第十三讲 分光光度

第第7章章 吸光光度法吸光光度法7.1 概述概述7.2 吸光光度法基本原理吸光光度法基本原理7.3 分析方法和仪器分析方法和仪器7.4 显色反应及影响因素显色反应及影响因素7.5 光度分析法的设计光度分析法的设计7.6 吸光光度法的误差吸光光度法的误差7.7 吸光光度法的应用吸光光度法的应用吸光光度法：分子光谱分析法的一种，又称分光光吸光光度法：分子光谱分析法的一种，又称分光光度法，属于分子吸收光谱分析方法度法，属于分子吸收光谱分析方法 基于外层电子跃迁基于外层电子跃迁7.1 概述概述吸收光谱吸收光谱发射光谱发射光谱散射光谱散射光谱n分子光谱分子光谱n原子光谱原子光谱7.2 吸光光度法基本原理吸光光度法基本原理一、一、吸收光谱产生的原因吸收光谱产生的原因光谱名称波长范围X射线0.110nm远紫外光10200nm近紫外光近紫外光200400nm可见光可见光400750nm近红外光0.752.5um中红外光2.55.0um远红外光5.01000um微波0.1100cm无线电波11000m当光子的能量与分子的当光子的能量与分子的 E匹配时，匹配时，就会吸收光子就会吸收光子 E=hu u=hc/l l光光:一种电磁波一种电磁波,波粒二象性波粒二象性 单色光：具有相同能量(相同波长)的光.混合光：具有不同能量(不同波长)的光复合在一起。l l/nm颜色颜色互补光互补光400 450紫紫黄绿黄绿450 480蓝蓝黄黄480 490绿蓝绿蓝橙橙490 500蓝绿蓝绿红红500 560绿绿红紫红紫560 580黄绿黄绿紫紫580 610黄黄蓝蓝610 650橙橙绿蓝绿蓝650 760红红蓝绿蓝绿二、物质颜色和其吸收光关系二、物质颜色和其吸收光关系例如：例如：CuSO4溶液溶液5人眼人眼实验证明：实验证明：CuSO4溶液浓度越高，对黄色光的吸收溶液浓度越高，对黄色光的吸收越多，表现为透过的蓝色越强，溶液的蓝色也越深。越多，表现为透过的蓝色越强，溶液的蓝色也越深。吸收光谱曲线：吸收光谱曲线：物质在不同波长下吸收光的强度大小物质在不同波长下吸收光的强度大小 Al l关系关系最大吸收波长最大吸收波长 l lmax：光吸收最大处的波长光吸收最大处的波长三、一些基本名词和概念三、一些基本名词和概念l lmax对比度对比度(l l):络合物最大吸络合物最大吸收波长收波长(l lMRmax)与试剂最大与试剂最大吸收波吸收波(l lRmax)之差之差l lCr2O72-、MnO4-的吸收光谱的吸收光谱300400500600700l l/nm350525 545Cr2O72-MnO4-1.00.80.60.40.2Absorbance350原子光谱为线光谱原子光谱为线光谱分子光谱为带光谱分子光谱为带光谱电子跃迁能级电子跃迁能级分子振动能级分子振动能级分子转动能级分子转动能级 不同物质吸收光谱的形状以及不同物质吸收光谱的形状以及l lmax 不同不同定性分析的基础定性分析的基础同一物质，浓度不同时，吸收光谱的形状相同，同一物质，浓度不同时，吸收光谱的形状相同，Amax 不同不同定量分析的基础定量分析的基础9四、朗伯四、朗伯-比尔定律比尔定律I0=Ir+It+IaI0=It+IaI0IrItIaT=It/I0,T:透射比或透光度透射比或透光度 A=lg(I0/It)lg(1/T),A:吸光度吸光度朗伯定律朗伯定律:(1760)(1760)A=lg(I0/It)=k1b 当入射光的当入射光的l l ,吸光物质的吸光物质的c 一定时一定时,溶液的吸光溶液的吸光度度A与液层厚度与液层厚度b成正比成正比.