4DNAreplication

Chapter 4 DNA Replication内容提要内容提要第一节第一节 概述概述第二节第二节 细菌细菌DNADNA的复制的复制第三节第三节 真核真核DNADNA的复制的复制第四节第四节 端粒复制端粒复制第五节第五节 其他其他DNADNA复制方式复制方式第一节 DNA复制的概述半保留复制半保留复制复制的起点和方向复制的起点和方向DNA的半不连续复制的半不连续复制RNA引物引物DNA复制的酶体系复制的酶体系DNA合成的高保真性合成的高保真性一、半保留复制一、半保留复制（Semi-conservative Replication）1、半保留模型的提出：半保留模型的提出：1953 Watson&Crick：DNA双螺旋模型；双螺旋模型；DNA 复制的半保留模型复制的半保留模型2、DNA复制的三个模型：复制的三个模型：半保留模型；半保留模型；全保留模型；全保留模型；分散模型分散模型5353Parental strandsSemi-conservativeConservativeDispersiveDaughter strands3、半保留模型的证实：半保留模型的证实：Meselson and Stahl（1958）14N-14N14N-15N15N-15N15NH4Cl14NH4Cl20 min40 min4、半保留复制机制、半保留复制机制 复制时复制时DNADNA双螺旋的两条链解开，并分别作为模双螺旋的两条链解开，并分别作为模板指导互补链的合成板指导互补链的合成。每个子代每个子代DNA的一条链的一条链来自亲代的来自亲代的DNA，另一条链则是新合成的，另一条链则是新合成的。Semi-conservative二、复制的起点和方向二、复制的起点和方向1、复制起点、复制起点（origin）：）：复制起始处的特定复制起始处的特定DNA序列序列2、复制终点（、复制终点（termini）：）：复制终止处的特定复制终止处的特定DNA序列序列3、复制子（、复制子（replicons）：DNA复制起点到两端终点的复制起点到两端终点的DNADNA单位单位 originterminus原核生物基因组：一个复制子原核生物基因组：一个复制子 originterminus真核生物基因组：多个复制子真核生物基因组：多个复制子4、复制方向：、复制方向：双向复制：双向复制：单一起点的双向和多起点的双单一起点的双向和多起点的双向向 （腺病毒：单向）（腺病毒：单向）originterminus双向复制（双向复制（Bidirectional replication）在同一复制在同一复制起起点点两两个个复复制制叉叉以以相反的相反的方向方向移移动动单向复制（单向复制（Unidirectional replication）单单个个复复制制叉叉从复制从复制起起点处点处向一个向一个特特定方向定方向移移动动复制叉复制叉 replication fork 双螺旋双螺旋DNA 两两条亲条亲本本链链分分开开使使复复制制进行进行的的部部位位复制泡复制泡 replication bubbles 复制时，两个复制叉合起来像一个小泡复制时，两个复制叉合起来像一个小泡 3553355、复制的速度：、复制的速度：原核生物：原核生物：50000bp/min真核生物：真核生物：10003000bp/min成熟前起始成熟前起始（快速生长的（快速生长的原核细胞原核细胞内）内）Continuous,semidiscontinuous,and discontinuous models of DNA replication三、三、DNA的半不连续复制的半不连续复制1968年，年，Okazaki，半不连续复制模型，半不连续复制模型1、半不连续复制（、半不连续复制（semidiscontinuous replication）前导链的连续合成和滞后链的不连续合成的复制前导链的连续合成和滞后链的不连续合成的复制模式模式5353533553352、前导链（、前导链（leading strand）以以5-3 方向连方向连续续合成的合成的DNA 链链3、滞后链（、滞后链（lagging strand）总总体上体上沿沿着着3 到到5 方向方向延伸延伸，但但以以小小片段形式片段形式(5-3)不不连连续续合成，合成，最最后共价连接后共价连接起来起来4、冈崎片段（、冈崎片段（Okazaki fragment）在在不连不连续续复复制制中产生的中产生的短短片段，片段，随随后后被被连接连接成成完完整的链整的链 E.coli 1000-2000nt 真核生物真核生物 100-200nt355335四、四、RNA引物（引物（RNA primer）1、定义、定义 与与一一条条DNA链配对链配对的的短核苷酸短核苷酸序列序列 (通常通常是是RNA)，提供提供自自由由3-OH末端，末端，使使DNA聚聚合合酶酶开开始始合成合成DNA链链。2、功能、功能RNA引物可以提供引物可以提供3-OH末端作合成新末端作合成新DNA链起点；链起点；提高了提高了DNA复制的复制的准确性。准确性。