类芽孢杆菌ZC0胞外多糖的制备和生物活的研究硕士

分类号 密级 注1 学 位 论 文类芽孢杆菌ZC0胞外多糖的制备和生物活性的研究（题名和副题名）陈金苹（作者姓名）指导教师姓名 张建法 教授 申请学位级别 硕士 专业名称 生物化工 论文提交日期 204. 论文答辩日期 2014 学位授予单位和日期 南 京 理 工 大 学 答辩委员会主席 评阅人 2014年 月 日注1:注明国际十进分类法DC的类号。硕士学位论文类芽孢杆菌ZC01胞外多糖的制备和生物活性的研究作 者：陈金苹指导教师：张建法 教 授南京理工大学201年月60 / 70Master Dgree DisertaionPrepation and biologiltiity tuyfr an excellular psacchrieroduc by Pnibaclu sp。C0 ByJpingheuevised by Pro. anfa ZhgNanjingUniverity f cience & ThnoyMrch, 214声 明本学位论文是我在导师的指导下取得的研究成果,尽我所知，在本学位论文中,除了加以标注和致谢的部分外,不包含其他人已经发表或公布过的研究成果，也不包含我为获得任何教育机构的学位或学历而使用过的材料。与我一同工作的同事对本学位论文做出的贡献均已在论文中作了明确的说明。研究生签名： 年 月 日 学位论文使用授权声明南京理工大学有权保存本学位论文的电子和纸质文档,可以借阅或上网公布本学位论文的部分或全部内容，可以向有关部门或机构送交并授权其保存、借阅或上网公布本学位论文的部分或全部内容。对于保密论文,按保密的有关规定和程序处理.研究生签名： 年 月 日摘 要近些年来，微生物保胞外多糖作为一种新的发酵产品，因为其具有独特的物理化学性质,易于获得，成本相对较低，而被广泛应用于各个行业。本实验室从河南某农田的土样中分离培养出一株产胞外多糖的新菌株C01。该菌能够在无机盐培养基上生长,通过初步鉴定和1SrDNA同源性分析，确定该菌是一种类芽孢杆菌(aibacls s.ZC01)。采用乙醇沉淀法，将C01菌的发酵液中的代谢产物沉淀析出并烘干,即可得到胞外多糖的粗品。通过单因素法优化发酵条件,得到产胞外多糖最高时的发酵条件为：可溶性淀粉30g/L,蛋白胨 g/L,磷酸氢二钠 1.2 g/L，磷酸二氢钾0.6/L，氯化钙 0。 /L,氯化镁0.3 ,硫酸亚铁002gL，硫酸锰0.0 g/L, 氯化锌001 g/，水1L，8。0，28。发酵液最高产量可达到1.5g/L。该菌所产的胞外多糖,各化学组分含量分别为水分65、蛋白16.4%、灰分109、总糖641。通过分离纯化,气相色谱、红外光谱、核磁共振以及糖残基测定，确定该胞外多糖由四种单糖组成，是一种杂多糖。四种单糖成分分别为葡萄糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖，这四种单糖的摩尔比为1。21.20.71。并且发现多糖中含有一定量的糖醛酸，是一种酸性杂多糖.本实验还研究了多糖的吸水保湿效果和抗氧化性能,发现了该多糖具有与透明质酸相似的吸水保湿性能，具有良好的清除自由基的能力。因此，研究证明该多糖有广泛的应用前景，能大量应用于化妆品行业。关键词:类芽孢杆菌ZC01，多糖，抗氧化，吸水，保湿，分离纯化AstratIn reen yer, microrganisms tracella plyacchrie, a aknd o eferetatin proct，becaue ofts unque ysl and eic opetie, such as easily aaiable, reively low cst， s wiey ppled in varis dtries newstrC01 was solated froma sol smple romHanfamland our laboratoyThe bactri d use inorgancmeum to roucxtracellulr plysccharide. Acordingt pelinay dnification ad 16S DNA homoogalyis， tberia a identfied as th ens Paenibailus (Paeniilus pZ01）。thaoprecipitaton， the fernted iquid wa adde more than tiesoethao， heetblc prodc aprcipitated ot an dd, ude podcts o te xtracelllr plysaccrdewoudbeobtained。 Thefermetation cnditns wreotimizd thrug singlefacto， the best femntatin conins to prodemor Extallular polysacride ws stud in tspape。