微生物发酵与发酵工程.ppt

. 微生物发酵与发酵工程 一、 微生物发酵 二、发酵工程概述 三、应用举例 丙酮丁醇发酵 一、 微生物发酵 发酵 (fermentation) 没有空气的生活（ life without air） - 巴斯 德 细胞在厌氧条件下代谢营养物获得能量的生 化反应 微生物生长并进行生物转化的过程 发酵的目的 获得生物量 获得目的产物 发酵的基本流程 保藏菌种 斜面（试管、茄子瓶） 摇瓶（ 12级） 种子发酵（ 1级或多级） 主发酵 后处理 无菌操作 接种间 辐射灭菌 化学灭菌 空气过滤 发酵罐 高压蒸汽灭菌 通气系统 过滤灭菌 TC 发酵温度 t hr 连续灭菌 间歇灭菌 发酵过程的 噬菌体 问题 现象 ：发酵不正常，产量、糖耗、 pH、粘 度、泡沫等 镜检 ：溶菌现象 防治 ： 定期检查 设备、管道管件、过滤器等 环境 药物 ：鳌合剂、抗生素 菌株 ：抗性菌株、菌株轮换 发酵过程的主要控制参数 温度 pH 营养 溶氧 通气量 搅拌速度 压力 发酵类型 I: 产物是初级能量代谢的结果，一般是糖的直接氧化产 物。 A P or A B C P 例：乙醇发酵、乳酸发酵 II: 产物通过能量代谢的间接途径得到。 A B C D E P 例：柠檬酸发酵、氨基酸发酵 III:产物不是初级代谢形成的，与微生物细胞的物质代谢 无关。 例：抗生素发酵 发酵方式 批式 (batch)发酵 补料流加 (fed batch)发酵 连续 (continous)发酵 批式发酵的产物形成 生长结合型 (growth associated)：产物形成与生长的限制 因子相同 非生长结合型 (growth unassociated) ： 产物形成速度取决于微生物浓度 产物形成速度由与比生长速度无关的其它因素决定，不能用动力学方程 描述，但可对具体的发酵过程简化一些条件后建立数学方程 产乳酸发酵： 发酵的后处理 后处理在发酵工业中的地位： 普通发酵产品，后处理成本 60% 基因工程发酵产品，后处理成本 80% 后处理的一般流程： 发酵液 分离细胞 浓缩 粗分离 精分离 制成品 后处理工艺的设计原则： 产品的性质 产品的要求 经济 环保 稳定 细胞的分离与破碎 细胞的分离 过滤（压滤、抽滤、膜分离） 沉降（重力、离心） 絮凝 细胞的破碎 物理（超声、机械） 化学 生物 膜分离 微滤（ 0.1 - 10 ） 超滤（ MW1000 - 100000） 固态发酵 固态发酵 ：微生物在没有或很少游离水的 潮湿固体培养基上生长与代谢的过程 特点 ：投资少、能耗低、原料廉价 传热传质差、效率低 应用 ：生物农药、饲料、粗酶、食品等 发酵条件的优化 确定优化目标 T S P + B + s 产率 : P ( g/L ) 转化率 : P/(S s ) ( %, g/g ) 生产强度 : P/T ( g/L.h ) 其他 确定影响因素 种子：种龄、接种量 培养基：组分、 pH、灭菌条件 环境：温度、 pH、通气、搅拌、压力、设备 二、发酵工程概述 （一）发酵工程技术发展及其意义 发酵？ 生理学角度： 微生物的无氧呼吸和有氧呼吸 以外的一种生物氧化作用 有机化合物既是 电子（或氢）供体又是电子（或氢）受体。 工业生产角度： 利微生物的机能进行物料加 工以获得工业产品生产或为社会服务（环境 保护）的过程，又称微生物工程。 