比尔定律比尔定律(1852)1852)A=lg(I0/It)=k2c 当入射光的当入射光的l l ,液层厚度液层厚度b 一定时一定时,溶液的吸光溶液的吸光度度A与吸光物质的与吸光物质的c成正比成正比.当一束平行单色光垂直照射到样品溶液时，溶当一束平行单色光垂直照射到样品溶液时，溶液的液的吸光度吸光度与溶液中吸光质点的与溶液中吸光质点的浓度及光程浓度及光程（溶液（溶液的厚度）成正比关系朗伯比尔定律的厚度）成正比关系朗伯比尔定律 光吸收定律光吸收定律 数学表达：数学表达：Alg(1/T)=Kbc其中，其中，A:吸光度，吸光度，T:透射比，透射比，K:比例常数，比例常数，b:溶液厚度，溶液厚度，c:溶液浓度溶液浓度注意：注意：平行单色光平行单色光 均相介质均相介质 无发射、散射或光化学反应无发射、散射或光化学反应 稀溶液稀溶液吸光度吸光度A、透射比、透射比T与浓度与浓度c 的关系的关系13AT(%)cA=kbc1.00.80.60.40.2-kbcT=10100 80 60 40 20灵敏度表示方法灵敏度表示方法摩尔吸光系数摩尔吸光系数 e eA=e e bcA=K Kbcc:mol/L 表示物质的浓度为表示物质的浓度为1mol/L,液层厚度为液层厚度为1cm时溶液时溶液的吸光度。单位：的吸光度。单位：(Lmol-1 cm-1)c:g/LA=abc a:吸光系数吸光系数溶液浓度的测定溶液浓度的测定Ae e b c工作曲线法工作曲线法(校准曲线校准曲线)朗伯朗伯-比尔定律的分析应用比尔定律的分析应用 0 1.0 2.0 3.0 4.0 c(mg/mL)A。*0.800.600.400.200.00Axcx标准比较法：标准比较法：As =e e b cs （标准样品标准样品)Ax =e e b cx （待测样品待测样品)注意注意:用用比较法测定时，所用标准溶液浓度应与待测比较法测定时，所用标准溶液浓度应与待测 溶液的浓度相接近，且溶液的浓度相接近，且实验条件应相同。实验条件应相同。xxss=AccA16五、吸光度五、吸光度的加和性与吸光度的测量的加和性与吸光度的测量17 A=A1+A2+An 用参比溶液调用参比溶液调T=100%（A=0），再测样品溶），再测样品溶液的吸光度，即消除了吸收池对光的吸收、反射，液的吸光度，即消除了吸收池对光的吸收、反射，溶剂、试剂对光的吸收等溶剂、试剂对光的吸收等。001221=lg =lg =-=lgIIIAAAAAIII参参参参比比液液比比试试试试液液方便、灵敏，但准确度差，常用于限界分析。方便、灵敏，但准确度差，常用于限界分析。187.3 分析方法和仪器分析方法和仪器一、目视比色法一、目视比色法观察方向观察方向空白空白c1c2c3c4二、光电二、光电比色法比色法光电比色计结构示意图光电比色计结构示意图通过滤光片得一窄范围的光通过滤光片得一窄范围的光(几十几十nm)nm)滤光片滤光片吸收滤光片吸收滤光片：只允许指定的窄范围波长光通过，其：只允许指定的窄范围波长光通过，其他波长的光均被吸收。他波长的光均被吸收。选择滤光片的原则：选择滤光片的原则：滤光片透光率最大的光是溶液吸收最大的光滤光片透光率最大的光是溶液吸收最大的光,即滤光片的颜色与有色溶液的颜色互补。即滤光片的颜色与有色溶液的颜色互补。