抗氧化功能评价方法

附件 1：抗氧化功能评价方法试验项目、试验原则及结果判定Items, Principles and Result Assessment1 试验项目2 试验原则实验和人体试食试验所列的指标均-，表 ，化过 指化和老龄动物任选其一 验步时的，观应察对。受试样品li3 结果判定动物实验：脂质氧化产物、蛋白质氧化产物、抗氧化酶、抗氧化物质四项指标中三项阳性，抗氧化功能检验方法Method for the Assessment of Antioxidative Function1 动物实验实验动物剂量分组及受试样品给予时间实验方法朋含A 月0中组予溶物肽 1血照给积产甘 用按对组体化胱 选，剂量同氧谷 鼠溶剂予质性 小个个给脂原上13组测还 随机剂，死含量力。 剂品，处死基含活力D半乳糖氧化损伤模型原理11口l=Jlj=lSi的相同时同，、 量、 量、抗乙醇氧化损伤模型脂质氧化产物测定化脂质降解产物丙二醛（MDA）一脂采。用质荧降光解法产和比物色丙法二测醛口胞III（,荧荧光法光法原理。最diadeh9恒温水浴锅试剂通光离光心度机计、混微旋量器加、样具器塞、色释释12乙个氧月基）丙，烷临（用贮前备用液纯，水棕稀妥酸工作液四谷胱甘肽（还原型）29mmol擁存25周）溶解微温125mL125mLmL 用 H2SO4 调 pH ，助溶，酸棕水色瓶4LIII加水稀500mLin试剂（选A均需经 50硝酸避光L冷1 却至准管加标准、液1輸或浴 2mL、TBA振荡wmn顷oor/ min离心 5mininhi2mL2mL2mL匀，避光沸水浴60min,流水冷却业屮 3mL3mL3mL振荡抽准清馏3蹬白管加离心水，标（标准、沸醇M3mL正丁醇狭丁瞬测550nm)5入射狭过氧化脂质含jfnmo收Ll血清)= F-AF-AF-A1nmol/mL)比色法原可剂：A：B：F：C： 比色水稀贮备diadehy185mL液,4。保細个140nmol/mL%血溶液血样:取血20PL加入蒸馏水酸钠 SDSTBA1920mL480mL2%试血液*空白管 样品管 标准管-4乙S丙烷乙酸盐缓冲液%TBA混匀，避光沸水浴60比色 流水冷却，于 注行如用试剂盒，可按试剂盒的操作要求血清，样品管，标准管。Ill过氧化脂质含量=nnfeirA L2%溶血液）=F-AF-AIII过脂炎C脂质含量化脂脂脂血清）1=F-AF-AA: 空白管吸光度B：样品氧基度烷吸光度C：四乙氧基丙烷浓度(40nmol/mL)K稀释倍数质降解产物丙二醛置次，制1成匀浆加0组织一定量的、所剪需冲反心 510min空白管样品管标准管10%组织4乙.乙酸盐缓冲液%TBA混匀，避光沸水浴60比色 流水冷却，于 注：如用试剂盒，可按试剂盒的操作要求I/ I f -xnmo 妙g 遡0%织)000 AA样品管吸光！1 B - A1 C K =F-AFCiii氢if生而 1=1因脂机质体反胞仪器、生洗化板培机养箱、微量：8-Isoprostane KIA Kit （酶联免 疫试剂盒）8-Isoprosta EIA 抗体血清、8-Is血Eia3缓冲液稀hi、E、man示j离释心13为2mLJ说明列腺素标准孔分别 pg/mL、 pg/mL、 pg/mL、-步试剂空TATSBB0标准白/样品试剂培养3清洗加试剂5培养6；读缓冲液标准/样品:AChE示踪物抗体 血清 用封板膜盖好酶标板，并在4哲避光条件下培养18小时清洗所有反应孔五次IIIIIIPL507L507L507L507L507L507LAChE示踪物Ellmans-用封板5TL2007L2007L007L膜盖好酶标板，并在常温避 光条件下培养45-90分钟 在波长412nm处测量各孔吸光度2007L2007Lhi（B0在范围）Wr数NSB 孔吸光度 标准或样品孔吸光度赢盘吸光度二蛋白质氧化产物测定酸自，产集 质基 基羟裂处聚的白氨标 氨。断裂、质蛋种期 质累链断联白映多早 白积肽在交蛋反是的蛋的使，互有接成中加对物，坏相原直形程增 基产链破易去可基过而 由基肽的极失量羰饰长定 自羰于构白或含质修增测 一 m结 id rLFIMyc基溶下量70 羰 降羰蛋氧龄羰 的二硝，4用37的 可接一基而质。