中医药研究常用分子生物学技术ppt课件

中医药研究常用分子生物学技术,米丽华 生物教研室 2272304,教学参考资料,唐炳华、王继峰:医学分子生物学(第一版）,中国中医药出版社,2006年 胡维新:医学分子生物学（第一版）,科学出版社,2007年 T.A.Brown著，魏群等译：基因克隆和DNA分析（第五版），高等教育出版社，2003年 王艳明、周坤福、徐力：分子生物学与中医药研究，上海中医药大学出版社，2000年 Robert F. Weaver ： Molecular Biology（3rd ed ）， McGraw-Hill Press.2005 美J.萨姆布鲁克 D.W.拉塞尔著，黄培堂等译：分子克隆实验指南（第三版），科学出版社，2002年 朱玉贤、李毅、郑晓峰：现代分子生物学（第三版），高等教育出版社，2007年,教学参考资料,卢圣栋：现代分子生物学实验技术，高等教育出版社，1993年 J.D.Watson et al Molecular Biology of the Gene 5th The Benjamin /Cummings Publishing Company,Inc.2003 Lewin, B., GENES . University Press, Oxford. 2004 孙乃恩 孙东旭 朱德煦：分子遗传学（第二版），南京大学出版社，1997年 网址：http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/（参见教材P274表7-3）,第一章 绪论,一、分子生物学的含义 广义上，分子生物学是从分子水平研究生命现象、生命本质、生命活动及其规律的一门生命学科。 狭义上，分子生物学是一门在分子水平上研究基因结构和功能的学科。 分子生物学源自遗传学和生物化学，它以核酸和蛋白质等生物大分子的结构及其在遗传信息和细胞信息传递中的作用为研究对象 。,第一章 绪论,一、什么是分子生物学 分子生物学已广泛渗透到医学科学的各个领域，成为现代医学的理论基础。,二、分子生物学的主要研究内容,（一）分子生物学理论 1、核酸的分子生物学：研究核酸的结构及其功能 。分子遗传学（moleculargenetics）是其主要研究内容包括核酸/基因组的结构， 遗传信息的复制， 转录与翻译， 核酸存储的信息突变与修复， 基因表达调控和基因工程技术的发展和应用等。 遗传信息传递的中心法则（centraldogma）是其理论体系的核心。,二、分子生物学的主要研究内容,（一）分子生物学理论： 1、核酸的分子生物学：研究核酸的结构及其功能 。,2、蛋白质的分子生物学 研究执行各种生命功能的蛋白质的结构与功能 。 3、细胞信号转导的分子生物学：研究细胞内、细胞间信息传递的分子基础。 信号转导机理的研究在理论和技术方面与上述核酸及蛋白质分子有着紧密的联系，是当前分子生物学发展最迅速的领域之一。,二、分子生物学的主要研究内容,（二） 分子生物学技术 1、基本技术 分光光度技术；电泳技术（琼脂糖凝胶电泳，醋酸纤维素薄膜电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳，等电聚焦，噬菌体的限制性内切酶酶切片段）； 放射性同位素技术； 色谱技术（层析法，吸附色谱法，分配色谱法，离子交换色谱法，凝胶色谱法，亲和色谱法，高效液相色谱法）； 细胞培养等,二、分子生物学的主要研究内容,（二） 分子生物学技术 2、核酸操作技术 核酸的提取和纯化； DNA、RNA合成技术； DNA重组技术； 核酸杂交技术； DNA序列测定技术等。 3、实用蛋白技术 蛋白质的提取和纯化 ； 蛋白质测定； 蛋白质印迹技术； 蛋白质质谱分析技术等。,二、分子生物学的主要研究内容,分子生物学中的两项最重要的实验技术,分子生物学的诞生和发展中的瓶颈 基因克隆（DNA重组，基因工程） (Gene clone, DNA recombination, gene engineering) 基因转移载体的发现 vector DNA操作工具酶的发现 DNA manipulation 基因合成和基因测序 sequence PCR技术 ( polymerase chain reaction),（三）分子生物学在医学中的应用 如癌的分子生物学； 免疫分子生物学； 人类基因分析； 基因产物的医学用途； 新药的发现； 基因诊断、治疗； 人类疾病的分子生物学等。