Is meia coponent was Solubl sarc 30 g/L, petone 4/L,dsodium hrogphsphat 12 g/L， poassidihydrgen phsphate 6 gL，lmclide 0. L, meium clrie 03 g/L， errous sulfte， 0。125 gL， maganesesulfate， 0.00 g/, zi cloid 0。1 g/， 1 Lte, p。, 28 .thmaxmu yield coudreac 5 g/L.hemicalomosition of xoplyacarid ae isure 8.6%， potei16.24,totalsugar 4。01%， sh 1。9%. Through separanad prification， gs hromtorapy，infrared spctru, nucler magt resance （NMR） and suar rese deterintin， the xtrellur polyscharide was fud is ain o heeroolyschardecopsed fur insf onosaccaride. Fur kids of mnoscchade mposiion were gucose, annse， galactose， amn，themoar ratio wa1。：1：.7：1. And the oolysacarie found to oai crtain amt ofuronic ai， i a id of acii hetropoyaccade. e studie msterttion capcii and anioxidant of th exosaccharefon hthe poyscchaide hs mistureaboption nd -rtenton capties and the wll capable of scavenig freeadicas comaewith hyuroni aid。 Terre, lltheresl frm this aper hav shown ta he olysahidehas a wdey plicatioprosect andcolbe used to i cometiceywos： Paeniaclus sZC01， plyccaride,antoxian, Moisturebsoion,Mosure eentio, searaton and puifation 目 录摘 要IbstctI目 录III1 绪论1.1 多糖的研究111 植物多糖.12 动物多糖1。1。3海藻多糖21。1。4 微生物多糖2微生物胞外多糖的生物活性31.21 免疫调节活性31。2.2抗肿瘤活性1。2.3 降血糖和降血脂作用41。2.4 抗氧化活性。 微生物胞外多糖的应用43。1 胞外多糖在医疗方面的应用532胞外多糖在食品行业的应用.3胞外多糖在化妆品方面的应用3。4胞外多糖在环境方面的应用71.4 本课题的目的、意义及主要研究内容714.1 课题的目的和意义.4.2主要研究内容2类芽孢杆菌ZC1胞外多糖的初步鉴定82。材料与方法8。11主要试剂82.主要仪器92.3菌种筛选来源12。4C01 菌的初步鉴定方法1025菌种的保藏12。.胞外产物性质的确定1322 结果与讨论132.1菌种的培养12.菌株的初步鉴定2。2.ZC1菌的D提取和PC实验142。4 C01菌的1s rDN系统发育分析16。 本章小结163 类芽孢杆菌ZC发酵产胞外多糖条件的优化1831 材料与方法8。11 实验材料与试剂183。1。2主要仪器183.13实验方法193.1。4 实验设计13.2 结果与讨论20。2.1 碳源对发酵液粘度和产量的影响0322 氮源对发酵液粘度和产量的影响213.2。 pH值对发酵液粘度和产量的影响22。2.4 温度对发酵液粘度和产量的影响233。2。5 无机盐离子对发酵液粘度和产量的影响233.3 本章小结244 多糖的组成和组分的分析264。1 材料与方法264.1。1 主要试剂26。12主要仪器274.1。胞外多糖的提取、制备、分离纯化284.1 多糖化学组成的测定方法8415多糖结构的测定方法94。2结果与讨论0.。1 Z01菌胞外多糖的制备，分离纯化30.2. 胞外多糖的化学组成34.3 多糖结构的测定与分析3143 本章小结35胞外多糖的生物活性的研究35。1 材料与方法751 实验材料与试剂375。12 实验主要仪器375.1。4 胞外多糖的吸湿和保湿作用的研究85。5胞外多糖抗氧化性能的研究385.2 结果与讨论405。1胞外多糖的吸水保湿实验4052.2胞外多糖的体外抗氧化实验4253本章小结446 结论456. 研究小结46。2本课题接下来的研究方向46致谢47参考文献481 绪论1。