发酵工程的历史过程 发酵现象 酿造食品工业 非食品工业 青霉 素 抗菌素发酵工业 氨基酸 ,核酸发酵（代谢 控制发酵） 基因工程菌 动物细胞大规模培 养 植物细胞大规模培养 藻类细胞大规模培 养 转基因动物 发酵工业的第一个转折点： 非食品工业 发酵工业的第二个转折点：青霉素 抗菌 素发酵工业 发酵工业的第三个转折点：切断支路代谢 转折点 :酶的活力调控 ,酶的合成调控 (反馈控 制和反馈阻遏 ),解除菌体自身的反馈调节 , 特殊调节控制的利用突变株的应用 ,前体、 终产物、副产物等 发酵工业的 近代转折点 ：基因、动物、海 洋 发酵现象的早期认识 1680年制成显微镜 微生物的存在 1857年巴斯德证明了酒精是由活的酵母发酵 引起的 1897年 毕希纳 发现磨碎的酵母仍使糖发酵形 成酒精 酶 发酵工程的早期阶段 人们的对发酵技术的认识起始于 19世纪末， 主要来自于 厌氧发酵， 如利用酵母菌、乳酸 菌生产酒精、乳酸和各种发酵食品。 20世纪初期， 1916年英国采用梭状芽孢 杆菌生产丙酮丁醇，德国采用亚硫酸盐法生 产甘油（第一次世界大战） 由食品工业 向非食品工业发展 好氧发酵技术： 速酿法从乙醇生产醋酸， 通气法大量繁殖酵母，用米曲霉的麸曲代 替麦芽糖作糖化剂生产酒靖，用微小毛霉 生产干酪。 1933年等人发明了 摇瓶培养法 代替了 传统的静置培养法。生长均匀，增殖时间 短。 发酵工程的重大转折 点 二十世纪四十年代初，第二次世界大战爆发， 青霉素的发现，迅速形成工业大规摸生产。 1928年由 Fleming发现青霉素 1941年美国和英国合作对青霉素进行生产研究 表面培养： 1升扁瓶或锥形瓶，内装 200mL麦 麸培养基 40u/ml 1943年沉浸培养： 5m3 200u/ml 当今： 100m3200m 3 5 -7万 u/ml 链霉素、金霉素、新霉索、红霉素 主要的技术进展： 通气搅拌解决了液体深层培养时的供氧问题。 抗杂菌污染的纯种培养技术：无菌空气、培养 基 灭菌、无污染接种、大型发酵罐的密封与抗污染 设计制造。 意义： 抗生素工业的发展 建立了一套完整的好氧发酵技术，大型搅拌发酵 罐培养方法 推动了整个发酵工业的深入发展 为现代发酵工程奠定了基础 学科发展与属性 微生物利用工业的迅速发展 产生了 生化工程学科 发酵工程的三大学科基础 微生物学、 生物化学及生化工程 现代生物技术 分子生物学 与发酵工程 20世纪 50年代： 氨基酸发酵工业 谷氨酸、赖氨酸 核酸发酵工业 肌苷酸、乌苷酸 微生物变异株通过代谢调节 代谢控制发酵技术 切断支路代谢转折点 : 酶的活力调控 , 酶的合 成调控 (反馈控制和反馈阻遏 ) 解除菌体自身的 反馈调节 ,特殊调节控制的利用 ,突变株的应用 ,前体、 终产物、副产物等 20世纪 70年代 细胞融合技术、基因操作技术等生物技术发展， 打破了生物种间障碍，能 定向地制造出新的有用的微 生物 ： 增加微生物体内控制代谢产物产量的 基因拷贝数 ，可 以大幅度地提高目标产物的产量 将动、植物或某些微生物特有产物的 控制基因 植入细 胞中，快速经济地大量生产这些产物 将具有不同性能的多种 质粒 植入，使新菌株在清除污 染或以非粮食物质为原料进行发酵生产或环境保护 人类基因组测序完成的后向 功能基因组 学 转变 功能基因及其表达产物的 获得。 细胞大规模培养的优化技术对当前生物技术 产业以及今后的潜在发展具有重要影响。 发 酵 工 程 利用微生物进行产品生产 效益与意义 抗生素、生物制药、氨基酸、核苷酸、 有机酸、饲料添加剂、微生态制剂、 生物农药、生物肥料等 医药、轻工、食品、农业、环保等行业 基因工程药物、疫苗及抗体产品 化学工程 生物化工 生物加工行业 传统生物技术 现代生物技术 基因工程菌发酵 （二）发酵过程生产方式 发酵生产的基本类型 固体发酵 液体发酵 基本操作模式 沙土或冷冻保贮菌株 斜面菌种培养 菌体或孢子悬浮液制备 种子扩大培养 发酵 发酵液处理 提取与精制 制剂制 造 成品检验与包装出厂 固体发酵 将发酵原料及菌体吸附在疏松的固体支持物 （载体）上，通过微生物代谢活动，使发酵原料转 化为发酵产品 浅层发酵、转桶发酵和厚层通气发酵 优点： 设备简单、方法简便、能耗低、原料粗放、 不易污染、产物回收耗溶剂少，所生废水少。 