的年质 后二4-，2淀取质 化，4，沉读白 dsln 氧*2iM 链基起羰大能伤在，清理 可基淀度测 侧由引生为功损酸志血原 基硝沉光而III羰二-的光从，4色分，多，2棕在值2=_=仪器与试对照管37X准确避光反应30分 钟200 g/L三氯乙酸涡旋混匀1分钟，以4C下，以12000r/min离心10min,弃上清，留沉淀11l=J量温光光、度0: iomrnoi/f “2,，4二硝基苯 用5鸚。吨溶克2,4避基苯肼 液无鵝氯乙爲合应用 液 液酯，按现照用体现积配比。1： 1将的无比水例乙配醇置和成乙混酸合乙溶操作步骤测定管试剂血清（血浆）10 mmol/L_2,4二硝基苯肼2 mol/L HCL-涡旋混匀分钟乙酯混合应用液涡旋混匀1分钟，以4弋下，以12000r/min离心10min,弃上清，留沉淀11无水乙醇乙酸|乙酯混合应用液涡旋混匀1分钟，以4C下，以12000r/min离心10min，弃上清，留沉淀11无水乙醇乙酸|乙酯混合应用液涡旋混匀1分钟，以4C下，以12000r/min离心10min，弃上清，留沉淀11无水乙醇乙酸|乙酯混合应用液涡旋混匀1分钟，以4C下，以12000r/min离心10min，弃上清,留沉淀116 mol/L盐酸胍混匀后，37C准确水浴15分钟涡旋混匀，将全部沉淀溶解，以12000r/min 离心15min,取上清液在370nm处比色，6mol/L盐酸胍试剂调零，测定OD值。用双缩脲法测定血清(或血浆)蛋白质含量。注：如用试剂盒，可按试剂盒的操作要求进行。计算公式量蛋D-对质照原组织中蛋白质羰基测定测定管加匀离离ml量-2-乙N N1a0O0H0m试剂：10moN-2双蒸馏水(DNPH)溶入10ml10 mmol/L 2，4-二硝基苯肼 99毫克2，4-二硝基苯肼用50ml 2 mol/L HCL溶解，4C避光保存。液心 10 min，操作步骤液，制3006220mm0oogll/LLL无0乙1：1 将的无比水例乙配醇置和成乙混酸合乙溶酯液按，酸（ TCA） 乙酯混合应用中漂洗，以冰9 A/HZ、一I10 minmIII液液以魏0瞬转速，测定管对照管试剂 组织匀浆上清 液10 mmol/L_2,d二硝基苯肼2 mol/L HCL涡旋混匀1分钟,37C准确避光反应30分钟200 g/L三氯乙|酸xyj VT 9w | 9 s丄山w11离心10min,弃上清，留沉淀无水乙醇乙酸|乙酯混合应用液涡旋混匀1分钟，以4C下，以12000r/min离心10min,弃上清，留沉淀无水乙醇乙酸|乙酯混合应用液涡旋混匀1分钟，以4C下，以12000r/min离心10min，弃上清，留沉淀11无水乙醇乙酸|乙酯混合应用液涡旋混匀1分钟丿以4C下，以12000r/min离心10min，弃上清，留沉淀11无水乙醇乙酸|乙酯混合应用液涡旋混匀1分钟，以4C下，以12000r/min离心10min，弃上清，留沉淀116 mol/L盐酸胍混匀后，37c准确水浴15分钟涡旋混匀，将全部沉淀溶解，以12000r/min 离心15min,取上清液在370nm处比色，6mol/L盐酸胍试剂调零，测定OD值。用双 缩脲法测定匀浆上清液蛋白质含量。注：如用试剂盒，可按试剂盒的操作要求 进行。蛋白质照管基含量=测定管计算公式到成蛋白质分解擦对会应影未0乙蛋 去37和与值 反剩比去在醇未光抗氧化酶活力测定JB匕腐 催嘍1细DO2 物，。红酶由组织 SOH 化水用血，自或组 成氧成作体化除血或 生过生害人变消血分、光匀光浆计、酶标仪、R液（PBS） ，加 PBS 至 10mL 加 NaOH 溶解，加 PBS仪仪器器2与心O - 盐9III嘌呤g氧化轟吟氧化酶加冰冷PBSL 至 10mL黄只甲萘胺溶于冰醋酸酸，再加水凉水in对照管0D测定管 OD体i=ji=ieD反临m50mL温蒸馏水加器L至ooor0实验步绿畧in 离Jmin，清液 20pl5D百分WBr对照管L反应液中SOD抑制率达50%时 反应液总量活力6mU/mL）h对。