脓汁和粪便标本中病原菌的检测-1

张三李四 020-62-789123 0757-299-85246 南方医科大学公卫学院微生物学系,医学微生物学实验 Medical Microbiology Practicum,微生物学实验室规则Lab Safety Regulation,进入实验室必须穿白大衣，戴帽子。 书本、文具放在抽屉里。 实验室内不准吃东西、喝饮料，不准把任何东西放入嘴中，也不要用手抚摸头脸等部位。 凡是废弃的细菌培养物、带菌材料，应放在指定地点等待灭菌处理，不得随便乱放或用水冲洗。 一旦发生意外，造成污染，应立即报告老师进行处理。 离开实验室前,必须洗手。怀疑污染应及时用1新洁而灭泡手。 每次实验后，实验台用消毒液擦拭，地板先用湿的拖布拖地以后再扫地，实验室用紫外线灯照射1小时。,实验分组（45人）,俩俩相对4人为一个小组,组号编在电源插座上。 每组按从前到后,从左到右的顺序，分别编号为甲乙丙丁。,甲 乙 4 丙 丁,甲 乙 3 丙 丁,甲 乙 2 丙 丁,甲 乙 1 丙 丁,甲 乙 5 丙 丁,甲 乙 8 丙 丁,甲 乙 7 丙 丁,甲 乙 6 丙 丁,甲 乙 10 丙 丁,甲 乙 9 丙 丁,讲 台,左,右,11 甲 乙 丙 丁 戊,实验分组（40人）,俩俩相对4人为一个小组,组号编在电源插座上。 每组按从前到后,从左到右的顺序，分别编号为甲、乙、丙、丁。,甲 乙 4 丙 丁,甲 乙 3 丙 丁,甲 乙 2 丙 丁,甲 乙 1 丙 丁,甲 乙 5 丙 丁,甲 乙 8 丙 丁,甲 乙 7 丙 丁,甲 乙 6 丙 丁,甲 乙 10 丙 丁,甲 乙 9 丙 丁,讲 台,左,右,实验分组（36人）,俩俩相对4人为一个小组,组号编在电源插座上。 每组按从前到后,从左到右的顺序，分别编号为甲、乙、丙、丁。,甲 乙 4 丙 丁,甲 乙 3 丙 丁,甲 乙 2 丙 丁,甲 乙 1 丙 丁,5,甲 乙 8 丙 丁,甲 乙 7 丙 丁,甲 乙 6 丙 丁,甲 乙 10 丙 丁,甲 乙 9 丙 丁,讲 台,左,右,实验室器材介绍,常用器材摆放顺序：电源插座试管架酒精灯污物盘。 试管架上器材：靠近插座一侧第1列放置接种针,第2列放置 接种环，另一侧中间两行放置油性笔和打火机。,器材使用后，必须放回原处，依次摆整齐。,普通冰箱(3颗星*) 冷藏室(上柜）： 温度48，保存细菌培养物，培养基，常用菌种和抗菌素纸片等。 冷冻室（下柜）： 温度18，保存诊断血清、血浆，长期保藏的抗菌素纸片。,卫生工具： 扫帚,拖布,撮箕,垃圾筐,放在冰箱和水池之间。,隔水式电热恒温培养箱：3537， 一般细菌培养时间为1824小时。,奥林巴斯 CX21型 生物显微镜 （实验柜内，每人一台）,注意：只能横放，不得竖放。,革兰染色瓶,染色架,石蜡油,拭镜纸,吸水纸,乙醇乙醚,微生物学器材柜-1（西侧边台中段）,电炉右侧柜内,微生物学器材柜-2（东侧边台中段）,酒精棉球,碘酒棉球,镊子,电炉、石棉网,手套,1500W电炉安全警告 1.电源插塞与电炉插孔接触良好插头插入插座。 2.如果培养基暴沸溢出，流入电炉；必须立即切断电源、拔除插头；以免触电，危及生命！,东西两侧边台各一个电炉，每个电炉 可同时放置4个300ml锥形瓶进行加热。,蒸馏水：配制培养基。 1新洁而灭：怀疑病原菌污染，泡手35分钟。 消毒液：擦拭实验台台面。 玻片缸：浸泡用过的载玻片。