1 多糖的研究多糖是由多个单糖或其衍生物聚合而成的天然高分子化合物，相对分子质量从几千到几百万不等,是生命有机体的重要组成部分,又被称为多聚糖。多糖主要来自于高等植物、动物细胞膜和微生物细胞中，在自然界中90以上的碳水化合物是以多糖的形式存在.多糖的结构复杂,分类方法也很多，根据组成来分，有均多糖和杂多糖；根据生理功能来分，有结构多糖和贮存多糖；根据来源来分，有动物多糖、植物多糖、藻类多糖和微生物多糖2，。1.1.1 植物多糖植物多糖广泛分布在植物的根、茎、叶、花、果实和种子中.从各种中草药和其它一些植物中都可以提取分离出多糖。我国近几年对植物多糖,尤其是具有中国特色的中草药多糖的药物活性已有了广泛的报道,例如：报道可降血糖的中草药已有一百多种，其中有显效的有20多种，其它如具有抗肿瘤、抗衰老、抗病毒、抗辐射、抗凝血等药物活性的报道很多，但弄清结构说明构效关系的尚少见5，6。植物多糖按照传统习惯可分为细胞内贮存多糖、纤维素、果胶、半纤维素、树胶和粘胶等。细胞内贮存多糖是代谢底物的备用材料,主要是淀粉，在小麦、大米等谷物以及植物的种子中大量存在，此外,还有一些非淀粉贮存多糖，如甘露聚糖和果聚糖，甘露聚糖主要存在于单子叶植物细胞中，果聚糖在单子叶和双子叶植物植物细胞中都有。纤维素是以（4)糖苷键组成的大分子多糖，不溶于水及一般有机溶剂,是细胞壁的主要成分,是自然界中产量最大、分布最广的高分子物质.果胶是一类主要由半乳糖醛酸及其甲酯缩合而成的多糖类成分，存在于植物的细胞壁和细胞内层,为内部细胞的支撑物质.半纤维素是植物细胞壁构成纤维素小纤维间的间质凝胶的多糖群中除去果胶质以外的物质,是构成初生壁的主要成分。树胶是高等植物干枝受伤或者受到菌类侵袭后自伤口处分泌的物质,多是具有分支的杂多糖。黏胶是与树胶类似的一种多糖,主要存在于高等植物的根皮、叶片、花朵等部位7，。11.2 动物多糖动物多糖存在和分布极为广泛，几乎存在于所有的动物组织器官中，主要存在于动物结缔组织基质和细胞间质中.动物多糖主要分为糖原、糖蛋白、糖胺聚糖和壳聚糖9。糖原又称动物淀粉，主要以颗粒形式存在于动物细胞的胞液内，是动物体内糖的贮存形式。糖蛋白是一种结合蛋白，其中非蛋白部分为糖类物质，并以共价键蛋白质连接,包括一些激素、载体、凝集素、抗体和酶等。糖胺聚糖是由重复的二糖单位构成的长链多糖，其中一个是糖醛酸,一个是氨基己糖.常见的有透明质酸、硫酸软骨素、硫酸角质素等。壳聚糖是一种碱性多糖，其化学名称为聚葡萄糖胺，是由线性聚合物甲壳素脱乙酰后的产物1,11。1.。海藻多糖海藻是海洋生物资源的重要组成部分，主要分为四大类蓝藻、绿藻、红藻和褐藻。海藻多糖系海藻中所含的各种高分子碳水化合物，都是水溶性的,具有高粘度或凝固能力，这些海藻多糖也称为海藻胶，是一类多组分的混合物，由不同的单糖基通过糖苷键相连而成，是海藻细胞间和细胞内所含的各种高分子碳水化合物的总称12. 根据来源不同,海藻多糖分为绿藻多糖、红藻多糖和褐藻多糖等，其中褐藻多糖的种类和数量最多1.自1881年英国人tafrd从褐藻中发现褐藻胶以来,人们又从红藻中分离出不同类型的卡拉胶、红藻淀粉等；从褐藻中发现褐藻淀粉和褐藻糖胶等。海藻多糖大多含有硫酸根,其作为抗血栓药物已被大家所公认，如褐藻多糖硫酸酯对血栓形成具有抑制作用，该作用可能与抑制血小板有关。因此从海藻多糖中寻找抗血栓药物具有很好的前景1。1.1. 微生物多糖微生物多糖是细菌、真菌、蓝藻等微生物在代谢过程中产生的对微生物具有保护作用的生物高分子聚合物，是研究的比较详细的一类多糖。与动物和植物多糖相比，微生物多糖具有它们相似的性质，而且其产量和质量不受自然条件的影响.因为其安全无毒、理化性质独特等优良性质而备受关注15。表11。列举了几种微生物产生的多糖种类及其组成。习惯上把微生物多糖分为细胞壁多糖、细胞内多糖、细胞外多糖三类,其中胞外多糖是由微生物大量产生的细胞外的多糖，易与菌体分离，可通过进一步发.1。1一些微生物胞外多糖及组成Table 1。1。1 ome iroba exopolysacchrorids andcomponents多糖产生菌多糖名称组成anthomonacampestri黄原胶葡萄糖、甘露糖、葡萄糖醛酸ureobaidi ullulans普鲁兰麦芽三糖seomonsloden结冷胶鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖Sphinomnas sp威兰胶葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、Arbacteimp。可得然葡萄糖酵实现工业化生产16。胞外多糖又可分为均一性多糖(如普鲁兰、可得然等）和杂多糖（如黄原胶、结冷胶等）17。目前产量比较大，已经实现工业化的胞外多糖如黄原胶、结冷胶、普鲁兰等。随着科学技术的进步与发展，微生物胞外多糖因其具有安全无毒，理化性质独特,生产周期短,不受季节、地域和病虫害条件的影响等优良性质,在工业生产与生活的许多领域已经得到广泛的应用和关注，如作为生物絮凝剂、食品添加剂、保鲜剂、抗癌医药品、包装材料等，具有广泛的应用价值18。