皮蛋的微生物菌相检测

皮蛋的微生物菌相检测摘要：本实验目的是检测各种品牌皮蛋中的微生物菌落是否符合国家食品卫生标准。结果表明，皮蛋中主要含有酵母菌、细菌、乳酸菌和放线菌；其中湖北洞庭湖皮蛋、光阳皮蛋、鲁星皮蛋、鸟王皮蛋、荆门蛟龙皮蛋符合国家标准；每克三湖松花皮蛋、湖鸭松花皮蛋和福庆成皮蛋中的细菌数超标，不符合国家食品卫生标准；每克湖鸭松花皮蛋中的菌落总数超标，不符合国家食品卫生标准。关键词: 皮蛋; 细菌; 酵母菌; 放线菌; 菌落总数 0目 录前言11 实验方法1 1.1 设备和材料2 1.1.1 实验材料2 1.1.2 试剂2 1.1.3 主要实验仪器2 1.2 牛肉膏蛋白胨培养基配制2 1.2.1 配方及配量3 1.2.2 配制步骤3 1.3 操作步骤3 1.3.1 检样稀释及培养3 1.3.2 浇注平板3 1.3.3 倒置培养3 1.4 菌落计数的原则3 1.5 菌落的计算方法42 结果和分析4 2.1 不同品牌皮蛋中酵母菌菌落检测结果4 2.2 不同品牌皮蛋中疑似乳酸菌菌落的检测结果5 2.3 不同品牌皮蛋中细菌菌落检测结果5 2.4 不同品牌皮蛋中放线菌菌落的检测结果5 2.5 不同品牌皮蛋中菌落总数的检测结果63 结论6参考文献7致谢9前言 皮蛋拥有众多名称，如松花蛋、变蛋等，是我国具有悠久历史的一种风味蛋制品，不仅受到国内消费者的青睐，在国际市场上也享有盛名。皮蛋，不但是种美味食品，而且还可以作为药用。中医认为皮蛋性凉，可以用来治疗眼睛疼、牙齿疼、高血压、耳鸣眩晕等疾病。为了检测其是否符合国家食品卫生标准，我们用最简单的方法对皮蛋微生物菌群进行生物检测1。最常有的检验微生物菌群的方法是浇注平板法2，它是将待分离的试样用缓冲液做梯度系列稀释后，在无菌环境中将几个合适稀释度的少量菌悬液加至无菌培养皿中，然后立即倾入融化的培养基，经充分混匀后，置于适宜温度下培养。最后可以从其内层和表面出现的许多菌落中，根据菌落形态进行计数并进一步纯化的方法。该法不仅可以用于菌种的分离纯化，还可以用于菌落计数3。 菌落形态是判断微生物种类的主要依据4。在固体培养基表面形成的酵母菌的菌落一般都有较易区分的特点，比如菌落表面较光滑、较透明、较湿润、容易挑起、颜色均一及菌落质地均匀等，但由于酵母菌具有细胞体积较大以及不能在固体培养基中移动等特点，所以在培养基上的表现就是菌落较厚、较大和外观较稠5。此外，酵母菌菌落的色彩一般较单一，大多数都呈乳白色。可以利用乳糖、葡萄糖等发酵性糖 ,并使这些发酵性糖转变成乳酸的无芽孢、革兰氏染色呈阳性的细菌称为乳酸菌。常见的乳酸菌反应在宏观上上表现为个体较小的圆形菌落,直径大约 13 mm，微微隆起，表面较光滑等特点，颜色多数呈现乳白色，且生长缓慢 6。霉菌是真核生物中的一种，菌落是由分支状菌丝体组成，形成的菌落在培养基上主要表现为外观干燥、不透明、较大、较疏松、形态多样以及菌落不易被挑起7。某些霉菌的菌丝生长很快，且随着年龄的增长会形成具有一定形状、结构和不同颜色的孢子，所以霉菌往往很容易鉴别。 细菌因其是单细胞生长，所以细胞较小，故形成的菌落一般也较小、较湿润、较薄、较透明、易挑起并较“细腻”。不同的细菌还会产生不同的色素，形成不同颜色的菌落。有的细菌还会在生长过程中产生较多有机酸或着蛋白质分解物，这使得菌落常常有一股酸败味或腐臭味。 放线菌菌落均有形态较小，菌丝细而致密，表面呈粉状。色彩较丰富，不易挑起以及菌落边缘的培养基出现凹陷状等特征。 1 实验方法1.1 设备和材料1.1.1 实验材料实验材料表品牌名生产商福庆成皮蛋太原市福庆成食品有限公司鸟王松花皮蛋湖北神丹健康食品有限公司湖北特产洞庭湖皮蛋 湖北洞庭湖公司湖鸭松花皮蛋湖北荆江蛋业有限公司三湖松花皮蛋高邮市三湖蛋品有限公司鲁星皮蛋 鲁星蛋业有限公司荆门蛟龙松花鸭皮蛋荆门蛟龙食品有限公司光阳皮蛋 福建光阳蛋业股份有限公司 1.1.2 试剂试剂表试剂名生产商琼脂粉郑州郑亚化工产品有限公司盐酸成都化学试剂厂氯化钠成都化学试剂厂胰蛋白胨杭州微生物试剂有限公司牛肉膏山东梁山科鑫生物制品有限公司氢氧化钠上海恒邦化工科技有限公司1.1.3 主要实验仪器主要实验仪器表仪器型号制造商 超净工作台SW-CF上海博讯实业有限公司 电热鼓风干燥箱9070MBE上海博讯实业有限公司立式压力蒸汽灭菌锅YXQ-LS-SII上海博讯实业有限公司恒温水浴锅HH-S6常州恒睿仪器设备制造有限公司恒温恒湿培养箱LHP-160L常州恒睿仪器设备制造有限公司1.2 牛肉膏蛋白胨培养基配制1.2.1 配方及配量 牛肉膏 0.3 g，琼脂粉 1.5 g，蛋白胨 1g, NaCl 0.5 g，水 100 mL，pH 7.27.4 。