三、三、分光光度法和分光光度计分光光度法和分光光度计21通过通过棱镜或光栅棱镜或光栅得到一束近似的单色光，得到一束近似的单色光，波长可调波长可调,故选择性好故选择性好,准确度高。准确度高。光源光源单色器单色器样品池样品池检测器检测器读出系统读出系统1.1.分光光度计的基本原件分光光度计的基本原件常用光源常用光源光源波长范围(nm)适用于氢灯185375紫外氘灯185400紫外钨灯3202500可见，近红外卤钨灯2502000紫外，可见，近红外氙灯1801000紫外、可见（荧光）能斯特灯10003500红外空心阴极灯特有原子光谱激光光源特有各种谱学手段氙灯氙灯氢灯氢灯钨灯钨灯单色器单色器 作用作用:产生单色光产生单色光 常用的单色器：棱镜和光栅常用的单色器：棱镜和光栅样品池（比色皿）样品池（比色皿）厚度厚度(光程光程):0.5,1,2,3,5cm 材质：玻璃比色皿可见光区材质：玻璃比色皿可见光区 石英比色皿可见、石英比色皿可见、紫外光区紫外光区检测器检测器 作用：接收透射光，并将光信号转化为电信号作用：接收透射光，并将光信号转化为电信号 常用检测器：常用检测器：光电管光电管 光电倍增管光电倍增管 光二极管阵列光二极管阵列光电管分为红敏和紫敏，阴极表面涂银和氧光电管分为红敏和紫敏，阴极表面涂银和氧化铯为红敏，适用化铯为红敏，适用6251000nm波长；阴极波长；阴极表面涂锑和铯为紫敏，适用表面涂锑和铯为紫敏，适用200625nm波长波长1)单光束分光光度计单光束分光光度计2.分光光度计的基本类型分光光度计的基本类型0.575光源光源单色单色器器吸收池吸收池检测器检测器显示显示2)双光束分光光度计双光束分光光度计27双光束型可以消除光源强度变化的影响。双光束型可以消除光源强度变化的影响。比值比值光源光源单色器单色器吸收池吸收池检测器检测器显示显示光束分裂器光束分裂器多通道仪器多通道仪器（Multichannel Instruments）光电二极管阵列光电二极管阵列(通常具有通常具有316个硅二极管个硅二极管)photodiode arrays(PDAs)同时测量同时测量200820nm范围内的整个光谱范围内的整个光谱,比单个比单个检测器快检测器快316倍倍,信噪比增加信噪比增加3161/2 倍倍.283)其他类型分光光度计其他类型分光光度计纤维光度计纤维光度计将光度计放入样品中将光度计放入样品中,原位测量原位测量.对环境和过程对环境和过程监测非常重要监测非常重要.7.4 显色反应及影响因素显色反应及影响因素要求：要求：a.选择性好选择性好b.灵敏度高灵敏度高(104)c.产物的化学组成稳定产物的化学组成稳定d.化学性质稳定化学性质稳定e.反应和产物有明显的颜色差别反应和产物有明显的颜色差别(l l60nm)没有颜色的化合物，需要通过适当的反应定没有颜色的化合物，需要通过适当的反应定量生成有色化合物再测定量生成有色化合物再测定 显色反应显色反应一、一、显色反应显色反应二、二、显色反应的影响因素（显色反应条件）显色反应的影响因素（显色反应条件）a 溶液酸度（溶液酸度（pH值及缓冲溶液）值及缓冲溶液）u 影响显色剂的平衡浓度及颜色，改变lu 影响待测离子的存在状态，防止沉淀u 影响络合物组成形式形式 pH max(nm)形式形式 pH max(nm)H4L+1.2 462-465 Sn4+1.0 530H3L 4.8-5.2 462,490 Ga3+5.0 550H2L-8.4-9.0 512HL2-11.4-12.0 