1。2 微生物胞外多糖的生物活性随着人们对多糖的深入研究，发现多糖具有许多生物活性，而微生物胞外多糖是多糖的一种，同样也具有这些活性，如免疫调节、降血糖、降血脂、抗病毒、抗氧化、抗辐射、抗凝血等。因此，微生物胞外多糖也越来越收到国内外研究者的关注。1.1 免疫调节活性研究表明,目前发现的大多数多糖,都具有一定的免疫调节活性，是一类非特异性的免疫调节剂。微生物多糖是一类带有多种复杂基因的生物聚合物，它能作为免疫增强剂激活动物的非特异性免疫系统,在许多动物疾病模型中,微生物多糖作为免疫促进剂的研究报道较多。一些微生物多糖具有促进体液免疫反应的作用，如研究证实乳酸菌胞外多糖能提高荷瘤小鼠的脾细胞形成特异性抗体的能力，与环磷酰胺联合使用能在一定程度上减轻由环磷酰胺引起的荷瘤小鼠特异性免疫力的降低9。另外胞外多糖还能够促进细胞因子的释放和产生。干扰素(FN）是最早发现的细胞因子,具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节、控制细胞增殖等重要作用。卡介菌多糖核酸在外周血单个核细胞的体外培养中,可以明显提高FN的产生20。一些胞外多糖也具有促进IL-2产生的能力，如从海洋真菌草茎点霉(Phoma herbaum）YS418中分离得到的真菌多糖PC在体外能够显著提高淋巴细胞增殖反应，显著增加细胞上清液中IL-2和IFN-的浓度1。12 抗肿瘤活性抗肿瘤活性是目前分离鉴定的大部分多糖都具有的活性之一,目前许多真菌多糖被报道作为抗肿瘤作用方面的研究比较多，如香菇多糖、灵芝多糖23等都报道有较好的抗肿瘤活性，如有报道研究羊肚菌胞外多糖对S180荷瘤小鼠的抗肿瘤作用，发现该菌所产的胞外多糖能够显著提高荷瘤小鼠的脾脏指数、T-淋巴细胞百分率和巨噬细胞吞噬率,并且可以显著延长荷瘤小鼠的存活时间2.还有学者报道了根瘤菌2（Riobium p61）产生的胞外多糖,nthomonas cme菌产生的黄原胶26等都具有一定的抗肿瘤活性。1。2。3降血糖和降血脂作用糖尿病是当前危害人类尤其是中老年人身体健康的主要顽疾之一,被冠之为“沉默的杀手”,是由于体内胰岛素绝对或者相对分泌不足造成的以糖、脂肪、蛋白质等代谢紊乱为主的一种内分泌性疾病27.因此,围绕抗糖尿病药物的研究是当前新药研发的重要领域.如今发现的大多数多糖都具有一定的降血糖降血脂作用，如当归多糖可以明显降低型糖尿病大鼠的血糖，并呈现时间和剂量依赖关系。如Agrobaterium sp.ZX09菌28所产的胞外多糖索拉胶对小鼠的餐后血糖有抑制作用,对糖尿病模型小鼠的血糖也有降血糖的功能.另外，已有研究报道，酵母葡聚糖29有降低血脂的功效。2.4 抗氧化活性活性氧主要是指氧自由基及其活性衍生物，包括超氧阴离子、羟基自由基、过氧化氢等,它们是人体内正常代谢的中间产物，参与许多重要的生命过程。在正常生理状态下,机体的自由基清除系统可使自由基的产生和消除保持在极低的动态平衡水平上，对机体是有利的。而当细胞中的活性氧浓度很高的时候,就会引起生物膜脂质过氧化，细胞内蛋白及酶变性，导致DA损伤等，从而会引起与氧化损伤相关的各种细胞病变。如癌症,心血管病、衰老、糖尿病等30，因此寻找抗氧化剂清除自由基,提高机体的抗氧化能力是医药界始终关注的重点。自从mmr提出衰老的自由基学说以来，发现了许多多糖具有抗氧化活性，为开发新型抗氧化剂开辟了一条途径.Ar1等人报道细杆菌属Microcterim terreggen 产生的胞外多糖能清除PPH自由基。Lu32等人报道的来自植物内生菌类芽孢菌属(Paenibacills pomya）产生的胞外多糖对超氧自由基、羟基自由基、双氧水、DPH的清除能力都很好，而且对金属离子也有很强的螯合能力，脂质的过氧化抑制能力也很强.Su33等人从海洋中分离出的Kssleiell p。 4108菌对超氧自由基有较高的清除活性。1. 微生物胞外多糖的应用微生物胞外多糖是近几十年来陆续开发研究的、由微生物在生长过程合成并分泌到细胞外的一种高分子聚合物,因其具有独特的生理活性和多种多样的生物活性，而被广泛应用于医疗、食品、化妆品、环境、工业等各种行业。31 胞外多糖在医疗方面的应用长期以来,人类与疾病抗争，并不断不断探索疗效好、毒性低的新药,常规化的化学药品存在新药开发费用高、周期长、投入大、具有毒副作用等一系列问题。近年来医药界更关注从天然产物中发现具有生理活性的有效成分直接用作临床药物，或将其主结构作为先导化合物，进一步研究其各种衍生物,使其尽快发展成一类新药。而多糖作为自然界中含量最丰富的生物聚合物，几乎存在于所有的生物中,这无疑为它的广泛利用提供了条件。微生物胞外多糖,因为不受地域环境的限制,生产起来比较方便,研究费用相对较低,而且具有高粘度、无毒副作用等优良性能而被医学界广泛研究。如右旋糖苷和羟乙基淀粉，因其具有高亲水性、无毒无抗原性;在体内可被降解;无凝血效应等;而被作为血容扩张剂在临床上广泛应用。