缺点： 占地面积大、劳动强度大、传质传热困难、 产率和收率低、副产物多、培养过程质量控制难、 不适合一些复杂调控操作发酵 液体发酵生产 发酵原料制成液体培养基， 表面发酵和深层发酵 深层发酵： 菌体或菌丝体均匀分散在液体培养基 中，通气或不通气 优点： 占地面积少，生产规模大； 发酵速度快，生产效率高； 生产机械化，易于自动化控制，劳动生产率高； 发酵设备紧凑，传热传质良好，生产便于管理； 副产物少，有利于产品提取，产品质量高 类型 ：分批发酵，补料分批发酵，连续发酵 分批发酵 一次性投入有限数量营养物，灭菌后接 种入所要培养的微生物，然后控制适宜的发 酵罐条件（温度、通气、搅拌速度、 pH等） 非恒态培养 ，营养成分不断减 少，微生物相应生长，产物不断形成 补料分批发酵 分批发酵中间歇地或连续地补加含有限制性营养 物的培养基，到某一定时间产物才从罐内放出 。 优点： 通过调节在发酵罐中的营养物浓度，可避免代谢调 节中的抑制、阻遏或毒性对生长的抑制； 可避免一次投料过多，造成细胞大量生长，溶解不 足，通气搅拌无法适应； 营养缺陷型菌的营养物量的控制，高效率积累产物； 挥发性物质的低浓度控制； 半连续（代放）发酵 在补料分批发酵基础上以一定的间隔时间从发酵 罐中多次放出一定体积的发酵液，直到发酵终结才全 部放出发酵液。 优点： 具有补料分批发酵的优点； 控制比生长速率使菌体代谢酶体系处于最优； 提高发酵罐的生产能力（发酵指数）； 适合于菌体生长较快的半关联生长的次级代谢产物； 适用于多罐发酵车间的代放安排集中分离提取。 连续培养 以一定速度向发酵罐内连续供给新鲜培养基的同时， 将含有微生物和产场的培养液以相同速度从发酵罐内 放出，发酵罐内液量维持恒定。 经过一定时问培养后，培养物就近似于恒定状态 的生长和代谢，这时所有物质（营养物、产物、微生 物细胞等）的浓度、环境的物理状态（如 pH、 DO） 以及比生长速率等始终维持不变，即稳定状态。 特点： 恒定的 生理状态（比生长速率恒定），有利于 微生 物生理特性和遗传特性的研究 -动力学和最适 培养条件的研究； 基质在发酵罐中停留时间短，原材料转化率低， 只能适用在生长快的微生物菌体； 在长时间培养过程中菌种易变异，有可能产生适 应特殊环境的 负变异 菌株，而且易于染菌。 发酵过程的重要环节 菌种来源： 生产菌的筛选、单菌和混合菌、 筛选方案的设计、含微生物材料的选择与预 处理、分离培养基、菌种的平板培养（不同 温度和时间）、菌落的选择。 菌种选育： 自然选育、诱变选育、杂交杂育、 原生质体融合、基因工程改造、 DNA突变技 术。 培养基成分及来源： 碳源、氮源、无机盐及 微量元素、前体促进剂和抑制剂；斜面、摇 瓶、种子、发酵 纯种发酵与无菌技术： 培养基灭菌、无菌 空气、密闭设备与罐压、无污染接种 种子扩大培养： 一级或多级种子制备、种 子质量控制 发酵工艺控制： 温度、通气量、搅拌、消 泡沫、 pH、 DO、培养基配比、菌丝形态、 放罐时间、接种量、其他各种操作 发酵罐与计算机控制： 通气、搅拌、密闭、 各种高级控制 辅助设备 公用系统： 空压房、冷冻设备、锅炉房、 水系统、污水处理、发电厂 原材料仓库与配料间： 