双因子杂交、伴性遗传和三点测交遗传实验报告

handowg i rKiverity生命科学学院遗传学实 验 报 告实验五六七：双因子杂交、伴性遗传和三点测交一、实验目的：1、通过对果蝇的杂交实验，正确理解分离定律的实质，并验证与加深理解三个的遗传规律。2、认识伴性遗传的正、反交差别，掌握伴性遗传的特点。3、掌握绘制遗传学图的原理和方法，加深对重组值、遗传学图、双交换、并发率和干涉等概念的理 解。4、掌握果蝇的杂交技术，并学会记录交配结果和掌握统计处理的方法。二、实验器材：1、材料：18号果蝇（野生型）及三种突变体果蝇即14号果蝇（黑身残翅）、w号果蝇（白眼）和 6号果蝇（白眼卷刚毛小翅）2、试剂：乙醇、乙醚、果蝇培养基等3、器具：麻醉瓶、酒精灯、白瓷板、毛笔、镊子、培养管、棉球等三、实验原理：果蝇具有生活史短、繁殖率高、饲养简便、染色体数目少（2n=8 ）和突变性状多等特点，是研究遗 传学的好材料。本次设计实验就是利用果蝇进行一系列的遗传学验证实验和染色体基因相对顺序和距 离的测定，下面简要介绍关于双因子杂交、伴性遗传和三点测交的基本原理。1、双因子杂交：果蝇的灰体基因（E ）与黑檀体基因（e ）为一对相对性状，位于OR70.7位置，而长翅（Vg ）与残翅 （vg ）为另一对相对性状，位于HR67.0位置。这两对基因是没有连锁关系的，位于不同染色体上的 非等位基因。因此非同源染色体的这两对非等位基因可以很好的验证自由组合定律。自由组合规律：位于非同源染色体上的两对非等位基因，其杂合体在形成配子时，等位基因彼此分 离，进入不同的配子中，非等位基因可自由组合进入同一配子，结果产生4种比例相等的配子。若显 性完全，F1自交产生F2代表现出4种表型，比例为9 ： 3 ： 3 ： 1。双因子杂交的遗传规律：双因子杂交反交双因子杂交正交18 早x 14&14? x186灰长黑残黑残灰长F1灰长F1灰长F2:灰长：灰残：黑长：黑残=9 :3:3:1F2:灰长：灰残：黑长：黑残=9 :3:3:12、伴性遗传:位于性染色体上的基因叫作伴性基因，其遗传方式与位于常染色体上的基因有一定差别，它在亲代与 子代之间的传递方式与雌雄性别有关，伴性基因的这种遗传方式称为伴性遗传（sex-linked inheritance）。果蝇的红眼与白眼是一对相对性状，由单基因控制，位于X染色体上，基因之间的关系为红眼对白眼 完全显性。当红眼果蝇（早）和白眼果蝇（匀 杂交，F1代中的果蝇均为红眼，F2代中红眼果蝇：白 眼果蝇=3 :1,但在雌果蝇中全为红眼，在雄果蝇中红眼果蝇：白眼果蝇=1 : 1。当反交时，F1代中 的雌果蝇为红眼，雄果蝇却为白眼。F2代中红眼果蝇：白眼果蝇=1:1,在雌果蝇或雄果蝇中红眼果 蝇与白眼果蝇的比例均为1：1。伴性遗传的遗传规律:伴性遗传反交18?w?x 186X+X+?红眼XwY6白眼XwXw6白眼X+Y?红眼F1: X+Xw?红眼X+Y6红眼F1: X+Xw?红眼XwY6白眼F2: X+ X+ X+Xw X+ Y Xw YF2: X+Xw Xw Xw X+ Y Xw Y?红眼？红眼6红眼6白眼?红眼？白眼6红眼6白眼伴性遗传正交3、三点测交位于同一条染色体上的基因是连锁的，而同源染色体上的基因之间会发生一定频率的交换，使子代中 出现一定数量的重组型。重组型出现的多少反映出基因间发生交换的频率的高低而根据基因在染色体上直线排列的原理，基因交换频率的高低与基因间的距离有一定的对应关系。基因图距就是通过基因间重组值的测定而得到的。如果基因座位相距很近，重组率与交换率的值相等，直接将重组值作为基因图距；如果基因间相距较 远，两个基因间往往发生两次以上的交换，必须进行校正，来求出基因图距。三点测交：用野生型纯合体与三隐性个体杂交，获得三因子杂种（F1），再使F1与三隐性基因纯合 体测交，通过对测交后（Ft）代表现型及其数目的分析，分别计算三个连锁基因之间的交换值，从而 确定这三个基因在同一染色体上的顺序和距离。