,二、分子生物学的主要研究内容,三、分子生物学的发展简史,（一）准备和酝酿阶段 19世纪后期到20世纪50年代初，是现代分子生物学诞生的准备和酝酿阶段。在这一阶段产生了两点对生命本质的认识上的重大突破： 1、确定了蛋白质是生命的主要基础物质 2、确定了生物遗传的物质基础是DNA 1944年O.T.Avery等证明了肺炎球菌转化因子是DNA 1952年A.D.Hershey和M.Cha-se用DNA35S和32P分别标记T2噬菌体的蛋白质和核酸 ,证明遗传物质是DNA。,（二）现代分子生物学的建立和发展阶段,这一阶段是从50年代初到70年代初，以1953年Watson和Crick提出的DNA双螺旋结构模型作为现代分子生物学诞生的里程碑，开创了分子遗传学基本理论建立和发展的黄金时代。 1、中心法则的建立 Watson和Crick就提出DNA复制的可能模型 。 1956年A.Kornbery首先发现DNA聚合酶 。 1958年Meselson及Stahl用同位素标记和超速离心分离实验为DNA半保留模型提出了证明 。 1968年Okazaki（冈畸）提出DNA不连续复制模型 。,（二）现代分子生物学的建立和发展阶段,1972年证实了DNA复制开始需要RNA作为引物 1958年Weiss及Hurwitz等发现依赖于DNA的RNA聚合酶 1961年Hall和Spiege-lman用RNA-DNA杂交证明mRNA与DNA序列互补 60年代Nirenberg、Ochoa以及Khorana等几组科学家的共同努力破译了RNA上编码合成蛋白质的遗传密码 1970年Temin和Baltimore又同时从鸡肉瘤病毒颗粒中发现以RNA为模板合成DNA的反转录酶,2、对蛋白质结构与功能的进一步认识,1956-58年Anfinsen和White根据对酶蛋白的变性和复性实验，提出蛋白质的三维空间结构是由其氨基酸序列来确定的。 1958年Ingram证明正常的血红蛋白与镰刀状细胞溶血症病人的血红蛋白之间，亚基的肽链上仅有一个氨基酸残基的差别 1969年Weber开始应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量 1973年氨基酸序列自动测定仪问世。 中国科学家在1965年人工合成了牛胰岛素 。 在1973年用1.8AX-线衍射分析法测定了牛胰岛素的空间结构，为认识蛋白质的结构做出了重要贡献。,（三）初步认识生命本质并开始改造生命的深入发展阶段,70年代后，以基因工程技术的出现作为新的里程碑，标志着人类深入认识生命本质并能动改造生命的新时期开始。其间的重大成就包括： 1、重组DNA技术的建立和发展 1967-1970年R.Yuan和H.O.Smith等发现的限制性核酸内切酶为基因工程提供了有力的工具； 1972年Berg等将SV-40病毒DNA与噬菌体P22DNA在体外重组成功，转化大肠杆菌，使本来在真核细胞中合成的蛋白质能在细菌中合成,打破了种属界限；,1、重组DNA技术的建立和发展,1977年Boyer等首先将人工合成的生长激素释放抑制因子14肽的基因重组入质粒，成功地在大肠杆菌中合成得到这14肽 1979年美国基因技术公司用人工合成的人胰岛素基因重组转入大肠杆菌中合成人胰岛素。,1、重组DNA技术的建立和发展,我国已有人干扰素、人白介素2、人集落刺激因子、重组人乙型肝炎疫苗、基因工程幼畜腹泻疫苗等多种基因工程药物和疫苗进入生产或临床试用 。 1982年Palmiter等将克隆的生长激素基因导入小鼠受精卵细胞核内，培育得到比原小鼠个体大几倍的“巨鼠” 。 1991年美国向一患先天性免疫缺陷病（遗传性腺苷脱氨酶ADA基因缺陷）的女孩体内导入重组的ADA基因，获得成功。 1994年我国用导入人凝血因子基因的方法成功治疗了乙型血友病的患者。,1、重组DNA技术的建立和发展,这时期基因工程的迅速进步得益于许多分子生物学新技术的不断涌现。 1975-1977年Sanger、Maxam和Gilbert先后发明了三种DNA序列的快速测定法； 1985年Cetus公司Mullis等发明的聚合酶链式反应（PCR）的特定核酸序列扩增技术； 90年代全自动核酸序列测定仪的问世。