后提取车间与成品仓库： 菌种保存与种子制备实验室： 中间分析实验室： 发酵车间设计 工艺流程： 菌种、种子培养、发酵、控制条 件（温度、时间、）、技术水平 设备平衡： 生产能力、经济指标、技术指标、 设备平衡计算 车间设计： 平面与立面布置、管路设针 厂区设计： 风向、绿化、人流与物流、生 活区与工厂区 人员岗位与运行管理设计： 基建及施工设计： （三）发酵工程研究的主要现状和问题 提高产品的市场竞争能力，降低成本，提高 产品质量 ： 控制不同的操作条件时，有完全不 同的产量和质量结果 优化 从小罐放大到生产罐，有很大差异， 可能要失败 放大 菌种选育 基因工程菌的构建 忽视了生物反应器中 工程问题 所必 须加以考虑的工艺变化和过程优化。 采用人工经验为主的静态操作 背景 过程优化 发酵过程计算机控制 传感器： DO、 pH、 排气成份分析系统 计算机控制系统： 单片智能 、 工控机 、 pLC 、 DCS 执行器件： 杯式补料系统 参数自动控制回路 温度 自动控制；通气流量自动控制；罐压自动控制 pH调节（手控或自控）； DO与转速、通气流量程序 串级调节 背景 发酵工程控制 “ 内部控制 ” ： 如何改变细胞的遗传组成 和 “ 发酵工程控制 ” 细胞的代谢生理特性 “ 外部控制 ” ： 物理和化学环境条件控制 外部控制是基于内部控制调节，但是在研究和过渡的方法上 又是不同的。 生化工程所面临的任务 就是在 已 提供高产菌株 的基础上，如何把这些高 产菌种在培养过程中进一步考察它的 生理生化特性 ，稳定 或改进微生物反应工艺过程，这里不仅要求对生物物性的 动态有详尽的了解，对生化反应做定量的和动力学方面的 考察，还需具有 工程学的技巧 ，才能充分发掘和利用生物 体系的潜力。 另一方面，计算机技术的高度发展也在客 观上为分析和优化控制这种复杂的发酵过 程提供基础，因此，借助于 计算机系统 对 发酵过程进行数据处理，分析和控制就愈 来愈成为人们的迫切要求 。 生理生化特性 微生物生长和反应过程研究 微生物的生长反应特性是发酵过程优化的最重要的出发点。 基质进入细胞、胞内反应、代谢产物的胞内外分泌等全过 程进行分析 胞内反应中分解代谢、合成代谢和大分子物质合成之间的 物质和能量的关系 发酵过程的化学计量学和热力学研究 经过 1000多步胞内反应才能转化为代谢产 物和细胞成分，一般把细胞看作一个开放的 黑箱系统 化学计量学 主要研究有关发酵过程中反应 组分组成变化的规律，把生物反应器中微生 物细胞活动用化学元素的平衡式来表示 热力学 研究只强调系统的起始态和终止态， 给出反应可能进行到的最大程度。在发酵 工程中常以得率系数概念 Yi/j对各种基质形 成菌体或产物的潜力进行评价 微生物反应动力学与生物反应工程 微生物反应动力学是发酵过程优化研究的核心内容， 主要研究生物反应的速率及其影响因素 通过基质消耗、细胞生长和产物形成的数学描述，反 映微生物系统的状态特征 提出了许多数学模型：经验模型、机理模型；统 计模型和非统计模型；结构模型和非结构模型 实际发酵过程是在生物反应器中进行，这就是 宏观动力学研究，逐渐发展成生物反应工程 数学模型 静态和动态优化 系统识别 自适应控制 专家系统 、 模糊控制 、 神经元网络 各种混沌现象的研究 实际工厂生产 效果不明显 背景 现代控制理论的应用 数学模型 静态和动态优化 系统识别 自适应控制 专家系统 、 模糊控制 、 神经元网络 各种混沌现象的研究 实际工厂生产 效果不明显 过程放大 因次分析法 经验法则法 数学模拟法 时间常数法 几何相似 流体运动学相似 流体动力学相似 同时满足这些相似条件是不可能的 当在小试研究时某一个对生产产生影响的重 要因素设有被观察到，而这个因素恰恰在放大时 成为关键因子时，就会造成整个发酵过程的失败。 