532-538pH对苯芴酮及其络合物的颜色影响对苯芴酮及其络合物的颜色影响 b 显色剂的用量显色剂的用量稍过量，处于平台区稍过量，处于平台区 c 显色反应时间显色反应时间针对不同显色反应确定显示时间 显色反应快且稳定；显色反应快但不稳定；显色反应慢，稳定需时间；显色反应慢但不稳定d 显色反应温度显色反应温度加热可加热可加快反应速度，但易导致许多显色剂或产物分解e 溶剂溶剂f 干扰离子干扰离子 有机溶剂，提高灵敏度、显色反应速率有机溶剂，提高灵敏度、显色反应速率 消除共存离子干扰的方法：消除共存离子干扰的方法：提高酸度，加入隐蔽剂，改变价态提高酸度，加入隐蔽剂，改变价态 选择合适参比选择合适参比 褪色空白褪色空白(铬天菁铬天菁S测测Al，氟化铵褪色，消除锆、，氟化铵褪色，消除锆、镍、钴干扰镍、钴干扰)选择适当波长选择适当波长 钼酸铵法钼酸铵法(测测 P、Si、W)，过氧化氢法过氧化氢法(测测V5、Ti4)（主要使用）（主要使用）铬天菁铬天菁S（CAS）、苯基荧光酮（）、苯基荧光酮（PF）偶氮胂偶氮胂III等等：邻二氮杂菲（测：邻二氮杂菲（测Fe）等）等4、带含硫基团的螯合剂：双硫腙（测、带含硫基团的螯合剂：双硫腙（测Cu、Pb、Zn、Cd、Hg等）等）7.5 光度分析法的设计光度分析法的设计a 选择合适的入射光波长，无干扰时选择最大吸选择合适的入射光波长，无干扰时选择最大吸 收峰波长收峰波长l lmax。b 确定线性区间。确定线性区间。c 控制吸光度读数范围在控制吸光度读数范围在0.2 0.8 之间。之间。d 选择适当的参比溶液进行测量。选择适当的参比溶液进行测量。7.6 吸光光度法的误差吸光光度法的误差非单色光引起的偏移非单色光引起的偏移物理化学因素：非均匀介质及化学反应物理化学因素：非均匀介质及化学反应吸光度测量的误差吸光度测量的误差 对朗伯对朗伯-比尔定律的偏移比尔定律的偏移一、一、非单色光引起的偏移非单色光引起的偏移 复合光由复合光由l l1和和l l2组成，对于浓度不同的溶液组成，对于浓度不同的溶液a和和b,引起的吸光度的偏差不一样，浓度大，复合光引起的吸光度的偏差不一样，浓度大，复合光引起的误差大，故在高浓度时线性关系向下弯曲。引起的误差大，故在高浓度时线性关系向下弯曲。非均匀介质非均匀介质 胶体，悬浮、乳浊等对光产生散射，使实测胶体，悬浮、乳浊等对光产生散射，使实测吸光度增加，导致线性关系上弯吸光度增加，导致线性关系上弯二、物理化学因素二、物理化学因素离解、缔合、异构等离解、缔合、异构等如：如：Cr2O72-+H2O-=2HCrO4-=2H+2CrO42-PAR的偶氮醌腙式的偶氮醌腙式 化学反应化学反应吸光度标尺刻度不均匀吸光度标尺刻度不均匀三、吸光度测量的误差三、吸光度测量的误差A0.434，T36.8%时，测量的相对误差最小时，测量的相对误差最小A=0.20.8,T=1565%，相对误差，相对误差 cs Ax=abcx As=abcs A=ab(cx cs)=abc操操 作作 以以cs（浓度低于未知溶液）为参比溶液，调节（浓度低于未知溶液）为参比溶液，调节T=100%(A=0);测定一系列浓度高于测定一系列浓度高于cs的标准溶液的吸光度的标准溶液的吸光度A(即即A）；）；以以A c 作工作曲线；作工作曲线；测定未知溶液的吸光度测定未知溶液的吸光度Ax（即（即Ax）；）；cx =cs+c 