,医学微生物学实验综合性实验一Comprehensive Experiment 1,脓汁和粪便标本中病原菌的检测（P2） Isolation and detection of pathogenic bacteria in pus and stool specimens 培养基的制备P2 消毒与灭菌P5 细菌的人工培养 无菌技术（录像） 摆斜面，倾注平板。,脓汁、痰、咽部分泌物,观察菌落特征、溶血性、色素,肉汤增菌培养,挑取可疑菌落,涂片染色镜检,血平板培养,直接涂片、革兰染色、镜检,血液、穿刺液,纯培养,培养液涂片染色境检,染色镜检 生化反应 血清学鉴定,双糖铁培养基,增菌培养,血、骨髓,挑取可疑菌落,SS琼脂、伊红美蓝平板分离培养,粪便,常见肠道致病菌的检查程序P48：,常见病原性球菌的检查程序P47：,生化反应 动物实验 药敏实验,脓汁和粪便标本中病原菌的检测实验流程(6次课12学时）,培养基的制备,细菌的分离培养,细菌的纯培养,细菌的形态学检查,细菌的生化试验等,细菌的血清学试验、结果分析实验论文撰写,培养基的制备 Preparation of Culture Media,公共培基，勿作标记！,培养基的制备 Preparation of Culture Media,公共培基，勿作标记！,培养基的制备 Preparation of Culture Media,公共培基，勿作标记！,培养基的制备 Preparation of Culture Media,公共培基，勿作标记！,培养基隔石棉网煮沸，使完全溶解。营养肉汤煮沸1次，含琼脂的培养基煮沸3次(煮至刚刚冒泡,立即放置台面，半分钟后再煮)。,加热时,常摇动。 沸腾时，不能摇动！,用洗耳球和刻度吸管分装培养基。 棉塞1/2塞入试管口内，松紧合适。,培养基趁热分装,培养基装筐待灭菌,放置试管筐内，罩上硫酸纸牛皮纸，用橡皮筋扎好。,各组边台柜子内器材,量筒,锥形瓶,砝码,干粉培养基,试管筐,天平,各组边台抽屉内器材,试管,刻度吸管,洗耳球,称量皿2个,药勺,厘米尺,硫酸纸、牛皮纸、橡皮筋,称量皿置于左、右盘，游码移至标尺左端“0”点位置上，指针应对准中线，取得平衡。否则将杠杆两端的调整螺母旋动调节平衡。,秤物时“左物右码”，砝码置右盘，物品置左盘，尽可能放在秤盘中心。天平保持干燥、清洁。用过的药勺、称量皿清洗干净。,称量皿置于左盘，游码移至标尺左端“0”点位置上，指针应对准中线，取得平衡。否则将杠杆两端的调整螺母旋动调节平衡。,秤物时“左物右码”，砝码置右盘，物品置左盘，尽可能放在秤盘中心。天平保持干燥、清洁。用过的药勺、称量皿清洗干净。,培养基配制器材,内盖盖好 外盖扭紧,培养基制备程序,干粉培养基蒸馏水加热溶化分装集中放在试管筐里 罩上硫酸纸、牛皮纸 用橡皮筋扎好 放入讲台边的灭菌桶或灭菌筐内送到高压蒸汽灭菌室（洗刷室）灭菌。 请在 30分钟内完成。,培养基的制备 Preparation of Culture Media,公共培基，勿作标记！,Preparation of Culture media,Group formation: Four students each form one group Total of 10 groups (10 4= 40) Each group will prepare the media according to the instruction given in next slide.,Preparation of Culture Media,Melt agar into solution in the microwave or electric stove,玻璃器材的洗刷,无污染器皿:洗涤剂洗刷流水冲洗10次晾干。 