色氨酸的发酵代谢控制

L-色氨酸的发酵代谢控制09 生工（2 ）班 20090806249 肖军摘要：色氨酸化学名称为a 氨基一p-吲哚丙酸，有L和D型同分异构体，此外还有 消旋体DL-色氨酸。L-色氨酸是人和动物的必需氨基酸，参与机体蛋白质合成和代谢网络调 节，广泛存在于自然界。D-色氨酸则主要存在于微生物和绿色植物中，动物体内含量较少。 色氨酸在人体内几乎不发生作用，也无毒性。L-色氨酸是继蛋氨酸、赖氨酸之后的第三代饲 料添加剂，其使用效果是赖氨酸的34倍，具有十分广泛的应用前景，近年来在医药、化 妆、食品、保健品等行业也得到广泛的应用。本文综述了利用微生物生产L-色氨酸的各种 方法和L-色氨酸的生物合成途径及其代谢调控机制，并介绍了利用重组DNA技术选育L- 色氨酸高产菌的研究现状。关键字：色氨酸；发酵；代谢控制；生物合成；育种目前年产量超过万吨的氨基酸还只有谷氨酸、赖氨酸和采用合成法的DL -甲硫氨酸，不 言而喻，色氨酸又是一个很有吸引力的工业化商品。发展色氨酸的关键在于提高产率、降低 成本。色氨酸是必需氨基酸。它与赖氨酸同是生物体内不足的氨基酸，在营养上是十分重要 的。色氨酸在饲料中良好的添加效果已引起了人们极大的重视，饲养试验表明在玉米粉中添 加0.4%赖氨酸，可使蛋白质增重效率（PER）由0.85提高到1.08,而再添加0.07%色氨酸 后，PER可进一步提高到2.55。也就是说比单独使用赖氨酸时要高一倍以上。1. 色氨酸的生产方法色氨酸的生产最早主要依靠化学合成法和蛋质水解法，但是随着对微生物法生产色氨酸 研究的不断深入，这种方法已经走向实用并且处于主导地位。微生物法大体上可以分为直接 发酵法、微生物转化法和酶法。近年来还出现了将直接发酵法与化学合成法相结合、直接发 酵法与转化法相结合生产色氨酸的研究。另外，重组DNA技术在微生物育种和酶工业上的应 用极大地推动了直接发酵法和酶法生产色氨酸的工业化进程。1.1微生物转化法亦称前体发酵法。这种方法使用葡萄糖作为碳源同时添加合成色氨酸所需的前体物如邻 氨基苯甲酸、吲哚等，利用微生物的色氨酸合成酶系来合成色氨酸。这种方法同直接发酵法 一样，需要解除生物合成途径中大部分酶所受到的反馈调节，以使色氨酸能够高浓度蓄积。 另外，所添加的前体物大都是抑制微生物生长的，因此添加量不可过高，一般采取分批少量 添加的方法。同时可以筛选前体物的添加量。例如采用枯草杆菌的抗菌的5-FT抗性突变株 SD-9在15L含6%葡萄糖的培养基中培养，在培养过程中每次添加少量6%的邻氨基苯甲酸溶 液共2L,经120h后可生产色氨酸9.6g/L。微生物转化法的不足在于当转化液中前体物浓度 较高时，转化率有所下降。另外，前体物的价格比较昂贵，不利于降低成本。1.2酶法酶法是利用微生物中色氨酸生物合成酶系的催化功能生产色氨酸。这些酶包括色氨酸 酶、色氨酸合成酶、丝氨酸消旋酶等。根据提供这些酶的微生物种类数，可以分为双酶菌法 和单酶菌法两种类型。该法既可以直接加入细胞壁溶解酶使细胞破壁后再使用，也可以将所 需的酶固定化后再使用，一般由酶源菌体的培养、菌体的分离洗涤、固定化和反应几个阶段 组成。例如利用大肠杆菌的色氨酸合成酶和恶臭假单抱菌的丝氨酸消旋酶，以吲哚和DL-丝 氨酸为底物，在200L反应罐中反应24h，色氨酸产量可达到28.5g/l。利用黄杆菌/AF3912 的酶系，以DL-5-吲哚甲基乙丙酰脲为底物，同时在反应液中加入适量的苯肼或野芝麻花碱 以抑制色氨酸氧化酶的活性而阻止色氨酸的降解，L-色氨酸的产量可达8.8g/l。