背景 微生物学 生物化学 分子生物学 发酵工艺学 化学工程 现代控制理论 各种工程开发 参数检测 (自动或手工检测 ) 综合性研究： 定性和定量的措述 工业生产 生化工程传感器与计算机数据处理作为一个独立的 技术领域被人们重视 在线计算机 多学科发展与综合 仍旧局限于寻求培养基配方和最佳的温度 、 pH、 DO等 缺乏微观的实时的代谢调控 代谢调控研究 代谢工程研究 发酵过程酶学 研究的困难 过程数据采集 和处理的困难 发酵工艺优化研究 的基本思路 发酵罐 测量参数及其变化的意义缺乏理解 最佳工艺控制点为依据的静态操作 方法 ， 只是化学工程宏观动力学概 念在发酵工程上的简单延伸 ， 缺乏以细胞代谢流分析与控制为核 心的研究内容 背景和原理 发酵过程优化与放大仍是 一个令人困惑的问题 ？ 对于活体细胞调控来说，采用传统的 生物学方法或化学工程的 调控 方法，存在 很大的问题，国内外都没有很好解决 。 背景 三、发酵举例 制造微生物生物量 PHB发酵 黄原胶发酵 二元酸发酵 丙酮酸发酵 乙醇发酵 Vc发酵 制造微生物生物量 单细胞蛋白 假丝酵母 (Candida sp.)等 面包酵母 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 微生物肥料 根瘤菌 (Rizobium sp.) 微生物农药 苏云金杆菌 (Bacillus thuringiensis) 三次采油 解烃棒杆菌 (C.hydrocarboclastus) 等 环境治理 芽孢杆菌 (Bacillus sp.)等 卡介苗 无毒结核分枝菌 (Mycobacterium tuberculosis) PHB发酵 (glycolysis) Glucose pyruvate acetyl-CoA TCA 3-ketothiolase acetate acetoacetyl-CoA reductase R-(-)-3-hydroxybutyryl-CoA PHA synthesis 氮源限制 PHB 黄原胶发酵 野油菜黄单胞菌（ Xanthomonas campestris）产 生的胞外多糖，发酵液粘度可达 7000cp 非牛顿型发酵 二元酸发酵 CH3(CH2)nCH3 -oxidation CH3(CH2)nCOOH CH3(CH2)n-2COOH -oxidation HOOC(CH2)nCOOH 水 、 油 、 气 、 固多相反应 -氧化与 -氧化 丙酮酸发酵 Glu Lat Pyr EtOH TCA 营养（维生素、氨基酸）限制 溶氧控制 乙醇发酵 产物抑制问题 原料成本问题 Vc二步法发酵 弱氧化醋杆菌 “ 大、小 ” 菌混合 山梨醇 山梨糖 2-酮基 -L-古龙酸 丙酮丁醇发酵 丙酮丁醇是良好的有机溶剂机合成工业的重要原 料。 1861年 巴斯德 发现细菌能产生丁醇。 1866年英 国最早用 丁二烯 作为合成橡胶的原料加速了丙 酮丁醇工业的商品化生产。 1908 1911年汽车工 业需要橡胶，制造人造橡胶的丙酮丁醇需要量大 增。 1914年 Chain Weizmann分离到丙酮丁醇菌， 丙酮丁醇产量提高 4倍，使该行业开始进入 工业发 酵 生产阶段。 1916年在第一次世界大战期间，丙酮用于 制造无烟火药，需量剧增，于是着手研究 发酵法 生产的改进，直到 1930年完成生产 工艺。发酵法生产丙酮丁醇一直是当时的 主要方法。 