一些细菌多糖因为具有抗原决定基,利用这种性质可以制备相应的多糖疫苗，如已经在临床上应用的诸如预防脑膜炎的enigoocal C型多糖疫苗34、ACYW1型疫苗35、肺炎链球菌多糖疫苗、流感嗜血杆菌Hi多糖疫苗7,以及正在研究中的B型链球菌及伤寒沙门菌的多糖疫苗等,均可刺激机体产生针对相关菌株的抗体，用于疾病的防治。据Oktani38等人的报道，从海洋弧菌和假单胞菌中分离出的胞外多糖具有抗肿瘤、抗病毒和增强免疫等功能。lec39等人从Aleomonasifern菌中分离出一种类似肝素的多糖，发现该胞外多糖具有抗凝血的作用.还有一些胞外多糖被用作生物药物载体，如黄原胶等,还可以作为辅助材料制作生物膜作用于人工皮肤或手术用线。因此,在医学领域，多糖表现出了非常好的开发应用前景,在未来的研究中，围绕多糖展开的新药开发仍然具有巨大的潜力。1。3。2胞外多糖在食品行业的应用为改善食品的品质和色、香、味、形、营养价值以及因为保存或加工工艺的需要而加入食品中的化学合成或者天然的物质称为食品添加剂.在食品“回归自然”的趋势下，天然的食品添加剂被认为是发展的大趋势.目前被用作食品添加剂的微生物胞外多糖居多,如黄原胶、结冷胶、普鲁兰多糖等,因为它们具有长链和多羟基结构，使得其具有良好的两亲性和稳定性等特点,可作为乳化剂、增稠剂、稳定剂等使用。黄原胶最初是在19年由美国农业部伊利诺伊州皮奥里尔北部研究所分离得到的。黄原胶是由Xahoonas campetris4 菌以糖为主要原料,经发酵制得的一种酸性胞外杂多糖，可溶于冷水和热水中，具有高粘度、高耐酸碱盐、高耐热、悬浮性和触变性等特点，常被作为增稠剂、悬浮剂、乳化剂和稳定剂等使用。美国食品与药物管理局于199年批准黄原胶用于食品中,198年联合国粮食及农业组织批准黄原胶作为世界范围内使用的食品添加剂,且对加入量不做限制。结冷胶41是美国Klo公司0世纪年代开发的一种微生物食用胶，它是由伊乐藻假单胞菌属(Pseuomonas eloden）在中性条件下,以葡萄糖为碳源,硝酸铵为氮源,在一些无机盐所配置的液体培养基中，经有氧发酵而产生的细胞外多糖,是一种新型凝胶剂.据Lin andasia2等人的报道，结冷胶有着用量小、透明度高、香气释放能力强等特点,在乳制品中，可以取代卡拉胶、明胶和果胶的使用。在焙烤制品中还可以取代琼脂。结冷胶作为微生物代谢胶，生产周期短,不受气候和地理影响，可以在人工控制条件下利用各种废渣、废液进行生产，再加上其安全无毒，在食品行业中有着广泛的应用前景.Asaputrnd Shh43等人从Spingmona paumobilis中分离出了一种粘性胞外多糖,发现这种多糖与商业化的多糖,如卡拉胶、黄原胶等相比,有更好的乳化效果.Iyer44等人从海洋的一种菌的发酵液中分离得到的胞外多糖也具有很好的乳化效果.总结多糖的优良性能，在食品行业，胞外多糖的研究日益受到关注,作为食品添加剂，胞外多糖有很大的发展前景。1.3。3胞外多糖在化妆品方面的应用随着科技的快速进步，人们自我生活水平的提高，人们追求无毒副作用、无刺激的美容产品的意识也在逐渐的加强。胞外多糖是微生物分泌到细胞外的一种高分子碳水化合物，它具有大量的羟基，使其具有很好的吸水性能，而且多糖也具有抗氧化性能，能够清除自由基,起到抗衰老的作用.因此多糖作为新型的保湿、抗衰老物质被大量应用于化妆品行业45。传统的保湿剂主要是甘油、丙二醇、丁二醇等由化学方法合成的保湿剂，多糖类的保湿剂,目前应用最多的主要是透明质酸、肝素、硫酸软骨素等.据报道甘油具有良好的吸水性能,但很明显在低湿度环境下,甘油的保湿效果与其它类多糖相比下降速率更快;丙二醇和丁二醇也是常用的保湿剂，但它们浓度高时会引起刺激反应6。透明质酸是一种新型的多糖类保湿剂，它主要由N-乙酰葡萄糖胺和-葡萄糖醛酸组成的酸性多糖,在世纪80年代就已经受到国内外化妆品界的广泛关注,并被大量应用于化妆品的研究47.肝素48也是一种有葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸组成的黏多糖硫酸酯,能够增加皮肤血管的通透性、改善血液循环、增强吸水保湿等功能.但它们也存在一定的问题,如分子量大，皮肤吸收困难,提取困难，研究费用高等，都不利于化妆品行业的发展。Zao49等人从Peuoona fluorecn PGM37分离出一种胞外多糖，发现该多糖是一种由甘露糖和葡萄糖组成的杂多糖，与透明质酸和甘油相比，具有较好的吸水保湿和抗氧化性能，可以作为化妆品成分的研究,而且发酵起来比较容易，价格便宜,不受外界条件的限制，具有很好的发展前景.因此开发新的微生物胞外多糖来发展化妆品是未来化妆品行业的主流，对满足人们无毒、无刺激、纯天然的化妆品追求有很大的潜力。13。4胞外多糖在环境方面的应用 随着人类社会的发展,我们生活的环境越来越差，各种污染越来越严重，特别是我们赖以生存的生命之源水，水中有大量的难以降解的化学物质和重金属，给人类的健康带来严重的威胁。