酶法能够 利用化工合成的前体物为原料，既充分发挥了有机合成技术的优势，又具有产物浓度高、收 率高、纯度高、副产物少、精制操作容易的优点，是一种成本较低的生产色氨酸的工业化生 产方法。1.3直接发酵法该法是以葡萄糖、甘蔗糖蜜等廉价原料为碳源，利用优良的色氨酸生产菌种来生产色氨 酸。对这种方法的研究进行的比较早，但在相当长的一段时间内达不到工业化生产的要求。 主要原因是从葡萄糖到色氨酸的生物合成途径比较漫长，其代谢流也比较弱，而且色氨酸的 合成需要多种前体物(如PRPP等)，若想进一步提高色氨酸的积累量就必需设法增强合成这 些前体物的代谢流。另一方面，色氨酸生物合成途径中的调控机制比较复杂，除了反馈调节 这一粗调系统之外，还存在着细系统弱化子系统。随着重组DNA技术在微生物育种中的应用，为优良的色氨酸生产菌株的筛选和产酸水平的提高提供了可靠的技术保障，使微生 物直接发酵法生产色氨酸成为一种廉价的工业化生产方法。例如从大肠杆菌EMS4-C25中分 离得到抗反馈调节的色氨酸操纵子，并将其克隆到质粒PUC19和pHSG576中分别得到重组 质粒pTC701和pTC576。将pTC576转化到大肠杆菌中，该菌经过17h的分批发酵积累色氨 酸16g/l。Ikeda等将带有DAHP合成酶(DS)和色氨酸合成酶(TS)的质粒引入产色氨酸的 谷氨酸棒杆菌KY10-894中，使色氨酸的产量提高了 54%，达到了 66g/l。1.4其他生产方法的研究这些方法主要是将上述几种方法有机地结合起来进行色氨酸的生产。主要有直接发酵法 与化学合成法、酶法相结合，其特点是利用发酵法廉价提供一种前体物，再结合其它方法的 优势进行生产。例如，利用黄色短杆菌P390直接发酵积累L-谷氨酸-y-半醛(GSA )达 13.2g/l,然后将发酵液适当稀释后加入含苯肼的lmol/l H2S04 ,中加热回流1h之后，48% 的GSA可转化为L-色氨酸。利用落叶松蕈AHU9382以5%葡萄糖为碳源发酵3d可积累丙酮酸 2226.5g/l，然后加入吲哚、氯化铵和具有高色氨酸酶活性的产气肠杆菌培养12h之后可积累L-色氨酸15g/l.2. 色氮酸生物合成的调节机制色氨酸和苯丙氨酸、酪氨酸同属芳香族氨基酸，苯丙氨酸和酪氨酸协同抑制芳香族氨基 酸生物合成第一步3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖-7磷酸（DAHP）合成酶的活力，色氨酸能增强 这种抑制作用，三种氨基酸共同存在时，最大抑制作用约99%。此外色氨酸还反馈抑制和反 馈阻遏邻氨基苯甲酸合成酶的活力，苯丙氨酸或酪氨酸部份地抑制在苯丙氨酸和酪氨酸生 物合成途径分枝点上起催化反应的分支酸变位酶。3. 选育色氮酸生产菌的方法3.1切断支路代谢选育和应用营养缺陷型突变株，切断苯丙氨酸和酪氨酸分支途径是积累色氨酸的有效 措施。色氨酸产生菌二般采用筛选苯丙氨酸和酪氨酸双重营养缺陷型菌株。3.2解除反馈调节选育抗类似物突变株，代谢调节被遗传性地解除，不受培养基成份的影响，生产稳定。 这是色氨酸育种的重要手段，特另是利用营养缺陷型兼具类似物抗性的突变株。色氨酸类似物有5-甲基色氨酸，色氨酸氧肪酸盐，6-氟色氨酸，4-甲基色氨酸等。苯丙 氨酿类似物有对-氟苯丙氨酸，对-氨基苯丙氨酸等。酪氨酸类似物有酪氨酸氧肪酸盐，3- 氨基酪氨酸等。这些类似物主要是起假反馈抑制荆的作用，从而可选得抗反馈抑制的突变 株。3.3增加前体物的生物合成色氨酸产生突变株L-色氨酸产量增加，是与色氨酸特定通路内邻氨基苯甲酸合成酶反 馈抑制敏感性的减少相一致。