实验二聚乙二醇(PEG)介导的细胞融合.ppt

实验二：聚乙二醇（PEG）介导的细胞融合,【课前预习】 1介导细胞融合的方法有哪些？ 2细胞融合技术有哪些方面的应用？,【目的要求】 掌握细胞融合原理以及应用PEG诱导细胞融合的方法。,【基本原理】 两个以上的细胞合并成为一个双核或多核细胞称为融合细胞。在通常情况下，两个细胞接触并不发生融合现象，因为各自存在完整的细胞膜，在特殊融合诱导物的作用下，两个细胞膜发生一定的变化，就可促进两个或多个细胞聚集，相接触的细胞膜之间融合，继之细胞质融合，形成一个大的融合细胞。 细胞融合(Cell fusion)，即在自然条件下或用人工方法(生物的、物理的、化学的)使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的过程。人工诱导的细胞融合不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合，因此细胞融合技术目前被广泛应用于细胞生物学和医学研究的各个领域，如研究核质关系、绘制染色体基因图谱、制备单克隆抗体、育种等。 细胞融合的诱导物种类很多常用的主要有灭活的仙台病毒(Sendai virus)，聚乙二醇（Polyethyleneglycol，PEG）和电脉冲。目前应用最广泛的是聚乙二醇，因为它易得、简便，且融合效果稳定。聚乙二醇(PEG)结构为：HOH2C(CH2OCH2)nCH2OH，相对分子质量在200-6000均可用作细胞融合剂。普遍认为聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而使细胞发生融合。,【实验用品】 1材料 鸡红细胞 2器材和仪器：显微镜、离心机、水浴箱、刻度离心管、试管、载玻璃片、盖玻片 3试剂 Alsver液(pH7.4)、0.85生理盐水、GKN液、50PEG（MW 4000）,【方法步骤】 1采血及鸡红细胞悬液的制备（同教材57页）。 2（共2组）取鸡红细胞悬液1mL，移人10mL离心管， 加入4mL 0.85生理盐水混匀。1000rmin离心5 min。 3弃上清液(用吸管吸去)，加0.85生理 盐水5mL，用指弹法（或吸管轻吹）将细胞团块弹散，混匀后1000rmin离心5min；重复上述条件，再离心洗涤1次。 4收集最后1次离心沉淀的血细胞，加入适量（58mL）的GKN液，轻吹散，混匀。 5（每4人）取悬液1mL到1个试管中，加入0.5 mL预热的50PEG混匀，置于30水浴中温浴35min；取未融合和融合的血细胞悬液各1滴分别滴于载玻片上的两侧，盖上盖玻片。 6利用光学显微镜 (高倍) 以未融合细胞为对照观察2个靠近细胞形成融合的过程。,【结果观察】 在高倍镜下可以看到有两个或两个以上的鸡红细胞膜融合在一起，形成一个同核体细胞。要注意辨别融合细胞与重叠的鸡红细胞。,【结果观察】 在高倍镜下可以看到有两个或两个以上的鸡红细胞膜融合在一起，形成一个同核体细胞。要注意辨别融合细胞与重叠的鸡红细胞。,【实验报告】 l在显微镜下按顺序绘制所观察到的细胞融合各阶段，并注明主要特点。 2什么是同核体、异核体? 细胞融合主要有哪几种方法？简述细胞融合的应用。,