凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量.ppt

实验三 凝胶过滤层析法 测定蛋白质分子量 【 目的要求 】 掌握凝胶层析的基本原理 学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量 的实验技能 【 原理 】 凝胶层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用 具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离 物质的分子大小不同 来进行分离的技术。 相对分子质量较大 的物质由于直径大于凝胶网孔 被完全排 阻 在孔外， 只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此流程 较短，移动速度快；所以 首先流出 。 相对分子质量较小 的物质由于直径小于凝胶网孔，可 完全 渗透 进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此流程 较长，移动速率慢；所以 最后流出 。 中等大小的分子 ，它们在凝胶颗粒内外 部分渗透 ，渗透的 程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二 者之间，这样 分子大的组分先流出，分子小的组分后流出。 这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的 顺序依次流出，从而达到了分离的目的。 图 3 -1 凝胶层析分离原理示意图 【 基本概念 】 外水体积、 内水体积、 柱床体积 、 洗脱体积 外水体积（ Vo）是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的 体积 内水体积 （ Vi）是指凝胶颗粒中孔穴的体积。柱床体积 是（ Vt）凝胶柱所能容纳的总体积。 【 基本概念 】 洗脱体积 （ Ve） 是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱 液的体积。 它包括自加入样品时算起，到组分最大浓度出现 时所流出的体积。 Ve一般是介于 Vo 和 Vt之间的。 对于 完全排阻 的大分子由于其不进入凝胶颗粒内， 故其 洗脱体积 Ve Vo 对于 完全渗透 的小分子由于它可以存在于凝胶柱整个体 积内，故其洗脱体积 Ve Vt 分子量介于二者之间的分子，它们的洗脱体积也介于二者 之间。 图 3 -3 凝胶层析柱洗脱曲线示意图 完全排阻的大分子 中等分子 完全渗透的小分子 洗脱体积的测定 外水体积（ Vo） ： 可以通过测定 完全排阻 的大分子物 质的洗脱体积来测定，一般常用 蓝色葡聚糖 -2000作为 测 定 外水体积的物质 。 内水体积 （ Vi）： 可以通过测定 完全渗透 的小分子溶 质 （如 重铬酸钾 ） 的洗脱体积来测定 即 Ve Vo Vi 推出 Vi Ve Vo 柱床体积（ Vt）： 1)可用下式计算： Vt （ D/2） 2 h 2）根据 Vt Vo Vi 可以得到 3）加入一定量的水至层析柱预定标记处，然后测量水 的体 积 。 分配系数 表示某个组分在内水体积和在外水体积中的浓度 分配关系。 Vo 和 Vt可以通过测定得到，测定了某个组分的 Ve 就可 以得到这个 组分的 分配系数 。 在一定的条件下， Vt和 Vo都是 恒定值。 大分子 先从柱中流出 Ve值 小 Kav值 小 小分子 后从柱中流出 Ve值 大 Kav值 大 Kav Ve Vo V t Vo Kav值的大小和凝胶柱床的总体积（ Vt）、外水体积（ Vo） 以及分离物本身的洗脱体积（ Ve）有关。 对于 完全排阻 的大分子 Ve Vo 故 Kav 0 对于 完全渗透 的小分子 Ve Vt 故 Kav 1 Kav是判断分离效果的一个重要参数，同时也是测定蛋 白质分子质量的一个依据。 