细胞免疫染色及畸胎瘤切片的制作流程.ppt

多能干细胞免疫染色及畸胎瘤石蜡切片的制作流程,成璐 复旦大学 生物医学研究院,第一部分 多能干细胞免疫染色过程,铺细胞 细胞的固定 细胞的荧光染色 观察荧光染色并拍照,提纲,铺细胞,ES细胞或iPS细胞的密度要求,无滋养层细胞较好,传代后至克隆形态良好，密度适中。 通常传至24孔板中。,因为用Hochest染核对照也会将滋养层细胞的核同时染上，影响克隆定位。,Oct4/DAPI,铺细胞 细胞的固定 细胞的荧光染色 观察荧光染色并拍照,提纲,材料,细胞的固定,流程,把细胞固定在4PFA中，室温放置30min,4多聚甲醛（4PFA, Paraformaldehyde）,固定细胞之前，将培养基吸弃，用PBS涮2次,0.1M的PBS配制（PH7.4），100mL PBS加4克多聚甲醛。 由于多聚甲醛难溶于水，需用磁力搅拌器加热搅拌，温度控制在60以下。,铺细胞 细胞的固定 细胞的荧光染色 观察荧光染色并拍照,提纲,细胞的荧光染色,材料,流程,阳性染色对照：染色呈阴性时，证实染色的有效性 阴性染色对照：染色呈阳性时，证实染色的特异性 一抗、二抗、Hoechst（DAPI）：分别发挥如下作用：识别特异抗原、特异一抗及细胞核 抗体稀释液：稀释抗体 封闭液：封闭非特异性反应,洗涤细胞,透膜（仅限染核抗体）,一抗孵育,二抗孵育,染核定位（Hochest）,细胞的荧光染色,材料,阳性染色对照：以多能干细胞标记物染色为例，阳性染色对照细胞是确定表达相应抗体的细胞，如ES细胞或经过验证的iPS细胞 阴性染色对照：是确定不表达相应抗体的细胞，如成纤维细胞等。 一抗：要确保所购买的一抗识别所染细胞的物种；要做预实验以确定最适的抗体浓度 二抗：要根据所染细胞自身所带的荧光类型决定相应的二抗的荧光类型，二者应不同。 Hoechst：英文名称：bisBenzimide（Sigma B1155）；以PBS配制成1mg/ml 的母液，分装后于-20保存；常用的可置于4 ，染色时以1XPBS 1000倍稀释。 抗体稀释液：0.2%BSA和0.1%TritonX100溶于1XPBS； 4 保存；尽量现用现配，因含蛋白成分，容易变质，长菌。 封闭液：含1%BSA+4% normal serum+0.4%TritonX100的1XPBS溶液；4 保存；尽量现用现配，因含蛋白成分，容易变质，长菌。,细胞的荧光染色,流程,所有洗涤，浸泡步骤都在摇床上进行。目的是为了洗涤，浸泡充分均匀。 “洗涤”指将平板置于摇床上摇洗35分钟,把细胞固定在4PFA中，室温放置30min,1X PBS 洗涤2次,抗体稀释液洗涤两次,无水乙醇中浸泡两次，每次20min（或3次，10min/次） (此步仅限于核蛋白染色，如Oct4，Nanog或Rex1等，不能用于膜蛋白),1X PBS洗涤1次,封闭液封闭细胞，室温，1h,将一抗稀释在抗体稀释液中，加到样品上，室温2h或4 放置过夜 (以24孔板为例，一抗的体积：200ul/孔),细胞的荧光染色,流程,吸弃一抗，用PBT（0.1%TritonX100 in PBS）洗涤细胞35次,将二抗稀释在抗体稀释液中，并加到样品孔里，室温放置1h; (以24孔板为例，二抗的体积：200ul/孔),注意：从以下步骤开始，样品要注意避光！