1960年后，由于以石油为原料的 化学合成 丙酮丁醇更经济，美国和其它一些国家相 继停止了发酵生产。我国现在是两种方法 并用。 一、 丙酮丁醇的生产方法 (一 )合成法 例如，用稀酒精催化制丙酮， 用石油气中的丙烯制成 异丙醇 ，再经 氧化 脱氢 制丙酮；用丙烯与苯制成异丙苯，再 氧化制丙酮及苯酚。丁醇的合成有 乙醛缩 合加氢 、丙烯羧化加氢和乙醇直接合成丁 醇等。（如下式） (二 )发酵法 和酒精发酵 样，以淀粉质、 纸浆废液、糖蜜和野生植物等为原料，利 用丙酮丁醇菌所分泌的 酶 来分解淀粉成糖 类再经过复杂的生物化学变化，生成丙 酮、丁醇和乙醇等产物，同时还产生大量 的 CO2棚 H2等副产品。 二、 淀粉质原料的丙酮丁醇发酵 丙酮丁醇菌在广义上属于 丁酸菌族 。丁酸 菌是嫌气性的，有鞭毛，能运动的杆 菌在产生孢子时成为纺锤状或鼓槌状。 细胞内含有淀粉拉，能被碘液染成深蓝色。 丙酮丁醇菌除具有丁酸菌的通性外，还具 有能发酵产生丙酮、丁醇等中性产品的能 力。 在中性培养基中发酵时，一般丁酸菌和丙 酮菌均能产生 丁酸和醛酸 、当培养基的酸 度增加到一定数值后，一般丁酸菌即停止 发酵，并且菌体的繁殖也停止但是丙醇 丁醇菌则不然，当培养基的 酸度达到最高 点 后，由于有脱羧能力，酸度反而下降， 并且产生中性的产品 -丙酮、丁醇 、乙 醇等 (图 3 1)。 由于丙酮丁醇菌的上述持性，为区别于 般丁酸菌，将能引起丙酮、丁醇发酵的细 菌命名为 丙酮丁醇菌 。几种与丙酮丁醇茵 类似的梭菌简述如表 3 1。 (1)丙酮丁梭菌 ：能发酵玉米、马铃薯等淀粉质原 料和蔗糖等糖质原料而产生溶剂， CO2， H2和少 量有机酸。溶剂的比例为： 6份丁醇 3份丙酮： 1 份乙醇，即 B： A： E 6:3:1，不同的变异株有不 同的比例数。 发酵温度为 35-36 用玉米发酵时玉米浓度为 5 一 8，用马铃薯时，发酵醪中鲜马铃薯量为 20 ，在 48 60 h就可以发酵结束。 二、 淀粉质原料生产丙酮丁醇的流程 三、种母的培养与制备 (一 ) 丙酮丁醇菌的分离与纯化方法 在土壤、细泥、粪便中及新鲜果实、蔬菜的表面 上均有丙酮丁醇菌存在。利用它的孢子的嫌气 性和耐热性，可以采用热淘汰法和单细胞分离 法以获得优良的菌种。 由于丙酮、丁醇发酵时，易受杂菌侵染而导致酸 败所以，丙酮丁醇工厂须经常进行菌种的分离 与纯化工作，以保证正常生产。 所谓 热淘汰法 ，即将含有丙酮丁醇菌的试 样接入 5的玉米醪试管内再放在沸水浴 中 1-1 5min，杀死不耐热的杂菌和热抵抗 力较差的孢子，而保留对热抵抗力较强的 丙酮丁醇菌孢子，然后在爆气状态下培养。 培养液产生大量气体，这时可转接到新鲜 培养基试管内，同法进行热淘汰和嫌气培 养，如此反复多次，即可获得较好的菌株。 欲获得 纯培养 或者需从发酵醪中选取优良 菌株，可用嫌气平板进行单菌落分离。如 用有明胶或碳酸钙的培养基，则可能出现 溶解圈 。然后接入玉米醪中测定气体产生 量和丙酮产量。获得的优良菌种用沙土管 保存。 1 试管菌种的培养 ：选取优良菌种的砂土孢子 1 2g，接入 10 m l 5浓度的玉米醪中，并将此管在 100 C沸水中热处理 1 2 min，急速冷却至 37 然后置于真空干燥器内进行培养 (2666 Pa 以下温度保持在 37 39 )。 2种母瓶培养 ：将一支试管菌种接种到盛有 5浓度的玉米醪液的种母瓶中，在常压下 培养 24h，即可接入第一种母瓶。一船丙酮 丁醇菌孢子萌发时，要求嫌气条件较高， 营养体繁殖时，由于本身产生的 H2和 CO2 已能满足嫌气条件。 