原理原理:参比溶液与未知溶液透光度的比值恒定参比溶液与未知溶液透光度的比值恒定示差法提高准确度的实质示差法提高准确度的实质常规法常规法TxT0 5 1050100 落在测量误差较大的范围落在测量误差较大的范围T0 5 1050100TrTsTs 落在测量误差较小的范围落在测量误差较小的范围结论：结论：示差法通过提高测量的准确度提高了示差法通过提高测量的准确度提高了方法的准确度方法的准确度示差法示差法四、四、光度滴定光度滴定48NaOH滴定滴定 对硝基酚对硝基酚 pKa=7.15 间硝基酚间硝基酚 pKa=8.39 pKa=1.24V1V2V(NaOH)/mL对硝基酚对硝基酚间硝基酚间硝基酚酸形均酸形均无色无色.碱形均碱形均黄色黄色典型的光度滴定曲线典型的光度滴定曲线49依据滴定过程中溶液吸光度变化来确定终点的滴定分析方法。依据滴定过程中溶液吸光度变化来确定终点的滴定分析方法。Vsp滴定剂吸收滴定剂吸收Vsp被滴物吸收被滴物吸收Vsp滴定剂与待滴定剂与待测物均吸收测物均吸收Vsp产物吸收产物吸收五、络合物五、络合物组成的测定组成的测定1.摩尔比法摩尔比法:固定固定cM,改变改变cR 1:13:1c(R)/c(M)A1.0 2.0 3,0 2.等摩尔连续变化法等摩尔连续变化法:MRMRnn MR(ccc）常数常数M:R=1:10.50.33cM/ccM/cM:R=1:20 0.2 0.4 0.6 0.8 10 0.2 0.4 0.6 0.8 1六、一元弱酸离解常数的测定六、一元弱酸离解常数的测定HL HLHLHLL=HL+LKccAKKe ee eeeee +L+aaa(HL)H (HL)=+H+H KaH+L/HL高酸度下，几乎全部以高酸度下，几乎全部以HL存在，可测得存在，可测得AHLHLc(HL)；低酸度下，几乎全部以低酸度下，几乎全部以L存在，可测得存在，可测得AL Lc(HL).代入整理：代入整理：L HLAAKAAa-p=pH+lg-或或配制一系列配制一系列c相同相同,pH不同的溶液不同的溶液,测测A.HL、L 颜色不同颜色不同+aL=H-KAAHLLH L-AAMO吸收曲线吸收曲线Aa(HL)Ab(L)123456Ab654321Aa350400450500550600l l/nmA曲线曲线pH11.10,1.3822.6533.0643.4853.9865.53,6.80由每份溶液的一由每份溶液的一对对pH、A，可求，可求得一个得一个Ka,取平取平均值即可。均值即可。1 了解分子对光的吸收与溶液颜色的关系了解分子对光的吸收与溶液颜色的关系.吸收曲线吸收曲线定性定性分析的基础。分析的基础。定量分析的基础定量分析的基础朗伯朗伯-比尔定律：比尔定律：A=e ebc=-lgT 式中各式中各参数的物理意义，定量计算。参数的物理意义，定量计算。2 了解目视比色法、分光光度法的特点，分光光度计的基本了解目视比色法、分光光度法的特点，分光光度计的基本部件。部件。3 灵敏度的表示灵敏度的表示摩尔吸光系数的意义和计算；摩尔吸光系数的意义和计算；准确度准确度适宜的测量范围、偏离比尔定律的原因。适宜的测量范围、偏离比尔定律的原因。4 显色反应及条件的确定显色反应及条件的确定:显色剂用量、酸度、时间、温度、显色剂用量、酸度、时间、温度、干扰及消除。干扰及消除。5 应用应用:单一组分测定示例、多组分测定、光度滴定、络合单一组分测定示例、多组分测定、光度滴定、络合物组成的测定、酸碱离解常数的测定。物组成的测定、酸碱离解常数的测定。小结小结