蛋白纯化缓冲液-万金油Buffer与镍柱

万金油buffer Dr. Burgess 这人特有意思，喜欢吹嘘他发现的小trick。比如，他得意说他是全美国最早用coomassie blue染蛋白胶的人。据他说，六几年的时候他看到一个澳洲的老兄的一片文章,讲述一种新奇的染料叫考马市亮蓝, 比当时流行的染料amido black灵敏十倍以上。所以他就写了一封信要了一些，结果效果奇好。我们听得都目瞪口呆。不过Burgess最自豪的，还是他的“万金油”buffer。他告诉我们说，他几十年了，总喜欢用这个buffer的配方，什么蛋白都喜欢这种buffer, 可以说到了包治百病的神奇地步。尽管他吹得神乎其神，配方却十分简单。这个buffer叫TGE,就是Tris, glycerol 和 EDTA。配方是这样的: 50mM Tris pH 7.9 0.5mM EDTA 50mM NaCl 5% glycerolTris EDTA NaCl 这三样都没什么，真正关键的是5%glycerol。有了这个glycerol, 很多蛋白，尤其是酶会十分稳定。这个稳定的效果是十分惊人的。Dr.Burgess就此跟我们讲了他的经历。六十年代的时候，他还是个小博士后，在watson 实验室里干，主要是纯化细菌RNA polymerase的各个亚基。那时候一个大问题是RNA polymerase纯化出来后十分不稳定, 放冰上, 过30分钟，活性还会损失一半。Burgess有一次不小心出了错误，把纯化出来的RNA polymerase和glycerol 混合了。结果意外发现，RNA polymerase 变得十分十分的稳定。稳定到什么程度呢,就是你把这个酶加上50%glycerol，用平信从美国寄十几天到澳洲，活性还有780%！另外Burgess也提到，如果要保存的蛋白有二硫键，加一点DTT，防止蛋白形成非天然的二硫键, 也会对蛋白质的稳定有好处。为了让我们对这个 万金油buffer的好处有感性认识, Burgess设计了一个实验让我们做。他之前已经准备好了在大肠杆菌中表达的GFP包涵体(inclusion body)。我们把包涵体分成两部分，一部分用guanidinium hydrochloride（盐酸胍）溶解变性，另一部分用sarkosyl (N十二烷基肌氨酸钠）溶解变性。然后把这些溶解的GFP溶液分到一个96孔板上,每个孔10微升，然后加入倍的refolding buffer 来稀释，稀释了之后，变性的GFP就开始重折叠。我们有一个hampton 卖的refolding 试剂盒，内有十几种不同配方的refolding solution。我们试了所有这些buffer 同时还试了TGE, TGE+15% glycerol, TGE+35% glycerol, TGE+45% glycerol,这四种buffer。由于GFP折叠好了才能发荧光，用一个fluorescence plater reader，我们可以实时监控折叠的效果。结果让人很吃惊，Hamton卖的这个试剂盒，虽然配方都很fancy,但是一塌糊涂，没有一种溶液能让GFP重折叠的很好。相比之下，TGE的四种溶液都很好，GFP重折叠的效率是hampton kit的几十倍。最强的是TGE+35% glycerol。另外，不论是用Gudn HC变性还是用sarkosyl来变性，TGE+glycerol 的重折叠的效果都很好。实验结果出来后，看着我们惊讶的表情，Burgess脸上都笑开花了，呵呵。这个实验我还学到的一个教训是,不能迷信商业化的kit, 很多kit吹得很牛，但并不一定真的好用。Ni 柱重生一般常用的步骤是：1.ddH2O洗5CV，6M盐酸胍洗1-2CV（这里流速慢点，浸泡也行的，我一般第一个CV泡1h，再加等体积的盐酸胍浸泡2h），多洗点柱体积就更好了。如果填料实在很脏的话，可以用NaOH洗，但要先查找该款Ni柱的基架耐受的NaOH浓度。2. ddH2O洗10CV，然后用100mM EDTA洗1-2CV（流速要慢点，要把Ni柱洗白，Ni充分的被EDTA螯合下来）3. ddH2O洗10CV，然后用200mM NiSO4上柱1-2CV（流速要慢，让Ni充分挂柱，或者1CV直接浸泡过夜也行）4. ddH2O洗10CV，然后20%乙醇洗2CV，4度保存即可。 以上柱体积的量可以适当增加点，效果更好点。还有就是蛋白不挂柱子，不一定就是柱子的问题，有可能是蛋白本身的问题，也有可能是缓冲液不合适影响了蛋白的性质。如果真是填料一点都不结合目的蛋白，那柱子得有多脏啊。你可以取点柱子，加点loading buffer煮一下，跑个SDS-PAGE看看，是否上面残留量很多蛋白，当然柱子看起来得是蓝色/绿色的，确认还有Ni的存在。