照管OD 释倍数取液量也可 也可 分抑制也率可 U/mL，X样品稀50 品的百l 应的 SOD织蛋蛋质白血红蛋白含步骤:土h测定管盐样品测A*U/g Hb。对照管却化 已混苯蟲恒温水浴30mn 混馏水im零后3倒入处比光测定色杯，以10 pl2030pl （溶血样品剔除）1040 plP由ahi体 起剂谷胱普肽过氧化物酶（GSHI3nm即11 I-*- rAbi=ji=i苯生离：心可机见、光匀分浆光器光、度恒计温、水酶浴标锅仪、微低剂：叠氮钠磷酸缓冲液ENNDaNTHA3P-ONa2终终终Na2HPOa42终度L度度 LL度度 LL。HCL、NaOH 1mmol/L容胱甘肽（还原型GSH）溶液100mL，先用蒸馏水溶解）HPO3前将贮，备加入到 1mL 双 譎趣。测 in立去即浮ishG。取标准曲溶觀作、分别置于10mL11于塑料管，放，而酶活力不EDTAIll滤室加保馏水至280gmL，用普通滤纸过 保存LN：HPo4溶加蒸馏水至500mL,室温 保存。DTNB显色液柠檬酸严 个月 加蒸馏水至100mL, 4C避光保存1 个月。%磷酸缓冲液IIIIII样实品验溶制步血骤备液：中，水中释至加入磷酸沉即剂。0、40、60、80、10叶mol/L 试管中显 加不同浓度标准杯各比色前放 点黔4显色液用长lODm杯以双in在H：含量制m准曲线横坐标d42j :样品管非酶管空白、（ mL）口* 水*口 c37水浴预温5min热H）%预热7）水浴准确反应）mn4严格控制时沉淀磷酸f离、430OOr/min离心40min11、眞心上2 偏磷酸LN HPOa24 D液NB显反应1min后于42，读 OD 值，5min* 样品为组织上清液时，非酶管改为加热使酶失活的组织上清液。血1mL*溶血液液如用1:20稀试释，取剂稀释盒液 ，可按试剂盒的操作要求个酶活力单位。 非III鼠管血鴉歇样品管幣【GSHk全血）=一非3minX矜3min克浓蛋度位。组织酶SHOD样力单位DU/mA蛋白）=3minX样品蛋白质的mg数* Folin 法或双缩脲法测样品蛋白质含量标准GSH浓度（u mol/L）* A=即标准曲线斜率。OD）OD空白管ODlog【样品管oD0空非管O管注意事项密度9浓度， 240nm由于液*3mL，浓度（mmol/L）=若OD值为，则表明H2O2浓度为L。仅受系 色不，还应体的有，时比子度后此时阴子色色 酸离显显甲氢入始 苯中加开。in swlnl。 2- 应限11 确抗氧化物质还原型谷胱甘肽（GSH ）测定或组织中还原型谷胱甘肽（GSH ）测定4，KH2PO4，加加蒸馏水至11取溶液B叭溶于H-和 5, 5-二硫1000mL的；叠瞬冲液=:NaNEDTA3-N aNa2HPO42NaH2 2PO4 量 HCl、NaO 加叠1mmol=J|=|中mgmg下 3500rpm 离心g1000mL,用少III血血液加4III4%盐水充分3500rpm上清液：IIIIII液或组织样测空白管温放置10分钟后，420nm处 清样品测定一空白管测可温放置10奔钟后，420nm处I20、0光管横14、, I3 4 567IIIO朝、融0陶标准溶 至闘室、20 调坐零标（DmTNLB）计算mH量）0 20 40 10 20 30400 倍样虑含液稀释倍聽上清麟 倍数l=j|=|（爲/oSi全血）=对应曲线浓度值 噺上清液稀释对应曲线浓度值（mol/L）X2（样品lGS上含液稀释倍对应上清液组值I=Jl=l含量=倍数对l=J|=|值（脚浓组织100g组织对应曲线浓度 含样品L幾上清液稀释倍数应曲清液蛋值 （鼬）勰匀浆gpr对应曲线浓度值数据处理与结果判定数据处理指标判定 脂质氧化产物照力升性 照判作用 对活有阳 对，作（或该项 （统化 型豊wrn 熬闸一 4力意力含 化受，统化化受，试指 氧 较有氧氧 较受项 抗 比高抗抗 比该该白质肽四试fr*亠、r = z - y。病含性判质原可性氧性阳结过活标验 酶指实体、试 身肺受 ，、愿 岁肝志 5、， 6心史 8、药 1脑服 在显期 龄明长 年无无。 选，群 好患人 良疾的食统，和女肾 试者，效妇、 受断准功期肝 与判标定者乳、 用的入判断哺心 服果纳法判 或有。