资源描述
第6章 微生物的生长及其控制,第1节 测定生长繁殖的方法 第2节 微生物的生长规律 第3节 影响微生物生长的主要因素 第4节 微生物培养法概论 第5节 有害微生物的控制,微生物不论在自然条件下还是在人为条件下 发生作用,都需要达到一定的数量才能实现。 微生物生长的定义是指微生物个体数目的增 加,即繁殖。 微生物死亡的定义是指细胞永久失去繁殖的能力。,第1节 测定生长繁殖的方法 一、测生长量 (一)直接法 测细胞干重 测细胞湿重 (二)间接法 比浊法 测生理指标,二、计个体数 (一)直接法 用计数板在光学显微镜下直接观察并计数。,荧光染料染色: 活菌为绿色,死菌为红色,(二)间接计数法 比法浊 平板菌落计数法 (1)浇注平板法(pour plate) (2)涂布平板法(spread plate) 厌氧菌的菌落计数 滚管培养法(教材P168),第2节 微生物的生长规律 一、微生物的个体生长和同步生长 研究单细胞微生物的个体生长很困难。 1、同步培养(synchronous culture): 使某一群体中的所有个体细胞尽可能都处于同 样的细胞生长和分裂周期的培养方法。 2、同步生长( synchronous growth): 某细胞群体中所有个体细胞处于分裂步调一致 的生长状态。,获得同步生长的方法 (1)环境条件诱导法 (2)机械筛选法,膜洗脱法,薄膜洗脱法收集的大肠杆菌在葡萄糖基础培养基中的同步生长。,二、单细胞微生物的典型生长曲线(同步,封闭),单细胞微生物的典型生长曲线,(一)延滞期(lag phase) 培养开始最初细胞数目没有增加的一段时期。 特点: 生长速率常数为零,但合成代谢十分活跃。 细胞形态变大或增长。 细胞内RNA(尤其是rRNA)含量增高。 对外界不良条件反应敏感。,生长速率常数(R):单位时间内细胞数目或细胞量的变化。,影响延滞期长短的主要因素 (1)菌种 生长快的菌比生长缓慢的菌延滞期短。 (2)接种菌菌龄 采用对数生长期的菌作为接种菌可缩短延滞期。 (3)接种量 适当提高接种量可缩短延滞期。 (4)培养基成分 营养丰富,与种子培养条件接近的培养基可缩 短延滞期。,(二)指数期(对数生长期)(exponential phase) 紧接延滞期后细胞数目以几何级数增长的一段时期。 特点: 生长速率常数R最大,代时G最短。 细胞进行平衡生长。 酶系活跃,代谢旺盛。,代时(G):1个细胞分裂为2个所需要的时间。,影响指数期微生物代时长短的主要因素: 菌种 原核比真核短,小的真核比大的真核短。 营养成分 营养物浓度 生长限制因子(growth-limited facter) 4. 培养温度(教材表6-1),(三)稳定期(stationary phase) 是在对数生长之后细胞群体进入的生长与死亡处于 动态平衡的一段时期。 特点: 生长速率常数R=0 菌体产量达到最高 某些细胞开始启动一些特殊的代谢途径: 形成芽孢,形成贮存颗粒,形成次级代谢产物。,稳定期到来的原因: 营养物质的耗尽。 营养物比例失调。 有害代谢产物的积累。 pH、氧化还原势等条件越来越不适宜。,(四)衰亡期(decline phase,death phase) 整个群体生长速率R为负值的时期。 特点: 个体死亡速度超过新生速度,R为负值。 细胞形态发生多形化。 细胞开始自溶。 产生衰亡期的主要原因: 环境对继续生长越来越不利。,三、微生物的连续培养 连续培养的目的 长时间地保持微生物的对数生长状态以提高经 济效益。 连续培养的方式 恒浊器 恒化器,单级 多级,单级 多级,连续培养的利弊 利:高效节约,自控,产品质量稳定 弊:菌种易退化,易污染,营养物利用率低于单 批培养。 