病原菌污染的器材高压蒸汽灭菌趁热倒出污物洗涤剂浸泡瓶子、试管、吸管用毛刷，平皿用纱布，洗刷干净流水冲洗10次晾干。,瓶刷,试管刷,吸管刷,去污粉,纱布,收拾器材，放回边台柜内，依次摆整齐!,量筒,锥形瓶,砝码,干粉培养基,试管筐,天平,量筒罩纸套，扎皮筋 。 锥形瓶洗干净，塞棉塞，罩纸套，扎皮筋 。 干粉培养基内外盖子，必须盖好扭紧！,收拾器材，放回抽屉内，依次摆整齐!,试管,刻度吸管,洗耳球,称量皿,药勺,厘米尺,硫酸纸、牛皮纸、橡皮筋,药勺、称量皿、刻度吸管洗刷干净，甩去水滴，放回边台抽屉内。,细菌培养基 Culture Media,用人工的方法，将多种营养物质，根据各种微生物生长繁殖的需要而合成的一种营养制品。它的主要成分是蛋白胨、牛肉膏、氯化钠和水，pH7.47.6。 培养基制备的一般程序： 调配溶化 矫正pH 分装灭菌检定保存。 干粉培养基蒸馏水加热溶化分装灭菌检定 保存。 培养基的制备原则： (1)适当的营养成分,(2)合适的酸碱度,(3)配制后必须灭菌。,培养基的种类（按物理性状分类） 液体培养基:不含凝固剂(琼脂),用于增菌，纯培养,保种。 固体培养基:含12琼脂，用于分离培养,纯培养,保种。 半固体培基（琼脂高层）:含0.30.5琼脂，用于动力检测,保种。,营养肉汤 broth tube 琼脂斜面 agar slant 琼脂高层 agar deep,Different forms of culture media.,培养基的种类（按用途分类）P3 基础培养基:含一般细菌生长繁殖所需的基本营养成分，可作为一些特殊培养基的基础成分，如普通平板。 营养培养基：在基础培养基中加入血液、生长因子等特殊成分，供营养要求较高的细菌和须要特殊生长因子的细菌生长，如血平板。 增菌培养基：促进目的菌的生长，适用于含菌量较少的标本，如葡萄糖肉汤。 选择培养基：在培养基中加入抑制剂抑制杂菌生长，有助于目的菌的生长，如EMB、SS平板。 鉴别培养基：利用细菌分解能力及代谢产物的不同，在培养基中加入特定的作用底物和指示剂，用来试验细菌的生化反应、代谢产物，如糖发酵管。 厌氧培养基：氧化还原电势低，表面用凡士林和石蜡封住，与空气隔绝，成为无氧环境，如庖肉培养基。,培养基的灭菌,在冷空气完全排尽的情况下，蒸汽压103.43 kPa ,温度可达到121.3 ,维持1530分钟，可以杀灭包括细菌芽胞在内的所有微生物。 基础培养基：121高压蒸汽灭菌1530分钟。 含糖培养基：115灭菌15分钟。 鸡蛋、牛奶培养基:7510030分钟，3次(1天1次)。 不耐高温的液体成分：滤菌器滤过除菌 EK型蔡氏滤器、 G5或G6玻璃滤器、0.45um或0.22um微孔滤膜。,琼脂平板 agar plate,含琼脂的培养基灭菌以后，冷却5060（温度越高，冷凝水越多，越易污染 ），以无菌操作，倾注平皿10ml（直径7厘米平皿），琼脂凝固后形成琼脂平板。 平板主要用于细菌的分离培养和药敏试验。,平板储存待用或做细菌培养时，为什么要倒置？ 防止平板水分蒸发丢失。 防止冷凝水滴于平板表面，影响单菌落形成。 ,琼脂斜面 agar slant,含琼脂的培养基灭菌以后，趁热斜放，培基不超过试管长度的2/3，琼脂凝固以后形成一个倾斜的表面。 斜面主要用于纯菌移种和菌种保存。 斜面底部的冷凝水有利于纯菌移种、菌苔形成和菌种保藏。,怎样检查培养基是否合格?,无菌试验：将待检培养基置于3537培养箱培养24小时，无任何细菌生长为合格。 效果试验：将已知的标准参考菌株，接种于待检培养基中，检查细菌的生长繁殖状况和生化反应是否与预期的结果相符合。,细菌生长繁殖的方式和速度,细菌繁殖方式：以二分裂方式进行无性繁殖。 繁殖速度：多数2030分钟繁殖1代，结核杆菌1820小时繁殖一代。 细菌生长繁殖曲线,细菌的生长曲线,细菌数量的对数,培养时间 （小时）,5 10 15 20 25 30,活菌数,总菌数,迟缓期,对数生长期,稳定期,衰退期,细菌生长曲线意义,迟缓期：一般14h，细菌代谢活跃，但不繁殖。 对数期：维持48h，细菌快速繁殖，数目呈几何级数增加，细菌形态、染色性、生理活性最典型、对抗菌素最敏感。细菌鉴定选用此期为佳。 稳定期： 通常维持10h，活菌数和死菌数几乎相等，代谢产物形成较多。 衰亡期：培养18 24 h以后，代谢逐渐停滞,死菌数超过活菌数。,玻璃器材的洗刷,无污染器皿:洗涤剂洗刷流水冲洗10次晾干。 病原菌污染的器材高压蒸汽灭菌趁热倒出污物洗涤剂浸泡瓶子、试管、吸管用毛刷，平皿用纱布，洗刷干净流水冲洗10次晾干。,瓶刷,试管刷,吸管刷,去污粉,纱布,试管用毛刷，上下、旋转刷洗内壁和管底。,字迹用湿纱布，粘去污粉擦拭。,管口朝向相同，流水冲洗10次。,洗干净的试管，倒扣在筐内，晾干。,平皿用纱布，旋转擦拭内外侧，字迹用纱布粘去污粉擦拭。,流水冲洗10次。逐个倒扣在筐内，晾干。,玻璃器材洗干净的标准,1.洗涤时观察:洗后的玻璃器材附着在内壁上的水不是个别水珠,而是一层极薄的水膜。 2.干燥后观察:对着光亮处观看玻璃器材,非常透明, 内外壁上不出现大片发白或白点,也无微小污点和粉末。,收拾器材，放回边台柜内，依次摆整齐!,量筒,锥形瓶,砝码,干粉培养基,试管筐,天平,量筒罩纸套，扎皮筋 。 锥形瓶洗干净，塞棉塞，罩纸套，扎皮筋 。 干粉培养基内外盖子，必须盖好扭紧！,收拾器材，放回抽屉内，依次摆整齐!,试管,刻度吸管,洗耳球,称量皿,药勺,厘米尺,硫酸纸、牛皮纸、橡皮筋,药勺、称量皿、刻度吸管洗刷干净，甩去水滴，放回边台抽屉内。,常用器材摆放顺序：电源插座试管架酒精灯污物盘。 试管架上器材：靠近插座一侧第1和第2列分别放置接种针 和接种环，另一侧中间两行放置油性笔和打火机。,器材使用后，必须放回原处，依次摆整齐。,实验器材 整齐有序,医学微生物学实验综合性实验一,脓汁和粪便标本中病原菌的检测（一） 培养基的制备P2 消毒与灭菌P5 细菌的人工培养 无菌技术（录像） 摆斜面，倾注平板。,思考题,人工培养细菌需要提供的条件是什么? 培养基制备的原则是什么? 怎样检查培养基是否合格? 培养基按物理形状分哪几种?各有何用途? 高压蒸汽灭菌法的杀菌机理是什么?,固体培养基的制备（课外完成）,平板（40人份）：倾注营养琼脂平板505个、伊红美蓝平板20+2个。以无菌操作，倾注平皿10ml，琼脂完全凝固以后（温度降至室温,约30分钟），平板倒放，4冰箱保存备用。 斜面：培养基趁热斜放，培基不超过试管长度的2/3，琼脂凝固以后，4冰箱保存备用。,