1.2.2 配制步骤 按照培养基配方及其所需用量分别称取各药品。在烧杯中加入少量水，将各培养基成分（琼脂粉除外）逐个加入水中待溶。将烧杯放于石棉网上，将电炉调至小火加热。用玻璃棒不断搅拌，使各药品快速溶解，然后添加蒸馏水至配制培养基所需的量。此时配好的是微酸性的培养液，因此要用1mol/L NaOH 调节培养液pH至7.27.4。取250 mL三角瓶若干，分别装入上述配制好的培养液150 mL，然后每瓶中加入琼脂粉2.22.3g，待灭菌。将上述待灭菌的培养基放入高压蒸汽灭菌锅内，调节温度至121 灭菌20 min5。1.3 操作步骤1.3.1 检样稀释及培养 在无菌超净操作台中，称取皮蛋25 g，切碎并放于装有少量生理盐水的研钵内，经充分研磨后配制成1:10的均匀稀释液。用1001000 L灭菌移液枪吸取上述1:10稀释液1 mL后，沿试管壁将其缓缓注入含有9 mL生理盐水的试管中，充分混匀，配制成1:100的均匀稀释液。按上述操作步骤，再做一次10倍递增稀释液，最后稀释成1:1000的均匀稀释液。依据对皮蛋污染情况的估计，选择1:10皮蛋稀释液 ，1:100皮蛋稀释液，1:1000皮蛋稀释液，作为实验适宜稀释度。在进行到10倍递增稀释时，吸取1 mL的样品均匀稀释液加入到无菌平皿中，每个稀释度做两个平行。每个样品的实验都两个空白对照，分别吸取1 mL生理盐水加入到两个无菌平皿内即可8。1.3.2 浇注平板 取冷却至约46 的牛肉膏蛋白胨培养基（放于461 恒温水浴箱中保温）15 ml20 ml倾注平皿，轻轻摇动使其与菌液混匀。1.3.3 倒置培养 待琼脂凝固以后，将平板倒置过来，然后将其放入温度控制在361 下的恒温培养箱中培养482 h。1.4 菌落计数的原则 因菌落大小不一，所以大的菌落可直接用肉眼观察，而用肉眼不能辨别的菌落可用菌落计数器或放大镜。观察时需记录菌液稀释倍数及相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-forming units,CFU）表示。 选择无蔓延菌落生长的平板且平板菌落数在30 CFU300 CFU 之间的来计数菌落总数。菌落数少于30 CFU 的平板要记录下菌落总数，大于300 CFU 的平板可以记录为不可数。应按照两个平板的平均数来记录每一个稀释度的菌落数。 应该以没有片状菌落生长平板的菌落数作为相应稀释度的菌落数，如果在培养皿上有较大片状的菌落生长时，则不能采用；如果片状菌落大小不到平板的一半，而另一半中的菌落又生长均匀，便以半个平板菌落数乘以2来代表一个平板上的菌落数。 如果平板上出现了菌落之间模糊界线的链状生长时，则把每条单链作为一个菌落进行计数。1.5 菌落的计算方法 如果在适宜的菌落总数计数范围内只有一个稀释度平板相符合，则计算两个平板菌落数的平均值，再将这个平均值乘以相应的稀释倍数，把这当作每g样品中的菌落总数结果。如果有菌落数都在30 CFU300 CFU之间的两稀释度，则根据其比例定，如二者之比大于2则按照较小的数计算，反之则按照两者的平均数计算。如果所有稀释度的平均菌落总数均小于30 CFU，则按照稀释度最低的菌落总数乘以稀释倍数计数。如果所有稀释度的平菌落总数均大于300 CFU，则按照稀释度最高的菌落总数乘以其稀释倍数计数。如果所有的稀释度平板都没有出现菌落，则以小于1再乘以最小稀释倍数表示。如稀释倍数为10倍时，表示为10。如果全部菌液稀释度的菌落平均数都不在30300之间，假如其中的一部分都小于30或者都大于300，则就按照最接近30或300的平均数与所稀释的倍数相乘得出结论。