4. 连续培养时间是有限制的,四、微生物的高密度培养 自学教材P159-160,第3节 影响微生物生长的主要因素,影响微生物生长的因素很多,但主要的因素 有4个:水分、温度、氧气和pH值。,一、水分对微生物生长的影响 水活度 水活度(water activity,aw):它表示在天然或人 工环境中,微生物可实际利用的自由水或游离水的 含量。 aw =,P P0,(教材P 93),农业土壤中的aw一般在0.91之间。,生长最低 aw,细菌,一般:0.900.98 嗜盐菌:0.75(约5.5M NaCl),酵母菌,一般:0.870.91 高渗酵母:0.610.65 鲁氏酵母:0.60,霉菌,一般:0.800.87 耐旱菌:0.650.75 双孢旱霉:0.60,调剂溶质(compatible solutes) 生活在水活度低(渗透压高)的环境中的微生物 如何获得水分(细胞处于正态水平衡positive water balance)? 靠提高细胞内部溶质的浓度: (1)泵入无机离子 (2)合成或提高某种有机溶质的浓度(直接合成 或从环境中积累)。,用来调节细胞内水活度或溶质浓度的溶质叫 调剂溶质(compatible solutes)。它必须不阻碍 细胞内其他生化过程。 细胞内调剂溶质的浓度取决于外部溶质浓度。 每种生物合成或积累调剂溶质的最大量是由每种 生物的基因决定的一种特性。这决定了不同的生 物对水活度的不同耐受性。,微生物的调剂溶质 微生物 积累的主要溶质 生长最低aw,细菌 甜菜碱,脯氨酸(G+) 0.97-0.90 淡水蓝藻 蔗糖,海藻糖 0.98 海水蓝藻 -葡萄糖基甘油 0.92 盐湖蓝藻 甜菜碱 0.90-0.75 嗜盐厌氧 甜菜碱,ectoine, 海藻糖 0.90-0.75 光合细菌 极端嗜盐古菌 KCl 0.75 和一些细菌,微生物的调剂溶质 微生物 积累的主要溶质 生长最低aw,海洋藻类 甘露醇,各种糖苷, 0.92 脯氨酸,二甲基巯基丙酸 杜氏藻 甘油 0.75 (嗜盐绿藻) 耐干旱酵母 甘油 0.83-0.62 耐旱丝状真菌 甘油 0.72-0.61,杜氏藻 : Dunaliella,微生物中几种主要 的有机调剂溶质,甜菜碱,海藻糖,蔗糖,甘油,甘露醇,二甲基巯基丙酸,二、温度对微生物生长的影响 微生物生长的三个温度常数温度三基点 最低生长温度(minimum temperature) 最适生长温度(optimum temperature) 最高生长温度(maximum temperature) 三基点对于每种微生物一般是其特有的,但又不 完全固定,它们能被其他的环境因子轻微地改变, 尤其是生长的培养基质对基本温度的影响大。,最低生长温度:在此温度下,生长不会发生。 细胞膜不能保持流动状态,影响营养物质的 运输和质子动力的形成。 最高生长温度:超过这一温度,不可能生长。 高温使一些分子失活,细胞膜破裂。 最适生长温度:生长最快。,微生物生长的温度范围 根据微生物的最适温度可将它们划分为4大群: (1)嗜冷菌(psychrophiles) Topt15 永久寒冷的地区。 (2)嗜温菌(mesophiles) Topt 45 温血动物,热带与温带土壤、水域。 (3)嗜热菌(thermophiles) 很热的环境中:堆肥。 Topt 45 (4)超嗜热菌(hyperthermophiles) Topt80 极端热的环境:火山口,硫磺热泉,自燃煤堆。,Growth rate,3. 嗜冷菌冷适应的分子机理 酶在冷的条件下能发挥最佳功能。 膜中含有较高浓度的不饱和脂肪酸 4. 