一些研究者发现许多微生物胞外多糖能够捕捉水中的重金属离子,使其产生沉淀，进而使水源得到净化。Nkaura50等人从污泥中分离出一种酱油曲霉,发现其所产的胞外多糖具有良好的絮凝作用。aitaAguilera51，52等人分离得到的enibacillus jamlae sp菌所产的胞外多糖能够加速橄榄油废水中的杂质的沉降，提高污水净化的效果,也能够进一步降解污水中的油类物质。1.4 本课题的目的、意义及主要研究内容1.41 课题的目的和意义近些年，多糖作为化妆品的有效成分被研究成为了一个焦点。目前国内外对多糖在化妆品行业的研究已经有很多,如植物多糖中的当归多糖、芦荟多糖、仙人掌多糖等,动物多糖中的透明质酸、硫酸软骨素、肝素等，但多糖的提取和纯化过程比较繁琐，结构复杂等，使得多糖的价格非常昂贵，导致了多糖在化妆品行业的发展受到了一定的限制。而微生物胞外多糖的生产不受地理环境的约束，人工可控制操作,效率高且无毒副作用,因此在化妆品行业胞外多糖将有巨大的应用和发展空间.14。2主要研究内容本实验室从河南红土农田中发现的新菌株ZC01，可以利用多种碳源产一种纯白色的胞外多糖，由此，进行了一下一系列工作：（1)对ZC0菌进行系统鉴定，通过形态观察，革兰氏染色，NA提取，6S测序等实验,来鉴定菌种类型,确定了它的分类学地位。（2)对该菌株产胞外多糖的发酵条件进行优化，确定其最优发酵条件。(3）制备ZC0胞外多糖,经过去蛋白、分离纯化，然后通过气相色谱、红外、核磁等仪器进行分析,分析多糖的结构。（4）对该胞外多糖的生物活性进行研究，初步通过体外测定它的吸水保湿和抗氧化性能来研究它在化妆品方面的应用.类芽孢杆菌01胞外多糖的初步鉴定从河南的红土地中分离得到一株新的菌株C01，该菌的菌落形态特别,能利用淀粉分泌大量的胞外产物.为了对这株菌进行系统的鉴定,我们研究了该菌株的形态特征,并结合菌株的16S rDN序列的测定和比较，确定了它的分类学地位。2.材料与方法。1.主要试剂1。菌种培养（1)所用试剂：磷酸二氢钾、无水氯化钙、无水硫酸镁、氯化亚铁、硝酸钠、氯化钠、盐酸、氢氧化钠等均为分析纯；琼脂、蔗糖，玉米淀粉，可溶性淀粉等为生化试剂。将氯化钠配制成生理盐水(0.氯化钠).将盐酸和氢氧化钠分别配制成mol 盐酸和2mll氢氧化钠，用于调培养基的pH值。(2）培养基的配置初筛固体培养基：磷酸二氢钾g/L,无水氯化钙0.1g/,六水合氯化镁0。3g/，硫酸亚铁.125 g/L，硝酸钾2 /L,蔗糖2 /L，琼脂,H 7。7。种子培养基：磷酸二氢钾1gL,磷酸氢二钠1g/L，无水氯化钙0。1g,六水合氯化镁0.3g/L，硫酸亚铁015 g/L,硝酸钾g/L,蔗糖2 g，pH 。-.2。初始发酵培养基：磷酸二氢钾1 g/L，磷酸氢二钠 g，无水氯化钙0.1g/L，六水合氯化镁03/L，硫酸亚铁00125g/，蛋白胨2 /L，硫酸锰000g/，氯化锌0。0 /L，蔗糖0 g/L ,p 7。-7.2.以上培养基均需121灭菌20 .LB培养基:蛋白胨 g，酵母粉5 ，氯化钠0 ,水00 l，H调至。5。2。1。1。2 ZC0菌种的鉴定(1）革兰氏染色实验：主要试剂：结晶紫，草酸铵，碘，碘化钾,乙醇，番红。（2)胞外产物性质的确定：5乙醇90%苯酚溶液:取90Ml苯酚溶液，加入10M的去离子水，室温下保存备用;9%苯酚溶液：取3Ml9苯酚溶液，加去离子水至30Ml,注意该溶液要现用现配浓硫酸（3)DNA的提取：Karroten微生物N提取试剂盒，琼脂糖,溴化乙锭(E)，溴酚蓝(4）6SRna序列分析:10扩增缓冲液，Taq DNA聚合酶 U/,Dnp混合液2。5m， MgCl2 25Mm;聚合酶链式反应引物（00 ng/l）由上海英俊生物技术公司合成，序列为：orwad AGAGTGATCCTGGCTCAGverse GGTACCTGTTCGA2。1.2主要仪器表.1. 实验常用仪器设备Table2.1. Exerimeal quipent仪器名称型号生产厂家电子天平Y02上海浦春仪器有限公司分析天平A004上海良平仪器仪表计B1Saroriu高速离心机Hiachi，RX日本立式压力蒸汽灭菌器XQ-S50 SII上海博迅实业有限公司超净工作台 W-CJ1FD江苏苏净电泳仪Tanon上海酶标仪Powr ave XSiTe微量高速离心机-14Sia超声破碎仪KS-130宁波科生真空干燥箱索谱,DZF-6021上海智能数显恒温水浴锅HH4巩义市予华仪器恒温振荡器华利达，Z911江苏太仓隔水式恒温培养箱G-9050 MBE上海博迅实业有限公司自动凝胶图像分析仪S-80上海培清数显电热鼓风干燥箱01A上海卓爵C仪S100Bioad移液器ppendof德国水平摇床0海门市其林贝尔仪器匀浆机T 10 S25IKA生化培养箱2B江苏金坛市宏华仪器厂恒温金属浴J-400A上海健生2.1。3菌种筛选来源本实验中的土样是来自全国各地的特殊土质，经过滤纸片的筛选,从来自河南某地的红色泥土中筛选出一株看似光滑的菌。