所以色氨酸形成的限速步骤在反馈抑制还存在时，似乎就取决 于邻氨基苯甲酸合成酶的反应，因此色氨酸产量的提高，可采用的方法是增加前体物分支 （酸邻氨基苯甲酸合成酶底物）的水平。例如磺胺与从分支酸合成的对氨基苯甲酸竞争性地 抑制二氢蝶酸合成酶，然而它们抑制叶酸的生物合成。从这些磺胺抗性突变株中，它们增加 了分支酸水平，从而提高了突变株色氨酸的产率。4. 色氨酸产生菌育种范例在实际色氨酸产生菌的选育工作中，根据色氨酸生物合成调节机制，采用筛选营养缺 陷型和对代谢产物类似物拮抗的综合办祛，经过多次诱变逐步挑选获得色氨酸高产菌株。例 如谷氨酸捧伏杆菌的苯丙氨酸和酪氨酸双重缺陷型的Ky9456菌株只能产痕量色氨酸。通过 多次诱变处理，逐步获得对5-甲基色氨酸、色氨酸氧厉酸盐、6-氟色氨酸和4-甲基色氨酸 具有抗性的一株变异株4MT-11可产色氨酸4.9克/升。此变异株生产色氨酸受苯丙氨酸和酪 氨酸的抑制。将此变异株进一步诱变，获得对苯丙氨酸和酪氨酸结构类似物，如对-氟苯丙 氨酸、对-氨基苯丙氨酸、酪氨酸氧厉酸盐和苯丙氨酸氧肪酸盐有抗性的变异株 其中有一 株变异株PX-115-97,在10% （以葡萄糖计）甘蔗糖蜜的培养基中可产12克/升色氨酸。另有报导用基本上相同的方法，筛选获得一株谷氨酸棒伏杆菌芭氨酸产生菌 Trp-10（苯丙氨酸和酪氨酸缺陷型、对一氨基苯丙氨酸抗性、对一氟苯丙氨酸抗性、酪氨酸 氧肪酸盐抗性、噬嗯基苯丙氨酸氧肪酸抗性）以葡萄糖为碳源，色氨酸最高生成量为16.8 克/升。还有人利用黄色短杆菌N0.2247（野生型）为出发株，诱变成菌株N0.239酪氨酸和蛋氨 酸缺陷型、对一氟苯丙氨酸抗性）再从菌株NO.239诱变获得菌株N0.187（5-氟色氨酸抗性）， 产色氨酸为&0克/升。从菌株N0.187诱变获得菌株A-100。（氮丝氨酸抗性），产色氨酸为 10.3克/升，又从菌株A-100诱变获得菌株S-225（磺胺抗性），产色氨酸为19克/升。5展望随着科学技术的不断进步，人们对色氨酸用途的认识必将越来越深入，其应用领域也必 将越来越广阔。以医学为例，在控制采食量、增强免疫力、人体代谢网络等方面所进行的研 究必将进一步揭示色氨酸在体内的其它功能，进而增加其医学用途。另一方面随着基因工程 技术、定向进化技术、代谢工程技术及基因组学、代谢组学等微生物育种方法的发展和应用， 将加速研究了解色氨酸的生物合成途径及代谢调节机制，进一步开展构建高产L-色氨酸生 产菌种的研究，提高微生物直接发酵水平，降低其生产成本。相信在不久的将来，世界色氨 酸工业将会有长足的发展，L-色氨酸的市场前景令人乐观。参考文献：石四游食品与发酵工业，NO.3,53（1985）2 张炳荣.氨基酸工业大全.北京：中国轻工业出版社19913 张克旭氨基酸发酵工艺学北京：中国轻工业出版社19924 张克旭陈宁代谢控制发酵北京：中国轻工业出版社19985 朱玉贤李毅现代分子生物学北京：高等教育出版社19976 李剑欣，张绪梅，徐琪寿.色氨酸的生理生化及其应用J.氨基酸和牛物资源，200527（3）： 5862.宋文霞，王瑞明.L广色氨酸的研究J农业品加工，2005，34（3）： 18. 21.8 王建华药用氨基酸J国外药学，1982, 3（3）： 37-40.9 张素珍.产L色氨酸菌株的诱变选育J.微生物学报，1984, 24（3）： 235242.10 刘晓婷，黄耀辉.黄色短杆菌L色氨酸产生菌的选育J.工业微生物，1989, 19（6）： 6-11.