3、引发活动、引发活动前导链前导链(leading strand):引发酶（引发酶（primase）滞后链滞后链(lagging strand):引发体（引发体（primosome）引发酶：在引发酶：在DNA复制中合成复制中合成RNA引物的一种引物的一种RNA聚合酶聚合酶引发体：指在引发体：指在半不连半不连续续DNA复复制制中，每个中，每个岗崎岗崎片段片段合成合成引引发发反应反应中中涉及涉及的蛋白质的蛋白质复复合体。合体。引引发发体体能能沿沿着着DNA 移移动动，参参与与连连续续的的引引发发反应反应。五、五、DNA复制的酶体系复制的酶体系（一）参与（一）参与DNA复制的蛋白质复制的蛋白质1、DNA解旋酶（解旋酶（DNA helicase）作用：解开双链；作用：解开双链；ATPase Dna B(E.coli)2、单链结合蛋白（单链结合蛋白（ssb）作用：防止单链退火作用：防止单链退火 （在原核细胞中表现出协同效应）（在原核细胞中表现出协同效应）3、引发酶（、引发酶（primase）：如）：如Dna G(E.coli)4、DNA连接酶（连接酶（DNA ligase）催化催化DNA链的两个末端的共价连接；链的两个末端的共价连接；需要能量：需要能量：NAD（E.coli）/ATP（真核）（真核）5、拓扑异构酶拓扑异构酶6 6、DNADNA聚合酶聚合酶 （二）（二）DNA聚合酶催化的聚合反应聚合酶催化的聚合反应1、以脱氧核苷酸三磷酸以脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)为底物催化合成为底物催化合成DNA2、需要模板需要模板(3 5)和引物的存在和引物的存在3、不能从头合成新的不能从头合成新的DNA链（链（必须有必须有3 -OH末端末端）4、催化催化dNTP加到生长中的加到生长中的DNA链的链的3-OH末端末端5、催化催化DNA合成的方向是合成的方向是5 3（三）大肠杆菌的（三）大肠杆菌的DNA聚合酶聚合酶5种：种：DNA聚合酶聚合酶 I、II、III、1、DNA聚合酶聚合酶 I（1）发现：）发现：Arther Kornberg 1958，分离出，分离出DNA聚合酶聚合酶I 1970-1971，分离出，分离出DNA聚合酶聚合酶II、IIIKlenowKlenow片段：片段：DNADNA聚合酶聚合酶可被枯草杆菌蛋白酶分解为两个可被枯草杆菌蛋白酶分解为两个片段，一个片段分子量为片段，一个片段分子量为6800068000，有聚合酶活，有聚合酶活性，并有性，并有3535外切酶活性外切酶活性（2）多种酶的活性：）多种酶的活性：5 3 DNA 聚合酶活性聚合酶活性3 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 5 3 核酸外切酶活性核酸外切酶活性5 3 DNA 聚合酶活性聚合酶活性3 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 作用：即时的校对（作用：即时的校对（Proofreading）功能）功能5 3 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 作用：作用：DNA 损伤修复（切除嘧啶二聚体）；损伤修复（切除嘧啶二聚体）；去除引物（切口平移）去除引物（切口平移）切口平移（Nick translation）DNA聚合酶聚合酶I结合在结合在切口处切口处去除引物（去除引物（5 3 核酸外切酶活性）的核酸外切酶活性）的同时填充缺口（聚合同时填充缺口（聚合酶活性）酶活性）DNA连接酶封闭切口连接酶封闭切口DNA pol I 不是复制酶不是复制酶聚合反应的速度慢聚合反应的速度慢(20 nt/sec)持续合成的能力不高持续合成的能力不高2、DNA聚合酶聚合酶 III（1）DNA聚合酶聚合酶 III的活性的活性5 3 DNA 聚合酶活性聚合酶活性3 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性(校对功能校对功能)（2）DNA 聚合酶聚合酶III 是复制酶是复制酶 持续合成的能力高持续合成的能力高 聚合反应的速度快聚合反应的速度快（3）Composition of E.coli DNA Polymerase III HoloenzymeSubunitFunctionSubassembliesDNA polymerase3-to 5-exonucleaseCoreStimulates exonucleasePol IIIDimerizes coreBinds complexBinds ATPBinds to PolIIIBinds to and complexBinds to SSB(DNA-dependent ATPase)Binds to and Sliding clamp subunit环状的二聚体环状的二聚体“滑动的夹板滑动的夹板 使全酶的持续性很高使全酶的持续性很高 