土壤样品预处理方法：剪取适量大小的滤纸片，灭菌后放入已凝固好的初筛固体培养基平板中；称取5g土样放在滤纸中央；将平板放在恒温培养箱培养57天，发现滤纸片由白色变得发黄，然后将滤纸取下来放入10l生理盐水中浸泡，震荡，静置，最后取上清液稀释涂布在初筛固体培养基平板上,置于8恒温培养箱培养23天。经过多次筛选得到本实验所研究菌株。.14Z01 菌的初步鉴定方法2。4.1菌体形态的观察滴加少量灭过菌的生理盐水在干净的载玻片上,用接种环挑取固体培养基平板上的单菌落,充分涂抹到载玻片上,制成菌体悬浊液，盖上盖玻片，将其在酒精灯火焰上微微加热,冷却，然后放于荧光显微镜下观察。2。14。2革兰氏染色5分别用固体培养基和培养基培养C0菌和大肠杆菌（革兰氏阴性）单菌落.以大肠杆菌为对照，对该菌进行革兰氏染色分析。具体实验步骤如下:（1)涂片取洁净的载玻片一张,在载玻片两端部位隔一定距离分别滴加一滴无菌生理盐水，用接种环从平板上分别挑取ZC菌株和大肠杆菌的少量菌体与无菌生理盐水混合；再用灭过菌的接种环分别将菌体涂成直径约1cm的均匀薄层。注意取菌量不应过大，以免造成菌体重叠。（2)干燥在载玻片上涂布菌体后，待其自然干燥.(3)固定 将已经干燥的涂片向上，在酒精灯火焰上通过3次进行固定。(4）染色 在涂菌薄层上滴加一滴草酸铵结晶紫染液（染液需盖满涂菌部分），染色2 mn。斜置载玻片,倾去染液，用蒸馏水轻轻洗去残留染液，至流水无色。媒染 向载玻片涂菌薄层上滴加革氏碘液冲去残水并用碘液覆盖mn,再用水洗去碘液至流水无色。脱色将玻片上的水用吸水纸吸取，用移液枪滴加乙醇脱色(持续30秒）.稍后立即用水冲洗乙醇，并用滤纸轻轻吸干.复染 蕃红染液复染2in，水洗，并用滤纸轻轻吸干残留的水渍。(8）镜检将制好的载玻片放至显微镜下观察。 .1.3菌株DNA的提取以及16S rDNA序列分析（1）菌体培养本论文所用的种子培养基培养Z01菌株,8，20液体培养1-18h，获得足够多的菌体.(2)A提取方法（按照试剂盒说明)取15 mL菌液于15L离心管中,1200 rm离心1mn,去掉上清液，收集菌体加KL1 。mL，溶解菌体，使菌裂解完全，1600p离心30s。取平衡柱一个，加0的K于平衡柱中，1100rpm 离心1mn。柱子下端废液倒掉，将的菌体裂解液分两次加入柱子中,每次加00uL，1100pm离心0，第二次重复100rpm离心2in；洗涤，向平衡柱中加70的乙醇70u，将柱子上的杂质洗掉，11000离心1i，弃去下端液体后100r空转n,将柱子放入新的.5m离心管中；洗脱 加5uLKE于平衡柱中，然后65水浴10min;10rm离心1min,即可获得菌体DN，-20以下放置备用。（3）ZC01菌的1S rDNA基因PCR扩增PCR反应体系如下54：DWtr 13.4 l、 10扩增缓冲液2 l、MgCl2 2、10mmol dNTP混合液0。5 l、正向和反向引物各.5 、Taq聚合酶.1l、DA模版1l。CR反应条件设计为:变性5in；9变性3s、5退火1 in、延伸mi、35个循环；72延伸0min。得到的PR产物用1%琼脂糖凝胶电泳，并用DNA Mark片段作为对照，然后进行胶回收.CR产物胶回收步骤:切胶,将含DA片段的一段胶切下来,注意越薄越好；先向平衡柱中加入00u K,10000rpm离心30s,再加入4L KG平衡柱子,10000pm离心30；将胶切碎,放入15mL离心管中，加入500u KG融胶，52水浴约1min,使胶融化完全；将融化的液体加入柱子,100rpm离心1mn；柱子下端弃液倒掉，加00L70的乙醇洗去柱子上的杂质，000rm离心30s，然后弃去废液，13000rm离心min；取2uL 0mo的Tis-Hcl,pH8。0，加入柱子1000rpm离心1min；获得的即为纯化后的CR产物,取2uL跑凝胶电泳。TA克隆步骤56：酶连 1uL 反应体系如下：T4 Bufer1uL、载体1L、4连接酶05u、PR产物。5uL、灭菌水6uL，混合后14连接2-16h,即得到酶连产物;转化将酶连产物与买来的大肠杆菌感受态混合，冰浴30in，立马放入42水浴1mi，立即取出再冰浴min，加入0L LB，37摇床1，然后50pm离心5min,将上清吸去00uL，剩余的用枪轻轻吹打，然后涂布在有氨苄抗体的L平板上，进行蓝白斑筛选；测序待上述平板长出白斑单菌落后，用接种针挑取单菌落,液体LB摇菌过夜，吸取1。5菌液送至上海桑尼测序。1.4。4菌株的1SD系统发育分析 将菌株基因序列通过Pubmed的BLAST检索系统序列同源性比对，从enBank数据库中获得的同源性最近菌株的基因序列进行多序列匹配排列，下载后再采用MAGE.软件构建分支系统树57。21.菌种的保藏2.1.1 斜面保藏方法 在斜面的固体培养基上划线接种后，28培养至长出明显的菌落，放入20冰箱保存。2。.。2 30甘油低温保藏 首先将甘油灭菌后,放在室温下冷却，4冰箱保存。使用时，吸取菌液700uL,然后加入30u甘油，使溶液甘油终浓度达到%，混匀后放入 -80冰箱保存,以备使用。