,用PBT洗涤3次，约5min/次,用PBS洗涤两次，5min/次,再用4PFA室温固定30min,最后再用PBS洗涤两次，每次5min,Hoechst染核, 室温放置5min,铺细胞 细胞的固定 细胞的荧光染色 观察荧光染色并拍照,提纲,观察荧光染色并拍照,iPS细胞染色实例,多能干细胞标记物的常用抗体： 膜抗体：SSEA-1、 SSEA-3、 SSEA-4 胞浆抗体：Tra-1-60、 Tra-1-81 核抗体：Oct4、Nanog、Rex1,h,阳性对照,阴性对照,Rat-iPSCs,观察荧光染色并拍照,iPS细胞染色实例,阳性对照,阴性对照,h,hESCs,Tra-1-60,观察荧光染色并拍照,iPS细胞染色实例,Pig-iPSCs,观察荧光染色并拍照,iPS细胞染色实例,Human-iPSCs EB 分化染色,Sox17,AFP,Nestin,-actin,SMA,Tuj1,内胚层,中胚层,外胚层,第二部分 畸胎瘤石蜡切片的制备,畸胎瘤的获得 畸胎瘤石蜡切片的制备 畸胎瘤石蜡切片的HE染色 畸胎瘤石蜡切片各胚层组织的辨别,提纲,畸胎瘤的获得,ES细胞或iPS细胞的收集,细胞数量：一个T75长到80-90%满时，细胞数大约为1000万个，可以打两个点，即每个点约300-500万个细胞； 细胞处理： 小鼠及大鼠iPS细胞：将细胞消化成单细胞；1200rpm离心5min后弃上清；以小于400ul的10%DMEM重悬； 人iPS细胞：将消化下来的细胞吹打成较小块；静置至细胞团块沉底，并弃上清；以小于400ul的hES培基重悬； 收集细胞到1ml注射器内并注射。,畸胎瘤的获得,ES细胞或iPS细胞的注射,材料：多重免疫缺陷小鼠（ NODSCID小鼠） 注射部位：后腿内侧肌肉注射,畸胎瘤的生长和摘取,畸胎瘤的获得,通常注射30-40天之后，畸胎瘤就长成直径大概1-2cm左右的球体 当畸胎瘤长到一定体积时，手术摘除畸胎瘤 通常畸胎瘤都是实质性的，也有个别呈空泡状。,约1-2cm,畸胎瘤的获得 畸胎瘤石蜡切片的制备 畸胎瘤石蜡切片的HE染色 畸胎瘤石蜡切片各胚层组织的辨别,提纲,流程,固定,畸胎瘤石蜡切片的制备,包埋,切片,材料,4%PFA：固定畸胎瘤组织用 石蜡（熔点约50-60度）：包埋组织 石蜡包埋机（非必须）：包埋组织，还需要包埋盒、包埋底 石蜡切片机（必须）：切半薄“Semi-thick”石蜡切片 染色缸、染色架、载玻片、盖玻片 溶液： 载玻片：防脱片；也可以自制“蛋白胶”涂在切片上晾干,乙醇（EtOH）、二甲苯（Xylene）、氯仿（Chloroform） HE染色液（H：Hematoxyline苏木精、E：Eosin 伊红） 封片树脂,染色架,染色缸,捞片、展片,染色,流程,固定,畸胎瘤石蜡切片的制备,在4%PFA中固定，4 （浸泡）过夜 换成新鲜的 4%PFA ，再次4浸泡过夜 （过长时间浸在固定液中会降低样品的抗原性，影响后续的免疫染色）,4固定是为了更好的保持标本的抗原性，室温也可以,流程,固定,畸胎瘤石蜡切片的制备,包埋之脱水、透明,70 EtOH 1h 80 EtOH 1h 90 EtOH 1h 95 EtOH 1h 100EtOH 1h Fresh 100EtOH 1h Fresh 100EtOH overnight,氯仿 1h 新鲜氯仿 1h 新鲜氯仿 overnight,脱水,透明,流程,畸胎瘤石蜡切片的制备,包埋,石蜡包埋盒,经透明处理的样品,固定,包埋之包埋,流程,固定,畸胎瘤石蜡切片的制备,包埋 之 包埋,如果没有石蜡包埋机，可以用60 烘箱代替； 利用酒精灯加热镊子可代替高温镊子； 将样品快速放到石蜡包埋底内，盖上包埋盒的底座，直至石蜡全部凝结； 修整蜡块形状、备用。