嗜热菌热适应的分子机理 酶和其他蛋白质对热的稳定性更高,在高温有最 好的功能(增加盐桥、大量的疏水内核)。 细胞内特殊的溶质(环2,3-二磷酸甘油)。 细胞内存在大量的分子伴侣。 膜中含饱和脂肪酸、植烷和醚形成的单层膜。,三、氧气对微生物生长的影响 1. 按照微生物与氧的关系,可将它们分为2大类: 好氧微生物(aerobes) 厌氧微生物(anaerobes) 2大类又可进一步分为5类: 专性好氧(obligate or strict aerobes) 兼性厌氧(facultative anaerobes) 微好氧(microaerophilic bacteria) 耐氧菌(aerotolerant anaerobes) 专性厌氧菌(obligate anaerobes),好氧,厌氧,5类细菌在 含有巯基乙醇的培养基中的生长和分布。,氧的毒性形式的产生和消除 羟自由基(OH) 超氧化物(O2- ) 单一态氧( O2) 过氧化氢(H2O2),在呼吸过程中O2还原成H2O中产生的不可逆副产物,氧的毒性形式:,(1)过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2) O2氧化黄素蛋白无一例外地要产生一种有毒的 化合物H2O2,O2+e- +H+ H2O2,FP,H2O2+H2O2 2H2O+O2,Catalase,H2O2+NADH+H+ 2H2O+NAD+,Peroxidase,过氧化氢酶,过氧化物酶,(2)超氧化物(superoxide, O2- ) 由H2O2的氧化作用以及其他酶(黄素蛋白,Q,铁硫蛋白)催化的氧化作用或加氧作用产生。 2 O2- +2H+ O2+H2O2,超氧化物岐化酶(SOD),2 H2O2 2H2O+O2,过氧化氢酶(catalase),O2+ e- O2-,FP,FeS, Q 等,(3)羟自由基(hydroyl radical, OH ) 由离子辐射产生,少量的羟自由基可由于细胞 内H2O2的积累而产生: H2O2+e-+H+ H2O+OH,(4)单一态氧(singlet oxygen,O2) 能量很高,外围电子高度活化。 产生方式: 光化学反应(细胞含光敏色素P): P+hv P* P*+O2 O2 生物化学反应:各种过氧化物酶。 类胡萝卜素能淬灭单一态氧。,小结: 毒性氧形式的产生 O2+e- O2- O2- + e- +2H+ H2O2 H2O2+ e- + H+ OH OH+ e- + H+ H2O,O2+光+光敏色素 过氧化物酶,O2,有毒氧的消除: 超过氧化物岐化酶酶 superoxide dismutase 2 O2- +2H+ O2+H2O2 过氧化氢酶 catalase H2O2+H2O2 2H2O+O2 过氧化物酶 peroxidase H2O2+NADH+H+ 2H2O+NAD+ 类胡萝卜素 淬灭单一态氧,四、pH值对微生物生长的影响 每一种生物都有一生长的pH值范围,一般有相 当固定的最佳pH值。 绝大多数自然环境的pH 值在59之间。 只有少数生物能在低于2或高于10的pH中生长。,真菌 最适pH5 细菌 最适pH一般为中性 6.07.5 放线菌 最适pH 7.08.0,专性嗜酸菌(obligate acidophilic bacteria) 在pH 2.04.0 生长,但不能在中性条件下生长。 专性嗜酸菌的细胞膜在中性pH时溶解,细胞裂解 死亡。 专性嗜酸菌包括:硫杆菌属(Thiobacillus),硫 化叶菌(Sulfolobus),嗜热支原体(Thermoplasm) 等。