3第一种母罐 ：其中盛有 6浓度的玉米 醪接入种母瓶的醪液培养 12一 15h后，即 可按入第二种母罐。 4第二种母罐 ：其中盛有 8浓度的玉米 酵，接入第一种母罐酵液，培养 20 h左右， 然后将总量 l 3一 1 2送入发酵罐。 制备种醪的方法有间歇调制种醪法，半 连续调制种酵法，利用部分发酵醪制种醪 法。 四、发酵 (一 )发酵醪制备 目前国内都以 8玉米粉作 发酵酵。原料经粉碎蒸煮即可。蒸煮发酵 醪时常加入一定量的废醪 (10-25%)，这不 仅增加部分营养，而且降低粘度。蒸煮过 程也是灭菌 过程，因而蒸煮多以高温连续蒸煮为主 (方 法同酒精发酵 )然后 冷却进入发酵罐，制备好的种醪也从种母 罐同时流入发酵罐。 (二 )发酵过程生化变化 发酵过程通常经过 三个阶段，即前发酵期、主发酵期和后发 酵期，整个发酵过程经 40一 72h结束。 1前发酵期 ：主要为 种菌 繁殖期。细胞数 激增，酸度增加，所以又称为增酸期，由 于丙酮丁醇菌细胞活动的结果，也产生少 量的溶剂，主要的发酵产品为 醛酸、丁酸、 氢气、二氧化碳等。 此时 淀粉 的消耗量为 30左右，丙酮丁醇菌和 其它细菌不同，它所需的诱发期很短，很快即 可增殖，通常前发酵期为开始发酵后的 15 18h。 2 主发酵 期：丙酮丁醇菌已能旺盛发挥它的发 酵特性，将前一阶段产生的醋酸、丁酸等变为 丙酮、丁醇 等溶剂的阶段 在此阶段气体发生量达到最高蜂，溶剂生 成很快，酸度下降至原有酸度的 1 2左右， 所以又称 减酸 期，此时期在 18 40 h后。 3 后发酵 期：酸度达最低后，又稍为上升，维 持 定水平至发酵结束，所以又称酸度复升期。 此时所积聚的酸主要为不挥发酸，挥发酸量和溶 剂也稍有增加，但是由于丙酮丁醇菌在此时期开 始自溶，以及部分丙酮丁醇菌产生孢子所以活 动的丙酮丁醇菌逐渐减少，发酵逐渐衰弱以至结 束。此时期在 40一 70 h。 (三 )发酵的方法 有间歇发酵法 (包括一次加料法、分次流加 法 )串联式发酵法相连续发酵法，目前多采 用 串联 法和 连续发酵 法。 (四 )影响发酵的主要因素 1 温度 ：最适发育温度为 36 37 。正 常生长时期最高温度为 40 左右，有试验 表明，当发酵温度增高时溶剂产量降低， 残余糖量增加。 2培养基的 PH值 ：培养基 中性 时，丙酮丁 醇菌具有使淀粉发酵成丁酸、醋酸等的能 力，而使 pH下降，而在 酸性 培养基中具有 将醋酸、丁酸变为丙酮丁醇的能力，丙酮 丁醇菌繁殖的最适 pH值为 5.5 7.0。 3培养基的 氧化还原值 ：丙酮丁醇菌是嫌 气菌。氧对它有毒害作用。嫌气条件不仅 和氧有关，而且更和培养基的氧化还原值 有关。 通常 rH2 7 9能正常发酵，当 rH2向氧化 方面变动为 10 2时则不能进入第二阶段 发酵；当 rH2再大时，菌种不仅不能发育而 且逐渐死亡。 当 PH低于 4或高于 8时，细菌的繁殖完 全停止，不同的生长阶段有所不同， 第一阶段 pH值可以较高，如果开始 pH 过低，丙酮丁醇菌会生长不良，在发 酵第二阶段，最适 PH值下降为 4 3 5 3较适合。 丙酮丁醇菌因为发酵时能产生 氢气、 CO2， 所以，只要开始发酵时能建立嫌气状态， 以后则由于培养基继续为放出的氢和 CO2 所饱和，就能阻止空气中氧气入内，并且 醪液是胶状物，培养基的粘度和固体颗粒 对造成嫌气条件也有帮助。 4醪液与发酵产物浓度 ：丙酮丁醇菌虽然 能产生丙酮丁醇，但如果醪液中丙酮丁醇量 过高 时，对菌本身有 毒害 。所以丙酮丁醇 发酵时所采用的醪液浓度 般为 8一 10 。 在发酵醪内溶剂的最高浓度只能达到 25g/L(2 5 )。