对于某一型号的凝胶，在一定的分子质量范围内，各 个组分的 Kav与其 分子质量的对数成线性关系： Kav blgMr+c 由于 Ve 和 Kav也成线性关系所以同样有： Ve blgMr+c 通过将一些已知分子质量的标准蛋白质在同 一凝胶柱上以相同条件进行洗脱，分别测定 Ve 或 Kav， 并根据上述的线性关系绘出标准曲线，然 后 在相同条件下测定未知样品的 Ve 或 Kav， 通过 标准曲线即可求出其分子质量。 吸水率和床体积 吸水率是指 1g干的凝胶吸收水的体积或者重量 ，但它不包 括颗粒间吸附的水份。所以它不能表示凝胶装柱后的体积。 Sephadex G-25 200 数字是吸水率 10 例如 Sephadex G-75 吸水率 7.5 ml/g 床体积指 1g干的凝胶吸收水后的最终体积 例如 Sephadex G-75 床体积 12 15 ml/g 干胶用量 (g) = 柱 (ml)床体积 /凝胶床体积 (ml/g) 【 应用 】 生物大分子的纯化 分子量测定 脱盐及去除小分子杂质 去热源物质 溶液的浓缩 【 操作方法 】 一、凝胶的选择和处理 量 取 110mL Sephadex G-75于 250 mL烧杯中，加入 洗脱液 100mL，在沸水浴中煮沸 1h，冷却至室温后抽真 空脱去颗粒空隙中的空气。 二、装柱 1） 取洁净的玻璃层析柱垂直固定在铁架台上。 2） 凝胶柱床总体积（ Vt）的测定：在距柱上端约 5 处作一记号，关闭柱出水口，加入蒸馏水，打开出水 口，液面降至柱记号处即关闭出水口，然后用量筒接收 柱中蒸馏水，读出的体积即为柱床总体积 Vt 。 3）向柱内 加入约 1/4柱体积的洗脱液 ，将浓浆状 的凝胶缓慢地倾入柱中，使之 自然沉降 ，凝胶沉 降约 2 3 高度后打开出水口，待胶面上升到柱 记号处时则装柱完毕。然后关闭出水口，静置片 刻，等完全沉降，将接接口的乳胶管与盛有洗脱 液的储液瓶连接，调流速 3 6mL/10min，用 2 3 倍 柱床体积的洗脱液平衡。 三、 Vo 的测定 打开柱上端的塞子，待柱内洗脱液下降至与凝 胶胶面相切时，关闭出水口。用细滴管吸取 1 mL 蓝色葡聚糖 -2000液，小心地绕柱壁一圈 （ 距胶面 2mm） 缓慢加入，打开出水口 （ 开始收集 ） ，待溶 液完全渗入柱床后，关闭出水口，取 1mL洗脱液沿 管壁洗柱一次，等溶液完全渗入柱床，柱上端再 加入几毫升洗脱液，将柱上端接口与储液瓶连接， 打开出水口，开始洗脱。 收集 蓝色葡聚糖 -2000洗 脱峰 ，测出洗脱体积 Ve ， 得出 Vo值 。 1） 用洗脱液配制标准蛋白质溶液（ 牛血清蛋白、鸡卵清蛋 白、溶菌酶）。 2） 按上述方法 加入 1mL标准蛋白质混合液，以 3mL/10min 的速度洗脱并收集洗脱液体积。 3）分别收集各标准蛋白质的洗脱峰 （ 灵敏度 0.2A），测 量它们的洗脱体积 Ve。 代入公式 计算出各标准蛋白质的 Kav值。 4） 以 Kav值为横坐标，标准蛋白质 lgMr为纵坐标，绘出标 准曲线。 四、标准曲线的制作 五、未知样品蛋白质分子量的测定 将待测 待测鸡卵粘蛋白样品 配制成 5mg/mL溶液 , 以下步骤完全按照标准曲线的条件操作。根据紫 外检测的洗脱峰位置，量出洗脱体积 Ve ，代入公 式计算待测蛋白的 Kav值，然后在标准曲线上查得 lgMr，其 反对数 便是未知样品的相对分子质量。 样品 Mr 1gMr e Vt Kav 牛血清蛋白 67， 000 4.8261 鸡卵清蛋白 45， 000 4.6532 溶菌酶 14， 300 4.146 待测鸡卵粘 蛋白样品 六、实验结果与分析 实验结果填入表中 结果分析 绘制 蓝色葡聚糖 洗脱曲线 绘制 标准蛋白质 洗脱曲线 绘制 鸡卵粘蛋白 样品 洗脱曲线 绘制 lgMr-Kav标准曲线 ,确定待测 样品 鸡卵粘蛋白 相对分子质量 . 谢谢同学们