,嗜碱微生物(alkaliphilic microorganisms) 生长最适pH 1011 ,在中性条件下不生长。 嗜碱微生物包括: 细菌:芽孢杆菌,外硫红螺菌(Ectothiorhodospira) 放线菌:链霉菌,棒状杆菌 蓝细菌 古细菌 真菌,参阅土壤与环境微生物学第20章,必须记住: 这里讲的pH值是指外部pH值,细胞内的pH值一般都是保持中性左右的。 在极端嗜酸或极端嗜碱菌中,细胞内的pH值可能比中性偏移11.5 pH单位。 大多数微生物的最适pH是在68之间,它们叫嗜中性微生物,细胞质pH保持中性或与中性非常接近。,缓冲剂(Buffers) 培养基中常需要加缓冲剂来维持pH的相对稳定。 缓冲剂的有效pH范围很窄。不同的pH范围需要不同 的缓冲剂。 磷酸盐(常用KH2PO4)是接近中性的pH (6-7.5)范 围的极好的缓冲剂,第4节 微生物培养法概论 一、实验室培养法 (一)固体培养法 1、好氧菌的固体培养 琼脂平板,试管斜面,克氏扁瓶。 2、厌氧菌的固体培养 (1)高层琼脂柱 (4)厌氧罐 (2)厌氧培养皿 (5)厌氧手套箱 (3)亨盖特滚管技术,厌氧菌的分离:稀释摇管法,(二)液体培养法 1、好氧菌的液体培养 在液体培养中,氧的供应始终是好氧菌生长繁殖的限制因子。提高氧浓度的措施有: (1)浅层液体静止培养 (2)摇瓶培养 (3)深层液体底部通气 (4)对培养液进行机械搅拌,2、好氧菌液体培养法 (1)试管液体培养 (2)三角瓶浅层液体培养 (3)摇瓶培养 (4)台式发酵罐 3、厌氧菌的液体培养法 (1)在培养液中加入 还原剂:巯基乙醇,半胱氨酸,VC,疱肉。 (2)将培养物放入厌氧罐或厌氧手套箱中。 (3)在液面封上石蜡油,凡士林-石蜡油。,二、生产实践中培养微生物的装置 (一)固态培养法 1、好氧菌的曲法培养 2、厌氧菌的堆积培养 (二)液体培养法 1、浅盘培养 2、深层液体通气培养 发酵罐,第5节 有害微生物的控制 一、几个基本概念,控制害菌 的措施,杀灭,抑制,灭菌彻底杀灭(一切微生物) 消毒部分杀灭(仅杀灭病原菌),防腐抑制霉腐微生物 化疗抑制宿主体内的病原菌,sterilization,disinfection,antisepsis,chemotherapy,二、物理灭菌因素的代表高温 高温,辐射,超声波,微波,激光,静高压。 过滤。 (一)高温灭菌的种类,高温灭菌,干热灭菌 湿热灭菌,灼烧 烘箱内热空气灭菌法,常压 加压:常规加压灭菌,连续加压灭菌,巴氏消毒法 煮沸消毒法 间歇灭菌法,1、干热灭菌(dry heat steriliazayion) 灼烧 (烧红) 接种环、针 烘箱(150-170,1-2h) 干燥培养皿、移 液管等玻璃器皿 2、湿热灭菌(moist heat sterilization) 用100 以上的加压蒸汽进行灭菌。 (1)常规加压蒸气灭菌法(normal autoclaving) 121 (1kg/cm2) 15-20min 115 (0.7kg/cm2) 30-35min,(2)连续加压蒸气灭菌(continuous autoclaving) 仅用于大型发酵厂的大批培养基灭菌。 让培养基在管道的流动过程中快速升温(135 140 )、维持(515s)和冷却,然后流 进发酵罐。 (3)间歇灭菌(fractional sterilization, tyndallization) 适用于不耐热的培养基的灭菌。 80100 ,1560min。 37 保温过夜。,重复3天,(4)巴氏消毒法(pasteurization) 专用于液态风味食品或调料。 6063 30 min LTH 72 15 s HTST (5)煮沸消毒法 100 数分钟。