其中包括丙酮 0.85丁 醇 1.5，乙醇 0.15。发酵醪中丁醇量如 超过 1 5，对丙酮丁醇菌则有 抑制 作 用因此丙酮丁醇发酵时，醪液的浓度需 要配合菌种能忍耐溶剂的浓度来决定。 其它如发酵时产生的 糠醛 ，原料中的 单 宁 等对发酵都有一定影响。 三、 如何提高溶剂产量 为了增强发酵法的竞争力，提高溶剂产量是 根本任务。 1菌种选育。 由于菌本身受溶剂的影响 很大，特别是丁醇的浓度，在发酵液中一般 达到 1% 时，即为致命的水平 (丙酮的毒性较 低，一般菌能耐 2.9的浓度 )因此，溶剂 产量的高低往往与菌株对 丁醇的耐力 有关。 在丁醇的存在下，采用常规的诱变手段 (如 亚硝基胍 )，可以获得一定量的高产菌株。 现发现耐丁醇的突变株与野生型菌株的细 胞膜 类脂成分 有所不同。 当野生型菌株的生长进入稳定期时，不饱 和脂肪酸的百分率与饱和脂肪酸百分率比 值的增加是一致的，可是耐丁醇菌株，在 同一时期在这 比率上呈现出明显的变化， 即 不饱和脂肪酸 的比例随时间延长而增加。 这表明，通过合成不饱和脂肪酸，耐丁醇 的突变株可建立起一种补偿由丁醇引起 膜 流动效应 的机制，它使得微生物维持在 种等粘度的膜状态。 Westhuizem等人曾报道丙酮丁醇梭菌 (1yt-1）的不产 自溶素 突变株比亲本菌株 (P262)更抗丁醇，说明耐丁醇和自溶素活 力间有一定的相关性对于丙酮丁羧菌的基 因转移系统也做了各种基础研究，尚有很 多难点 未能突破 ，如外源 DNA难于进入丙 酮丁醇菌内，没有合适的用于转导的克隆 载体 等。 2发酵过程中， 加入乙酸和丁酸 的作用。 有一试验表明，在正常的培养基中，于接 种后和培养 24h后加入 2g/L和 5g/L或 2g/L的 乙酸和丁酸，其效果见表 3 2。 从表 3 2中可以看出，接种后加入 2g/L的乙 酸 ，可增加丙酮的形成总溶剂达 23 4， 并使糖的转化率从 32 4提高到 34 1。 加入 2g L丁酸 ，则增加总的溶剂量，糖转 化率达 35 1。同时加入合适浓度的 乙酸 和丁酸 ，总溶剂达到 24.7g L，丁醇与丙酮 的比为 2。 3消除培养液内还原性化合物，如用真空法、通 氯法等消除氢气，有利于提高产量。 4培养液 适当的碳氮比 是获得正常的溶剂产量的 关键，高与低的比例均非适宜。 5消除溶剂对菌的抑制作用，如加蓖麻油活性 炭、多种聚合树脂等的吸附发酵；加入油醇等的 萃取发酵； 不断的移去产生的溶剂 ， 不断的补加 碳源 (见图 3 2)。 7 固定化细胞 的溶剂生产。例如，可以用海 藻酸钙固定菌细胞或孢子以 N2维持嫌气和无菌。 固定的营养细胞如果处于溶剂产生期，在整个延 续期间，溶剂会连续产生。 固定化孢子可以避免细胞代谢活动的干扰。在 胶体内的活性细胞充分生长后，能够恢复高生产 能力，结果表明连续生产完全可能。固定化细胞 的 丁醇产率 比常规的分批工艺要高得多。 四、 溶剂产生的调节 最近实验的结果有助于更好理解培养基组 成对丙酮丁醇菌的影响。未解离的丁酸似 乎是调节溶剂产生的主要因子，图 3 3推 断菌体生长和代谢受 本身代谢物 调节的示 意图。未解离的丁酸抑制细胞生长和产酸， 同时启动丁醇的产生。 NH4+ 激活细胞生 长和产酸，但过剩的氮抑制溶剂的产生。 分批发酵中，未解离的丁酸浓度在 0.2- 0.4g/L，即出现抑制生长和产酸 。未解离 酸浓度达 0 5 1 5g/L时，自然的会启动 溶剂的产生。如达不到 临界酸浓度 (可能 pH 太高或初糖浓度太低 )溶剂就不会形成。 连续发酵处于平稳状态时，即使很低的酸 浓度，溶剂也能产生。