2 结果和分析2.1 不同品牌皮蛋中酵母菌菌落检测结果 不同品牌皮蛋中酵母菌菌落检测结果见表1。表1 不同品牌皮蛋中酵母菌菌落数Table 1 The number of yeasts in all brands 皮蛋品牌洞庭湖皮蛋三湖松花皮蛋湖鸭松花皮蛋光阳皮蛋鲁星皮蛋福庆成皮蛋鸟王皮蛋荆门蛟龙皮蛋酵母菌数量20520535015025015030100由表1可知：湖鸭松花皮蛋中含有的酵母菌最多为350 CFU/g，其次为鲁星皮蛋、洞庭湖皮蛋、三湖松花皮蛋、光阳皮蛋、福庆成皮蛋；鸟王皮蛋中含有的酵母菌最少为30 CFU/g。2.2 不同品牌皮蛋中疑似乳酸菌菌落的检测结果 不同品牌皮蛋中疑似乳酸菌菌落的检测结果见表2。表2 不同品牌皮蛋中疑似乳酸菌菌落数Table 2 The number of lactobacillus in all brands 皮蛋品牌洞庭湖皮蛋三湖松花皮蛋湖鸭松花皮蛋光阳皮蛋鲁星皮蛋福庆成皮蛋鸟王皮蛋荆门蛟龙皮蛋乳酸菌数量2304002852001602408080由表2可知：三湖松花皮蛋中的疑似乳酸菌最多为400 CFU/g，其次为湖鸭松花皮蛋、福庆成皮蛋、洞庭湖皮蛋、光阳皮蛋；鸟王皮蛋和荆门蛟龙皮蛋中的疑似乳酸菌最少为80 CFU/g 。2.3 不同品牌皮蛋中细菌菌落检测结果 不同品牌皮蛋中细菌菌落检测结果见表3。表3 不同品牌皮蛋中细菌菌落数Table 3 The number of bacterial in all brands 皮蛋品牌洞庭湖皮蛋三湖松花皮蛋湖鸭松花皮蛋光阳皮蛋鲁星皮蛋福庆成皮蛋鸟王皮蛋荆门蛟龙皮蛋细菌数量495630 525445425625210240 由表3可知：三湖松花皮蛋中的疑似细菌最多为630 CFU/g，其次为福庆成皮蛋、湖鸭松花皮蛋、洞庭湖皮蛋、光阳皮蛋、鲁星皮蛋；鸟王皮蛋中的疑似细菌最少为210 CFU/g。且根据GB 96941988规定每克皮蛋中细菌数5009，由此可知三湖松花皮蛋、湖鸭松花皮蛋和福庆成皮蛋中的细菌数超标，不符合国家食品卫生标准。2.4 不同品牌皮蛋中放线菌菌落的检测结果不同品牌中放线菌菌落检测结果见表4。表4 不同品牌皮蛋中放线菌菌落数Table 4 The number of actinomycetes in all brands 皮蛋品牌洞庭湖皮蛋三湖松花皮蛋湖鸭松花皮蛋光阳皮蛋鲁星皮蛋福庆成皮蛋鸟王皮蛋荆门蛟龙皮蛋放线菌数量7060 140101401305080由表4可知：湖鸭松花皮蛋和鲁星皮蛋中的放线菌最多为140 CFU/g，光阳皮蛋中的放线菌数最少为10 CFU/g。2.5 不同品牌皮蛋中菌落总数的检测结果不同品牌皮蛋中菌落总数的检测结果见表5。表5 不同品牌皮蛋中菌落总数Table 5 The number of colonies in all brands 皮蛋品牌洞庭湖皮蛋三湖松花皮蛋湖鸭松花皮蛋光阳皮蛋鲁星皮蛋福庆成皮蛋鸟王皮蛋荆门蛟龙皮蛋菌落总数770895 1015605835905290420 由表5可知：湖鸭松花皮蛋中的菌落总数最多为1015 CFU/g，鸟王皮蛋中的菌落总数最少为290 CFU/g；根据GB4789.2-2010 规定每克皮蛋中菌落总数100010，由此可知每克湖鸭松花皮蛋的菌落总数超过国家食品卫生标准，不符合规定。3 结论有上述实验结果可知，皮蛋中主要含有酵母菌，细菌，乳酸菌和放线菌；其中湖北洞庭湖皮蛋、光阳皮蛋、鲁星皮蛋、鸟王皮蛋、荆门蛟龙皮蛋符合国家标准；每克三湖松花皮蛋、湖鸭松花皮蛋和福庆成皮蛋中的细菌数超标，不符合国家食品卫生标准；每克湖鸭松花皮蛋中的菌落总数超标，不符合国家食品卫生标准。参考文献1 何国庆, 贾英民, 丁立孝. 食品微生物学M. 第二版. 北京: 中国农业大学出版社, 2009: 6- 152 周德庆. 微生物学实验手册M. 上海: 科学技术出版社, 1986: 65- 703 周德庆. 微生物学实验教程M. 第二版. 北京: 高等教育出版社, 2006: 38- 45, 131- 1334 Brock T D,Madigan M T.Biology of MicroorganismsM. 