,溶解蜡存放槽,出蜡口,冷冻台,高温镊子,石蜡包埋盒和包埋底存放槽,各种规格的石蜡包埋底,用单面刀片修整蜡块，并达到以下要求： （1）蜡块呈正方形或长方形，蜡块各面要平直，样品位于蜡块正中央； （2）样品边缘与蜡块边缘的距离约3mm。,流程,固定,畸胎瘤石蜡切片的制备,包埋 之 修整蜡块,样品与蜡块边缘有一定距离，以便切片能够连成蜡带,平行,流程,固定,畸胎瘤石蜡切片的制备,包埋,切片,蜡块固定座,刀片,切片厚度微调旋钮,手动切片转轮,切片厚度：5微米,蜡带,毛笔,固定,包埋,切片,捞片、展片,流程,畸胎瘤石蜡切片的制备,37蒸馏水,载玻片置于37-42 的烘片台（平面）上,样品切片,切片借助水的表面张力展开至平整,吸除多余水分，37 烤片过夜,备用,做好样品ID的标记,流程,畸胎瘤石蜡切片的制备,烤片机 37 烤片过夜，防止脱片,展片温水槽 温度设定：37-42左右,固定,包埋,切片,捞片、展片、烤片,畸胎瘤的获得 畸胎瘤石蜡切片的制备 畸胎瘤石蜡切片的HE染色 畸胎瘤石蜡切片各胚层组织的辨别,提纲,流程 脱蜡亲水,畸胎瘤石蜡切片的HE染色,100% EtOH浸泡2次 10min/次,95% EtOH 5min 90% EtOH 5min 80% EtOH 5min 70% EtOH 5min,蒸馏水浸洗3次， 5min/次,脱蜡,亲水,（非一次性使用，可反复多次使用）,二甲苯浸泡4次 5min/次,流程 染色,畸胎瘤石蜡切片的HE染色,在盐酸酒精溶液内浸一下至变成接近红色，此步骤称为“盐酸分化” (1%盐酸酒精溶液：指染色缸中70酒精中含1%盐酸),将切片 在自来水龙头下流水冲洗15-20分钟，至切片呈理想的紫蓝色，此步骤称“蓝化” （颜色的适宜度取决于染色者的经验）,蒸馏水中涮洗一下,切片在Eosin溶液中染5min,自来水涮洗至水接近无色,蒸馏水涮洗一下,切片在 Hematoxylin 溶液中浸泡 10min,自来水中涮洗2、3次至水接近无色,蒸馏水中涮洗1次,流程 脱水封片,畸胎瘤石蜡切片的HE染色,100% EtOH浸泡2次 10min/次,脱水,二甲苯浸泡4次 5min/次,透明,（非一次性使用，可反复多次使用）,70% EtOH short time 80% EtOH short time 90% EtOH short time,树脂封片，显微镜下观察,(以上几步一方面是为了脱水，另一方面是为了脱去多余的Eosin颜色，所以，要注意观察切片颜色的变化。70和80的酒精只要稍稍浸一下即可，90的酒精是调整颜色的关键步骤，在这一步要依靠染色者根据切片颜色自觉调整时间。新鲜的无水酒精没有脱色作用),流程,畸胎瘤石蜡切片的制备,在样品中央滴一滴封片树脂,固定,包埋,切片,捞片、展片,封片,封片树脂,避免气泡,通风橱内操作为宜！,末端蘸有少量二甲苯的盖玻片,畸胎瘤的获得 畸胎瘤石蜡切片的制备 畸胎瘤石蜡切片的HE染色 畸胎瘤石蜡切片各胚层组织的辨别,提纲,畸胎瘤石蜡切片各胚层组织的辨别,分化良好的畸胎瘤,畸胎瘤石蜡切片各胚层组织的辨别,外胚层,神经上皮,色素上皮,角质上皮,畸胎瘤石蜡切片各胚层组织的辨别,中胚层,脂肪组织,肌肉组织,软骨组织,骨组织,畸胎瘤石蜡切片各胚层组织的辨别,内胚层,呼吸上皮,腺体组织,原始肾脏组织,Thank you!,