180d运行情况如图1所示反应 器接种启动后，对进水中氨氮的去除率在前40d内 均较低，仅为65 %左右;在随后40d的运行中，氨氮 去除率明显提高，平均达到85 %以上;但此时，反应 器的亚硝化率（即出水中亚硝酸盐占总硝态氮的比 例）很低，说明该反应器此时主要完成的仍是全程硝中可以看出4次取样点相应的反应器工艺运行状况.2 2 AOB与NOB在颗粒污泥中的空间分布 利用分别针对AOB以及NOB中硝化杆菌的N SO190和N IT3探针对4个污泥样品中的AOB和NOB的空间分布进行原位观察，结果如图2所示. 从图2中可看出，在接种的厌氧颗粒污泥（样品A） 中，2类细菌都几乎未能见到而在样品B和C中， 则可同时发现AOB和NOB，AOB的数量要多于化.从运行第81d开始，通过对工艺运行条件的调 控，反应器逐渐向短程硝化转化，在第81145d之 间，反应器的亚硝化率有较大提高，基本维持在 95 % ;从第146d开始直到试验结束时，反应器的运 行效果良好，其氨氮负荷高达2 5kg/ m3d，氨氮去 除率为95 %以上，亚硝化率也高达99 %.因此，在持 续180d的运行中，AU SB反应器实现了稳定的亚硝 化功能，其运行结果如图1所示.在反应器的运行过 程中，分4次取得颗粒污泥样品、B、C、D从表 21 2 21 11 1 2 21NOB的,而且,AOB较明显地生长在颗粒表层， NOB则生长在表层的下层，颗粒的中心部分则未发 现有微生物，可以推测此处应为接种的厌氧颗粒污 泥的残余，即死亡的厌氧细菌.氨氮转化为硝酸盐的生物硝化过程是由AOB 和NOB共同完成的,AOB和NOB均是强烈好氧的 自养型细菌，但AOB的氧化对象是原水中的氨氮， 而NOB的氧化对象则是AOB的产物亚硝酸盐11 . 在颗粒污泥外侧的主体水流中，含有较高的溶解11 2 21 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing Tlouse. All rights reseive止http:/www. tn ki.n et图1好氧上流式污泥床(AUSB)反应器的运行结果Fig. 1 Performance of aerated upflow sludge bed reactor常生长表2 4次取样时反应器的运行状况Table 2 Operational status of AUSB reactor at different sampling points取样时间氨氮负荷 氨氮去除率 亚硝化率溶解氧B25C503- 1/ d / kg* (m d)%-+0 67880/ %-0-3550/ mg L1数量很应器的A和氨氮，为AOB的生长提供了良好条件，所以AOB倾向于生长在颗粒的表层;NOB虽然也需要较高浓度的溶解氧，但它同时还需要NO2-,因此，NOB通A除率的是，反后厂了 30续受到显下降AOB 探针:NSO190 ROXNOB 探针:N IT3 FITC图2 AOB与NOB菌群荧光原位杂交结果Fig. 2 Results of FISH wit h AOB and NOB probe颗粒污泥功能的变化与其中微生物种群的变 化是相应的利用F ISH技术可以直观地观察到AOB和NOB在不同运行阶段的空间分布情况，这是好 利用荧光实时定量PCR分别测定了 4个颗粒 样品中AOB与真细菌总16S rDNA的拷贝数， 结果如表3所示.氧硝化颗粒污泥中AOB和NOB等不同类型的微生物通常认为，一般的细菌中平均含有rDNA的拷贝数是基本固定的，约为23 12 ，因此可以计算 在不同运行条件进行下优化调整的结果.出2 3颗粒污泥中AOB的定量化研究24个样品中.AOB在真细菌总量中所占的比例分别2C 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing Tlouse. All rights reseivcd. http:ki:net表表3颗粒污泥中AOB与真细菌的16S rD NA基因拷贝数Table 316S rDNA copies of AOB and Eubactcria in different samples48 X22 X69A51011074 X11X7“8B41091026 X47 XC21081109D1112 36 X10914 86 X1091样品名AOB 总 16S rDNA拷贝/ copies mL-1真细菌总16S rDNA 拷贝/ copies mL，1为 0145 %、5120 %、15137 %、48155 %，如图 3 所示.由此可以看出，随着反应器的运行，AOB的含量逐 渐增加.在接种污泥中，几乎检测不到AOB的存在； 而在样品B,即当反应器运行25d，进水氨氮负荷为 014kg/ ( m3d)，此时，接种的絮状的硝化污泥中的 AOB已经开始在颗粒污泥表面生长,污泥中AOB 含量约为5120 % ;随着反应器的继续运行，其氨氮 负荷以及氨氮去除率均逐渐升高，到第50d，反应器的氨氮负荷达到110kg/ ( m3d)时，污泥中AOB占 真细菌总量的比例已经提高到15137 %，说明此时AOB在污泥中已有大量生长;当反应器运行至第120d时，进水氨氮负荷提咼到212kg/ ( m3 d)，氨氮 去除率已经在较长时间内一直稳定在90 %以上，此 时,AOB含量已经达到48155 %，几乎占真细菌总量 的一半，此时的AOB已经明显成为真细菌中的优势 菌群.这也从另一个角度证实，此时的反应器已经成 功实现了亚硝化功能，反应器中的颗粒污泥也已成 功地从接种的厌氧颗粒污泥培养转变成了好氧亚硝 化颗粒污泥.10080604020-1氨氧化细菌其它真细菌ABC样品0图3 颗粒污泥中氨氧化细菌与真细菌含量变化Fig. 3 Abundance of AOB in 4 granule samples3结论(1)在小试AU SB反应器中，成功培养获得了好氧亚硝化颗粒污泥，在氨氮负荷为212 kg/ ( m3 d)下，氨氮去除率可达90 %以上,亚硝化率可达95 %以上；A(2)利用F ISH技术对4个取自不同运行工况明,AOB主要生长分布在表层,NOB则多分布在表层之下;在反应器的亚硝化率维持在90 %以上并持 续运行较长时间后，颗粒污泥中主要生长分布着AOB，而NOB很少见；I】任(3)利用R TQ2PCR对4个颗粒污泥样品中】AOB占真细菌总量的比例的研究表明，接种的厌氧2 污泥中，基本检测不到AOB ;随着氨氮负荷的逐渐增加，AOB的含量也逐渐提高，当运行至120d ,氨氮负荷为212 kg/ ( m3d)时，AOB在真细菌总 量中的 含量已经达到48155 %.入参考文献郑平，徐向阳，胡宝兰 新型生物脱氮理论与技术M .北 京：科学出版社，2004. 115189 .Uwcharacteriso ASitticsf BprocesstreatingwastewaterhhydrolyzedproteinsJ .Water Sci.Technol. , 1994 , 30 :55Fang H P , Chui H K , Li Y Y ,et al. 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