2。胞外产物性质的确定 本实验所用的发酵培养基,用接种环挑H1单菌落接种,然后放入震荡恒温培养箱发酵4后,向发酵液中加入倍体积以上的酒精，7000g离心0min，将所得沉淀烘干（40），然后溶于水，参照DBs 等人的方法将胞外产物溶液与苯酚、浓硫酸按体积比1：:5进行反应，若反应液呈现橙红色，证明胞外产物是一种多糖物质。. 结果与讨论2.2。1菌种的培养 A B图11 ZC1菌株在平板上的菌落形态gur2。2.1 Coloies fZC01 strain,C0菌株形成单菌落(3-4天);B,ZC01菌株菌落形成后加适量碘液 图2.。1。1的A图是ZC01菌在淀粉平板上34天后形成的单菌落,B图是在A图的基础上,向平板中加入了少量的碘液,使平板呈蓝色，并明显观察到菌落周围的透明圈.由图可看出,菌落为圆形，表面光滑，呈微黄色；在菌体周围有粘性的胞外物质产生，随着培养时间的加长，胞外产物不断增多。当生长到一定时间，菌落便会长满整个平板。2.2菌株的初步鉴定由显微镜拍摄照片观察发现，Z1菌细胞呈短杆状，革兰氏染色实验结果，如图2。.21所示，在显微镜下观察，发现菌体被染成红色,菌体本身呈杆状,比大肠杆菌要大许多,由此可知该菌为革兰氏阴性菌.该菌发酵所产的胞外产物,具有粘性,是一种高分子聚合物。通过苯酚硫酸法实验的结果显示，这种高分子产物与苯酚、硫酸反映后呈红褐色,证明ZC0菌的胞外产物为多糖。图2。2。2.1 Z1菌革兰氏染色显微镜下图片（0倍）Fgure2。2。2.1Ga stanig o C01 stri undr a coscpe22.3ZC0菌的D提取和PCR实验1 图2。2。3。1ZC0菌DNA电泳图和16SDNA PCR电泳图Figur2.23。1 ElectrophregramofNA andCR amplifiationrm ZC01srin图223。1中为DN电泳图,2为16S PCR电泳图，从图中可看出ZC0菌抽提的总DNA电泳显示为一条整齐的带,PC扩增电泳结果显示片段大小为1。5K.PR扩增产物胶回收和克隆后,送至上海桑尼测序,测序的结果如图2。2.3所示:GGTCAGCGATCTATCTTCGGGTAAGGTTACGGGACGGGTGTACACGAGTCTGCCTGTAAGACCGGGATACTTCGAAGATGCTATACGTGCGGTTTGCTGCATAGCATCGGAAAGAGGTCAAGCTTACTTAGATGGCCTGCGGCATTACTGTTGTGGGGAACGCCCAGCGAGATCGAGCGACCTGAGAGTGATCGACGACGGACAGGCCAACCAGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGCAAGGACGAAGTCTGACAGCAGCCGCGAGTGTGAGTTTTCGGACTAAGCTCTTTGCCAGGAAGACGAGTGAAGAACTGTCTGCTTGACGTACCGAAAGAAGCCCGCTAACTACGTGCCAGGCCGCGGTAAACGTAGGGGCAGCGTTGTCCGGAATTGGCTAAAGCGCGCAGGTTTTGTAAGTCAGGTGTTAATCTGGGGCTCAACCCCGATTGTCTACCAAGACTTGAGTCAGAGAGGAAAGGTTCCACGTGGGGTGAATGCGAGAGTTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGGACTTTGGCTGATACGCTGAGCCAAAGCGGGGGAGAAACAGATAGATACCCTGGTAGTCCACGCCAAACGATGAATGTAGTGTAGGGTTCACCCTGGGCCGAGTAACAATTAAACGCTGGGAGACGCGCAAGTGAAACTAGGATGACGGGACCGCACAGCATGAGTTGTGGTTTATCAAGCAACGCAAGACCTTAAGGCTGACTCCTTATTCTGAGAAAGGCTCGGGACAGGAGACGTGGCATGGTTCGTAGCCGTCGTGGAGTGGGTAAGTCCAAGAGCGACCTTATTTTAGTTGCACACTTCGGTGGCACTCTAAGACTCGGTGAAAACCGAGGAGGGGGGTGACGCAAATCATCTGCCCCTATGACCTGGGCTACACACGTCTACAATGGGTACAACGGGAGGAAAGAGGATCTGGACGAATCCAAAGGGGTCTCATTGGATTGAGTGCTCCCTGTAGTCGGATTGCTATTCGCGACAGATCGGGGAAACGTCGGCTTGTACACCCGAACCGAGAGTTCAACACCGAAGGGGGGTAACCGCAAGGAGCCAGGTCGA图2。2。32 01菌16rDA测序序列Figure .32 16SrA genestrig