,2、分子生物学技术的应用和发展,癌基因的发现 基因诊断 基因组文库的建立 基因工程生产人胰岛素 转基因动物 人类基因治疗 基因工程抗体技术的建立和发展 DNA芯片技术（基因芯片、生物芯片）,3、基因组研究的发展,1977年Sanger测定了X174-DNA全部5375个核苷酸的序列； 1978年Fiers等测出SV-40DNA全部5224对碱基序列； 20世纪80年代噬菌体DNA全部48,502碱基对的序列全部测出； 1996年底许多科学家共同努力测出了大肠杆菌基因组DNA的全序列长4x106碱基对。 19902003年人类基因组计划（HumanGenomeProject）实施并基本完成 。,4、基因表达调控机理,1961年，Jacob，F.和Monod，J.提出了操纵子模型，打开了人类认识基因表达调控的窗口。 20世纪70年代以后才逐渐认识了真核基因组结构和调控的复杂性。 1977年最先发现猴SV40病毒和腺病毒中编码蛋白质的基因序列是不连续的 ，揭开了认识真核基因组结构和调控的序幕。 1981年Cech等发现四膜虫rRNA的自我剪接，从而发现核酶（ribozyme）。 20世纪80-90年代，使人们逐步认识到真核基因的顺式调控元件与反式转录因子、核酸与蛋白质间的分子识别与相互作用是基因表达调控根本所在。,5、细胞信号转导机理研究的深入,1957Sutheland年发现cAMP、1965年提出第二信使学说，是人们认识受体介导的细胞信号转导的第一个里程碑。 1977年Ross等用重组实验证实G蛋白的存在和功能，深化了对G蛋白偶联信号转导途径的认识。 20世纪70年代中期以后，癌基因和抑癌基因的发现、蛋白酪氨酸激酶的发现及其结构与功能的深入研究、各种受体蛋白基因的克隆和结构功能的探索等，使近10年来细胞信号转导的研究更有了长足的进步。 目前，对于某些细胞中的一些信号转导途径已经有了初步的认识 。,6、小分子RNA研究进展,1993年，Lee RC等发现线虫（C.elegans）lin-4基因编码的长度为2261b的小分子RNA关闭线虫不同发育阶段mRNA转录的作用 ，这是继核酶以后，内源性RNA参与基因调节的又一证据。 小分子RNA(miRNA或siRNA）具有调控基因表达的功能。 miRNA可以通过部分互补结合到目的mRNA的3非翻译区，抑制蛋白质合成。这种结合并不诱导目的mRNA的降解。siRNA能诱导细胞内基因沉默，与长双链RNA有同源序列的mRNA被降解，从而抑制基因的表达。,二十一世纪生物学的新热点及领域,结构生物学（Structural Biology） 生物大分子的高级三维结构与功能的统一 生物大分子之间的互作 基因的社会学 分子发育生物学（Molecular Developing Biology） 基因表达，基因互作,21世纪生命科学发展的重要态势,对生命现象的认识从单基因水平向全基因组整体水平发展 现代生命科学研究的理论与技术从较长期的积累走向应用,四、分子生物学与其他医学基础学科的关系,生物化学与分子生物学关系最为密切。两者同在我国教委和科委颁布的一个二级学科中，称为“生物化学与分子生物学” 。 生物化学主要从化学角度研究生命现象，它着重研究生物体内各种分子的结构、转化和新陈代谢。传统生物化学的主要内容是各种物质代谢。 分子生物学则着重阐明核酸和蛋白质的结构与功能的关系、细胞内信号转导途径和基因表达调控的机制。 细胞生物学与分子生物学关系也十分密切。 遗传学与分子生物学关系密切。 由于分子生物学涉及认识生命的本质，它也就自然广泛的渗透到医学各学科领域中，成为现代医学重要的基础。 生理学、微生物学、免疫学、病理学、药理学以及临床各学科，分子生物学都正在广泛地形成交叉与渗透。,五、分子生物学技术在中医药研究中的应用,（一）在中医基础理论研究中的应用 1、证本质的研究 近年来运用分子生物学技术对肾的实质、活血化瘀理论及中药抗衰老机理进行研究 例沈自尹等采用RT-PCR法进行了“补肾健脾活血三类复方对下丘脑-垂体-肾上腺-胸腺轴及促肾上腺激素释放因子（CRF）基因表达的影响”的研究，其目的是从分子水平来阐述药物对肾阳虚证的主要调节点。 