7th Edition.1994:625 马向前, 周德庆. 双歧杆菌和乳酸菌的一种简便快速计数法J. 微生物学报, 1997, 37（1）, 62- 646 凌代文. 乳酸菌生物学基础及应用M. 北京: 中国轻工业出版社, 19947 钱存柔, 黄仪秀. 微生物学实验教程M. 北京: 北京大学出版社, 19998 沈萍等主编. 微生物学实验. 第3版. 北京: 高等教育出版社, 19999 GB 9694- 1988 食品安全国家标准10 GB 4789. 2- 2010 食品安全国家标准Detection of Preserved Microbial Microflora Abstract: The purpose of the experiment is to test various brands of preserved microbial colonies compliance with national food hygiene standards. The results showed that preserved egg mainly contain yeasts, bacteria, lactobacillus and actinomycetes; including Hubei Dongtinghu preserved egg, Guangyang preserved egg, Luxing preserved egg ,Giaowang preserved egg, , Jingmen dragon preserved egg meet national standards; every gram of three lakes preserved egg, Huya preserved egg, Fuqingcheng preserved egg in a number of bacteria exceeded, and does not meet the national food hygiene standards; every gram of Huya preserved egg in a number of colonies exceeded, and does not meet the national food hygiene standards.Key words: preserved egg; bacteria; yeast; actinomycete; total number of colonies致 谢时间稍纵即逝，转眼大学四年随着论文的结束也接近了尾声。在完成论文的日子里非常感谢刘小翠老师，我亲爱的舍友们，父母及学院各位老师的大力支持与帮助，在这里我递上最真挚的感谢和祝福。首先，在这里由衷感谢我的指导老师刘小翠老师。刘老师是位温暖、平易近人的老师，她有渊博的知识，严谨的工作态度，一丝不苟的工作作风。做实验初期刘老师给了我很多建议和实验注意事项，这些让我在做实验时少走了很多弯路。在做实验期间老师还不辞辛劳的经常来给做指导，帮助我辨别不同的菌类。论文完成初稿后老师也是非常热情的帮助我修改。论文从开始的选题到最后的定稿，都是在老师的帮助下一一完成，在这里我向刘老师深深鞠躬表示我的谢意。其次，非常感谢我所在的大同大学生命科学学院。四年我们一起经历了很多，我们从最小的学院逐渐变得膨大起来，我相信在学院各位领导的正确领导下，我们学院会越办越好。也非常感谢我的班主任郝老师，郝老师非常的和蔼，对班里的大小事都尽职尽责，非常的公正廉洁，感谢郝老师这四年为我们的付出与辛劳，我会继续努力工作学习做一个积极向上的人。在这里还要谢谢我的舍友们，感谢她们给我创造了一个安静的环境来完成我的论文，也感谢她们在我实验一次次失败时的鼓励，相遇是种缘分，愿我们的友情长长久久。感谢我的父母辛辛苦苦把握培育成一名大学生，宁愿自己吃苦受累也不愿让我受半点委屈，我会好好学习工作报答他们的养育之恩。大学四年使我们走向成熟，就要离开了或多或少都会有些留恋，在此谢谢帮助过我的所有人。 周晓媛 09级生物工程二班 2013年6月1日8