内结合无性 娠并者期对符，全 妊合患短到不品安受试者分组平影饮间 水虑活组。x、尽性，于按组因行组 者食要进每 试试主，。 受为的等性 对分果惯比 机结习可随响食的验试对可组 试受性时食 。用阴要试 计服用必和 设日采 照每或月照 对量剂个对 种用慰3间 两服安间期 间、用时验。 组法服予试变 和方可给。不身用组品月食 自服照样个饮 用荐对试6、 采推，受至活 按品。长生 组产照延原包括精神、睡眠、饮食、大 规查检查 查、腹部 B 超检查胸透、心观察指标 各项指标在试验开始及结束时各检 测 1 次。安全性指标小便10M0%DAMDA试验前功效指标分率= 试验 前xmc t *! MC% 7 U 11 h .P%S我后百分率试验前GSH_GSH-PX试验前，进不正；，大在， 验需差足验求太。下 检者方满检要数验提 对，布，行差异和的 配验分换进方变秩性 用检态转据态但用着 以组非变的足验料无较试有 可成对的换满检资异比标均 料用，当转能和的差间指较。 资采验适用不秩）较组察比性 照较检行，仍或比后观间阳脂 对比性进后据验50 间验效组标化 WNWI差聲食过 凡组方的方转用如验进 试定 两行齐态若改（试可 和判可 较方 比， 身义 自意 后自学意前计 。验统及）&观察试验前下降百彈理测的变化 试验后豳P。试验前百分率警 试验前 8-Isoprostane 变化及化物歧化酶百分观察试测定方法见D wsod验后升d高百 GSH物酶h-血中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH Px）活力测定原理5，5-体 起9GSH 减少。TNB,谷 由内基存谷 由基 减基 子离子浓度试剂和仪器温水试浴剂锅：、可叠微氮见量光钠 NN EDaTA3 -N N HPOa2 4Ill器光、度离计心、机酶标仪、器缓、冲离液心机L LL L。HCL、NOH immOl/L容胱甘肽（还原型GSH）溶 液GSH 加叠氮钠磷酸缓冲液至 100mL，100mL，临用前配配制H當溶保存1-2日。 前0将贮贮备滤 L Na2HPO 4溶液 :个实月验。步骤水测中，4测定， 测前定若品室温自然GSH 标准曲线旳制作试管中，上加述入不水至m纸过III水。0、稀40释、至601mL 双III完。10mLu mo仇旳GSH同蹩标准液各摺前加放入 a2 4液血样稀释4严格44in离心40min22光蒸37C水浴预温5min 热预 淀偏磷浴控制反间茫 液离心上清 淀液磷酸沉L PO4NB4 显墓1min后于421卖 0D 值，5minOD-样全品管0D）PX活力U/mL 血=标准GSH浓度（u mol/L）* A=即标准曲线的斜率标准 GSH 光密度（ OD）血 清 中 8- 表 氢 氧 - 异 前 列 腺 素 （8-lsoprosta ne）测定原理仪器与试剂振试獰量加样器生板培养箱蟲-步试剂-空 白TATSBB0标准 /样 品1.加试剂EIA 缓冲液100UL50 UL标准/ 样品50 UL50 ULAChE 示踪 物50 PL50 UL8-Isoprostane8-Isoprostane AChE 示温2抗准品清染H Ei：rnnr试实验步骤样品Ill抗体血清、3m2L脉用，3缓1倍备用n前m准孔浓度分I2.培养3.清洗加试剂5.培养读数50 P 50 P L-抗体血清用封板膜盖好酶标板，并在4C避光条件下培养18小时清洗所有反应孔五次III5WLTAChE示踪 物Ellmans用封板膜盖好酶标板，并在常温避 光条件下培养4590分钟 在波长412nm处测量各孔吸光度 （B0在一范围）200PL200PL200PL200PL200PLhiNSB 孔吸光度 标准或样品孔吸光度赢轟融光度二以标准物的浓度的对数（log）为横坐 标， %B/B0 为纵坐标绘制标准曲线，亦可将数据转换成 logit(B/B)或 lnB/B0/(1 - B/B。)】做为纵坐标绘制标准曲线，计算回 归方程。将样品的8人0值，代入方程式, 计算出样品的浓度，再乘以稀释倍数，即 为样品中的 8 表氢氧异前列腺素浓度。