例陈可冀等应用斑点印迹杂交、原位杂交、和3H-TdR掺入细胞DNA等技术，证明活血化瘀类中药都可抑制血管壁血小板衍化生长因子（PDGF）基因及血管壁原癌基因c-myc mRNA的表达水平，从而抑制动脉平滑肌细胞增生，阻止动脉粥样硬化。 研究表明，活血化瘀类中药干预基因调控、抑制原癌基因表达。 例沈小珩采用分子生物学技术对二仙汤及其拆方影响老年大鼠肝组织超氧化物岐化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性及其基因表达水平的观察发现，老年大鼠氧化脂质（LPO）含量明显提高，超氧化物岐化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性降低，而且与这类编码这类酶的基因表达水平密切相关，用二仙汤及其拆方治疗后，大鼠氧化脂质（LPO）含量明显降低，提高了超氧化物岐化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的活性。,五、分子生物学技术在中医药研究中的应用,（一）在中医基础理论研究中的应用 2、治则治法的研究 科研人员用抑癌扶正行气活血法治疗经二乙基亚硝胺诱导的肝癌大鼠，采用DD-PCR（差异显示技术）和Northern bolt对治疗后大鼠肝组织进行检测，发现肝癌组织若干癌基因转录水平降低。（见P8）,五、分子生物学技术在中医药研究中的应用,（二）在中医临床上的应用 吴志奎等进行了“补肾生血方对-地中海贫血基因水平的影响”的研究，结果发现，补肾生血药能明显提高-地中海贫血患者血红蛋白（Hb）和抗碱血红蛋白（HbF），提高血红蛋白的珠蛋白链比。起作用机制可能是补肾生血药能提高珠蛋白链/+比值，促进-珠蛋白基因的表达，诱导HbF合成，从而代偿了-珠蛋白基因功能缺陷。,五、分子生物学技术在中医药研究中的应用,（三）在针灸研究中的应用 1、针刺镇痛与C-fos、C-jun、CC-k基因的研究 2、耳针与表皮生长因子RACTH的研究 3、电针抗痫与CCK基因表达的研究 4、电针与抗脑缺血与C-fos原癌基因表达的研究 5、针刺抑制老年大鼠与垂体细胞因子基因表达 6、电针对细胞凋亡的影响 7、针刺对脊髓背角内生长期相关蛋白GAP43表达的影响 8、针刺对雌性大鼠垂体雌激素受体mRNA表达和血雌二醇（E2）水平影响的研究 9、“醒脑开窍”针法对实验性脑梗死大鼠脑细胞核糖核酸的影响,（四）在中药研究中的应用 1、鉴定中药材及药用植物资源保护 常用DNA分子标记法，其是指以DNA多态性为基础的遗传标记。 DNA分子遗传标记常用的方法是RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA随机引物扩增多态DNA)是1990年由Williams等发展起来的。 分子标记主要应用： 遗传育种 生药鉴定和药材道地性,五、分子生物学技术在中医药研究中的应用,2、获取有效成分,一是有关代谢途径基因工程的研究。 二是有关转基因动、植物反应器构建的研究。 3、在中药质量评价中的应用 聚合酶链反应（Polymerase chainreaction，PCR） 是1985年由美国PE-Cetus公司的人类遗传研究室Mullis等人发明，具有划时代的意义的。 PCR技术能以其准确、无误、迅速、简捷和毫无置疑的检测结果，证明药材的真伪，从而能够从根本上彻底解决中药材的造假问题。,4、新药开发 中药治疗癌症主要以扶正为主，提高机体本身的防御能力，我国二类抗癌新药还有攻击癌细胞的作用。如“威麦宁胶囊”以野生植物为原料，他对癌细胞RNA逆转录酶有抑制作用。 5、中药药理研究 唐利龙等研究川穹嗪对原代培养血管平滑肌细胞胶原基因表达的影响，发现川穹嗪通过抑制前胶原链的（）、（）的基因转录，而抑制平滑肌细胞的生长分裂。 姜传仓等利用RNA斑点印迹和Northern印迹法等技术，研究丹参、大黄对实验性高脂血症大鼠肝细胞LDL受体mRNA水平影响，发现两药能促进LDL受体mRNA水平升高，具有量效依赖关系。,复习思考题：,、你对现代分子生物学的含义和包括的研究范围是怎么理解的？ 、你对分子生物学的现况和今后的发展有何看法？ 、分子生物学和医学有什么联系？ 4、你对分子生物学与中医药研究有何看法？未来分子生物学技术对中医药研究有何影响?,