,热死时间(thermal death time) 热死温度(thermal death point),(二)影响加压蒸气灭菌效果的因素 1、灭菌物体含菌量 含菌量越高,需要的灭菌时间越长。 2、灭菌锅内空气排除程度 3、灭菌对象的pH值 pH6.0 时,微生物易死 pH 60.-8.0 时,不易死亡 4、灭菌对象的体积,(三)高温对培养基成分的有害影响及其防止 1、有害影响 形成沉淀 破坏营养 改变pH,2、防止方法 分别灭菌 低压间歇灭菌 过滤除菌 其他方法,三、化学杀菌剂、消毒剂和治疗剂,化学因素,表面消毒剂,化学治疗剂,液体 气体,抗代谢药物:黄胺 抗生素 生物药物素,(一)表面消毒剂 (二)化学治疗剂 化学治疗(chemotherapy):是应用对寄生生物有 专门作用的化学合成药物,这种药物能够杀死寄生 物或抑制寄生物在机体内增殖,而对宿主没有或很 小毒性。 化学治疗剂(chemotherapeutant):用于化学治 疗的化学物质。包括化学合成的药物,抗生素等。,自学教材178-182页,化学治疗剂对微生物的作用范围,氮二烯五环,吡咯,多烯(烃),亚胺环己酮,放线菌酮,抗生素(antibiotics) 1、定义 抗生素是一类由微生物或其他生物生命活动过 程中合成的次级代谢产物或其人工衍生物,它们在 很低浓度时就能抑制或干扰它种生物的生命活动。,2、产抗生素的生物种类 大多数抗生素是三种主要的微生物:细菌、放线菌和丝状真菌的次级代谢产物。 只有少数抗生素是较高级的真菌、藻类和植物所产生,而且这些抗生素都普遍具有较低的抗菌活性和较低的专一性。 放线菌产生了数量最多、品种最多的抗生素。 细菌产生的抗生素大多为多肽类。 粘细菌研究较少,但已经显示出产生抗生素的频率很高。,抗生素多学科研究入门美Giancarlo Lancini编,王以光译,人民卫生出版社,1998,3、抗生素的作用部位(靶位) (1)细胞壁(2)细胞膜(3)特殊代谢过程 (4)核糖体(5)DNA(6)RNA的合成,4、抗细菌的抗生素,(1)青霉素主要抗G+,青霉素G:对G+菌有强效,对G-菌效果差一点, 对酸敏感,对青霉素酶敏感。,6-APA,青霉素V:比青霉素G 对酸稳定,氨苄青霉素:对酸稳定,抗G+和G-。,羧苄青霉素:抗G-,对酸稳定,吸收差。,甲氧西林:抗青霉素酶,效果不如 青霉素G,对酸不稳定。,Ticarcillin:类似羧苄青霉素,但 对假单胞菌更有效。,红霉素 erythromicin,(2)红霉素主要抗G+ 是最常用的大环内脂类抗生素,由红霉素链霉菌(Streptomycin erythraeus) 产生。,与核糖体50S亚基作用,抑制蛋白质的合成。 对军团菌尤其有效。,(3)链霉素抗G菌为主,也抗结核分枝杆菌。 链霉素,卡那霉素(kanamycin),庆大霉素 (gentamycin),新霉素(neomycin)等都是氨 基苷类抗生素。过去临床上常用来抗G-细菌,现在 一般作为保留药物,只有当其他抗生素无效时才起 用。 链霉素与细菌30S亚基反应,抑制细菌蛋白质的 合成。,链霉素 streptomycin,链 霉 胍,链 霉 糖,与30S亚基反应,抑制蛋白质的合成。,庆大霉素 Gentamicin,庆大霉素 由紫红小单胞菌 Micromonospora purpurea 产生。抗G+和G-。,(4)万古霉素抗G+和G-。,万古霉素(vancomycin) 由东方链霉菌Streptomycin orientalis 产生。 阻断新生肽聚糖单位的聚合,抑制细菌细胞壁 的合成。,(5)头孢霉素抗G+和G-。 