通过一次三点测验可以同时确定三个连锁基因的位置，即相当于进行三次两点测验，而且能在试验 中检测到所发生的双交换。如果两个基因间的单交换并不影响邻近两个基因的单交换，那么预期的双交换频率应当等于两个单交 换频率的乘积，但实际上观察到的双交换值往往低于预期值，因为每一次发生单交换，它邻近也发生 一次交换的机会就减少，这叫干涉。一般用并发率表示干涉的大小。三点测交（一次杂交，一次测交）6 号 $（ wsnm/wsnm） x 18 号&（+/）白春小红直长F1:早(+/wsnm)(wsnm/Y)四、实验步骤:红直长白卷小统计F2代各类型及数目填入表3第一周：1.准备工作：将麻醉瓶和器具（白瓷板、毛笔等）进行消毒灭菌，放凉。领取培养管6支，填写标签并贴在培养管上。标签写法举例如右：选处女蝇：共有4种果蝇品系，安排6个大桌分别负责18号、14号、W号、6 号果蝇的麻醉和雌雄分选（昨晚10:30已倒过果蝇，现在9:00点分选的雌蝇均为 处女蝇）。2.杂交组合设计:双因子正交：18? x 14双因子反交：14?x 186个杂交伴性正交：18? x W伴性反交：W?x 18三点测交：6?x 18三点测交：6?x 183、按照设计的组合将处女蝇和雄蝇分装在各个培养管中，每管中35对即可。用毛笔轻扫进培养管的 管壁上，塞上棉塞后平放桌上。待管中果蝇都苏醒并活动自如以后，再将培养管竖着放进培养盒里。 放25培养箱进行培养。第二周：4、倒掉亲本果蝇并处死第三周：5、观察F1然后计数，选择生活状态良好的Fj互交，35对即可，放入新的培养管中置25培养箱 进行培养。第四周：6、清除培养瓶中所有的F1亲本第五周：7、观察F2，统计F2，处理数据。（统计过的果蝇放入酒精瓶中，杀死）五、实验记录：收集处女蝇时间：2011-10-21 9:00 ；亲本接种时间：2011-10-21 ；清除的时间：2011-10-28 ；F1雌雄蝇接入新培养瓶的时间：2011-11-4 ；清除培养瓶中成蝇的时间：2011-11-11 ；记录数据的日期：2011-11-18。记录数据如下表所示：表1双因子杂交的实验数据双因子正交（18*x14d）双因子反交（14$x18J）组别灰长灰残黑长黑残灰长灰残黑长黑残第一组431512616142第二组25893第二组125185第四组第五组287845726187第六组1022114441第七组1454212131第八组41161554141第九组9230第十组184130第十一组126339640总计185647129139455312伴性遗传正交（18早xW）伴性遗传反交（W?x18）组别白红白早红早白红白早红早第一组15170278664第二组4401720141622第二组12100180131415第四组261904116112415第五组182504226152620心一i-口第六组13801911131616第七组191602420261925第八组118117812127第九组912030910129第十组12200221723818第十一组7120581354总计1461511262143156158155表3三点测交的实验数据三点测交（6?x18）组别红直长 +白卷小 wsnm红直小 +m白卷长 wsn+红卷小+snm白直长 w+白直小 w+m红卷长+sn+第一组43261582731第二组573410110第二组136661300第四组15117112610第五组593612431143第六组5020854900第七组49311074710第八组3971371831第九组28181231722第十组3129735611第十一组176202302总计401193965525681610六、实验数据分析：由于单个小组的实验数据有限（我们组为第一组），在统计上需要大量的数据作为基础，因此实验数 据的分析过程中的观察值和预期值都是基于全班实验结果的总计数据。1、双因子杂交的实验数据分析（1）预期F2的表型与比例：灰长：灰残：黑长：黑残=9 ：3：3： 1（2 ）正交的子二代的数量明显比反交的子二代的数量多这与求偶行为有一定的关系。（3）将F2中相同表型的个体叠加起来，作为这种表型的观察值，进行X2测验。表4双因子杂交的X2测验灰长灰残黑长黑残总计观察值（O）32410912441598预期值（E ）33611211238598偏差O-E-12-3123(O-E) 2/E0.430.081.290.24X2=2.04df=4-1=3 ;a=0.05 ；xa2=7.81结论：X2Xa2 ；观察值与预期值之间的差异不显著，实验结果符合9 :3 ： 3 ： 1的分离比。2、伴性遗传的实验数据分析（1）伴性遗传正反交的表型不同。预期结果：正交时，F1均为红眼，F2代中红眼：白眼=3 :1,但 在雌果蝇中全为红眼，在中红眼：白眼=1： 1。当反交时，F1代中的雌果蝇为红眼，雄果蝇却为白 眼，F2代中红眼果蝇：白眼果蝇=1: 1 ,在雌果蝇或雄果蝇中红眼果蝇与白眼果蝇的比例均为1: 1。（2 ）在伴性遗传的正交的实验结果中出现一只白眼雌果蝇，这个例外个体产生，是由于在减数分裂 的过程中两条姐妹染色单体不分离造成的，F2中出现了不应该出现的早性白眼，但这种情况极为罕 见，约几千个体中有一个。不分离现象如下图所示：F1配子F2（3 ）下表对统计数据进行X2测验，已确定观察值与预期结果的符合程度。表5伴性遗传的X2测验伴性遗传正交（18早XW）伴性遗传反交（W?x18）白红白早红早白红白早红早观察值（O）1461511262143156158155预期值（E ）1401400280153153153153偏差O-E6111-18-10352(O-E ) 2/E0.260.861.160.650.060.160.03X2 =2.280.90df=4-1=3 ;a=0.05 ；xa2=7.81结论：X正2Xa2，X反268.8%w sn m193+ + m96卜 17.5%VVw sn +55+ sn m25a 10.7%VVw + +68w + m16r,3.0%VV+ sn +10合计864100%13.7%20.5%28.2%两端的基因间距离进行校正：28.2%+2x3.0%=34.2%据本次实验结果算出的三个基因的相对顺序和距离wsnm13.7|20.534.2 图1 w-sn-m三个基因的遗传学图单交换率分别为13.7%和20.5% ；双交换率为3.0%并发率=3.0%/(13.7%x20.5%)=1.07，干扰=1-1.07=-0.07 ;说明一次交换后并不干扰它的临近再发 生一次交换。相反的一次交换后促使它的临近在发生一次交换，因此w-sn-m三个基因之间存在着负 干扰。w-sn-m三个基因间负干扰现象的出现可能有两个原因。一：果蝇在传代的过程确实出现了负干扰的 现象，这与果蝇的品种有一定的关系，某些研究者利用家蚕的一些基因在研究过程中确实存在过负干 扰现象；二：这可能与整个实验室的某一或几组统计数据的偏差有关，也可能是果蝇的直卷刚毛的不 易辨认有关。当然要确定其真正的原因还需要更多实验和更多实验数据的支撑。七、结果讨论: 本次遗传学大实验历时五周，并分为双因子杂交、伴性遗传和三点测交三个部分。这需要良好的分工 协作，同时在辨别果蝇与计数的过程中同样需要足够的耐心与认真。就实验结果来看，每个小组的实 验数据是远远不够的，但按照整个班级的实验数据进行的统计分析还是具有一定的可信度的，例如双 因子杂交和伴性遗传的实验结果分别很好的验证自由组合定律和伴性遗传的特点。对于某个特殊现象 的出现也能够给出合理的解释。三点测交的实验中也可以正确的判断三个基因的顺序和大概的距离， 只是在并发率和干涉的方面有部分问题，可能存在负干扰，也可能由于部分数据的偏差所致。但是总 体来说，本次的实验还是相当成功的。八、备注：1、各培养瓶的标注一定要清晰明了，放入的果蝇应对号入座。2、保证杂交所用的亲本雌果蝇一定是处女蝇；3、杂交后倒掉亲本时，一定要倒干净，以免造成回交产生实验误差。同样在F1自交后，倒掉F1时 一定要倒干净，以免造成F1和F2的混杂产生实验误差。