头孢霉素(Cephalosporins) 从真菌顶头孢霉(Cephalosporium acremonium) 中发现。抗菌谱广,一般需注射。,7-氨基头孢霉素烷酸,第一代头孢对G+菌疗效好。,第二代头孢对G+菌疗效好,对很多G-菌疗效也好。,第三代头孢对许多G-菌(如铜绿假单胞菌)具有抗性且不被内酰胺酶所破坏,常能达到中枢神经系统。,(6)广谱抗生素氯霉素,四环素,金霉素,土霉素,氯霉素 Chloramphenicol,氯霉素(Chloramphenicol): 最早由委内瑞拉链霉菌Streptomycin venezuelae生产, 现由化学合成。毒性大,只在不得已时应用。,四环素(Tetracycline): 由链霉菌产生,或由半合成而来。主要是抑菌。高 剂量会产生恶心、腹泻、小儿黄牙,并对肝肾造成 损害。,5、抗真菌的抗生素,(1)与麦角甾醇结合多烯烃(polyene)类抗生素 两性霉素B(Amphotericin B) 制霉菌素(Nystatin) 作用机制:与细胞膜上麦角甾醇结合,破坏 细胞膜的结构,影响细胞膜的透性,使细胞裂解。 疗效与副作用相当。仅用于危及生命的感染。,都由链霉菌产生,(2)抑制麦角甾醇合成吡咯类(azole)抗生素 和丙烯胺(allylamines) 咪唑(imidazole) 酮康唑(Ketoconazole) 作用机制:抑制麦角甾醇的合成,使细胞裂解。 几乎没有严重的副作用,具有广谱的抗真菌效果。 一般用于表面感染。,咪康唑,酮康唑,(3)其他抗真菌药物 灰黄霉素(Griseofulvin): 由青霉菌产生。抑制细胞分裂,抑制蛋白质 和核酸的合成。口服,治疗慢性皮肤真菌感染。,5-氟胞嘧啶: 化学合成。 使RNA失去功能。 是一种有效的抗真菌药物。用于治疗绝大多数系统真菌感染。 副作用:红疹,腹泻,恶心,贫血,肝损伤。,Polyoxins(多氧菌素): 抑制几丁质的合成从而 抑制真菌细胞壁的合成。 在临床上尚未使用。 长春花碱( vinblastine ) 长春花新碱( vincristine ),6、抗生素的活力单位 抗生素的活力单位称为抗生素的效价(titre)。 抗生素效价一般用“单位”表示。 各种抗生素的 1mg 游离碱=1000单位 最低抑制浓度 (minimum inhibitory concentration): 在一定条件下,某化学药剂抑制特定微生物的最低浓 度。是评定某化学药物药效强弱的指标。,最低抑菌浓度(MIC)的测定,抑菌圈,7、半合成抗生素 对天然抗生素的结构进行人为的改造后的抗 生素叫做半合成抗生素。 8、微生物的抗药性 (1)阻止药物进入 改变细胞膜的透性; 改变药物的透性 (2)将进入细胞内的药物破坏或排出细胞 (3)改变药物作用的靶子 (4)形成“救护途径”,小结 第6章 微生物的生长及其控制 第1节 测定生长繁殖的方法 一、测生长量 二、计个体数,第2节 微生物的生长规律 一、微生物的个体生长和同步生长 二、单细胞微生物的典型生长曲线(同步,封闭) 三、微生物的连续培养 四、微生物的高密度培养 自学教材P159-160,第3节 影响微生物生长的主要因素 一、水分对微生物生长的影响 二、温度对微生物生长的影响 三、氧气对微生物生长的影响 1、按照微生物与氧的关系,可将它们分为2大类 2、氧的毒性形式的产生和消除 四、pH值对微生物生长的影响 1、专性嗜酸菌 2、嗜碱微生物 3、缓冲剂,第4节 微生物培养法概论 一、实验室培养法 二、生产实践中培养微生物的装置 第5节 有害微生物的控制 一、几个基本概念 二、物理灭菌因素的代表高温 三、化学杀菌剂、消毒剂和治疗剂,
展开阅读全文