DNA聚合酶聚合酶III-形成形成不对称的二聚体，不对称的二聚体，使前导使前导链、滞后链的合成可同步进行链、滞后链的合成可同步进行回环模型回环模型:滞后链模板形成了一个回环，使环中滞后链模板形成了一个回环，使环中RNA引物和冈崎片段引物和冈崎片段的合成方向与前导链一致，以适应双链在同一复制体上进的合成方向与前导链一致，以适应双链在同一复制体上进行复制行复制DNA聚合酶总结：聚合酶总结：DNA聚合酶聚合酶 I：DNA修复的主要酶修复的主要酶DNA聚合酶聚合酶II：参与：参与DNA的修复的修复DNA聚合酶聚合酶III：DNA复制酶复制酶DNA聚合酶聚合酶、：涉及：涉及DNA的错误倾向修复的错误倾向修复六、六、DNA合成的高保真性合成的高保真性DNADNA聚合酶对底物的选择功能聚合酶对底物的选择功能复制出错时有即时的校对功能复制出错时有即时的校对功能(35(35外切外切酶功能）酶功能）RNARNA引物的作用引物的作用DNADNA损伤的修复机制损伤的修复机制“”型复制型复制 环状环状DNA的复制方式，即从复制起点开始，的复制方式，即从复制起点开始，双向同时进行，形成双向同时进行，形成样中间物样中间物环节：DNA复制的起始 DNA链的延伸 DNA复制的终止第二节第二节 细菌细菌DNA复制复制一、复制的起始一、复制的起始（一）复制起始复合体（一）复制起始复合体 DnaA（起始点结合蛋白（起始点结合蛋白)DnaB（解旋酶）（解旋酶）SSB DnaC（装载解旋酶和引发酶）（装载解旋酶和引发酶）HU（识别并刺激（识别并刺激OriC 形成开链）形成开链）Gyrase（促旋酶）（促旋酶）-拓扑异构酶拓扑异构酶（二）复制起始区的结构特点（二）复制起始区的结构特点 1 1、富含、富含AT 2 2、3 3个个13bp13bp的重复序列的重复序列-解链的位点解链的位点 3 3、4 4个个9bp9bp的重复序列的重复序列-DnaA结合位点结合位点（三）复制起始引发的过程：（三）复制起始引发的过程：1、DNA复制起点双链解开复制起点双链解开，形成复制叉形成复制叉GATCTNTTNTTTTTTATNCANADnaA+ATPDnaBDnaCOriC（富含（富含AT）313bp重复序列重复序列49bp重复序列重复序列 DnaA结合位点结合位点HU+ATPATP过程：过程：（1）约）约20个个DnaA结合在结合在49bp重复序列重复序列（2）DnaA复制起始复合物使复制起始复合物使13bp重复序列变性，重复序列变性，形成开链形成开链（3）DnaB与单链与单链DNA结合（需要结合（需要DnaC帮助），帮助），进一步解开进一步解开DNA双链，形成复制叉双链，形成复制叉2、RNA引物的合成引物的合成 leading strand:primase（引发酶）（引发酶）lagging strand:primosome 引发体（引发前体引发体（引发前体primase）引发前体：引发前体：n蛋白、蛋白、n蛋白、蛋白、n”蛋白、蛋白、i蛋白、蛋白、dnaB蛋白和蛋白和dnaC蛋白蛋白 3、DNA聚合酶将第一个聚合酶将第一个dNTPdNTP加到引物的加到引物的3-OH末端末端二、复制的延伸二、复制的延伸SSBDnaGprimaseDnaBhelicasePol III （/）引发体（引发体（primosome）Pol I、ligase复制体（复制体（replisome）in vivo（一）（一）DNA复制体复制体(replisome)DNA聚合酶聚合酶全酶分子、引发体和解旋酶构成全酶分子、引发体和解旋酶构成的复合体的复合体（二）其他两种酶（二）其他两种酶DNA 聚合酶聚合酶 I：去除引物，填补缺口：去除引物，填补缺口DNA 连接酶连接酶（三）（三）DNA聚合反应的特征聚合反应的特征1、DNA的聚合反应是以的聚合反应是以dNTP为底物，以为底物，以3 5 DNA为模板，按碱基配对原则在为模板，按碱基配对原则在3-OH上加上加dNTP （DNA聚合酶对碱基的选择功能）聚合酶对碱基的选择功能）2、需二价正离子如、需二价正离子如Mg，3-OH作亲核进攻形成磷酸作亲核进攻形成磷酸 二酯键二酯键3、链沿、链沿5 3方向延长方向延长4、碱基互补配对，若错配则切除掉、碱基互补配对，若错配则切除掉（四）防止拓扑学问题（四）防止拓扑学问题两种机制两种机制1 DNA在生物细胞中本身就是负超螺旋，当在生物细胞中本身就是负超螺旋，当DNA解链而产生正超螺旋时，可以被原来存在解链而产生正超螺旋时，可以被原来存在的负超螺旋所中和的负超螺旋所中和2 DNA拓扑异构酶拓扑异构酶(旋转酶旋转酶)可以在可以在DNA解链解链前方不停地继续将负超螺旋引入双链前方不停地继续将负超螺旋引入双链DNA AATTAGTATGTTGTAACTAAAGTTTAATCATACAACATTGATTTCAterD/terAterC/terBReplication fork 1Replication fork 2tus gene 产物产物复制终止区：复制终止区：200 kb（DnaB inhibitor)复制叉相遇位点复制叉相遇位点三、细菌三、细菌DNA复制的终止复制的终止（一）终止位点（一）终止位点 一侧复制叉的终止位点位于相遇点的另一侧一侧复制叉的终止位点位于相遇点的另一侧（二）终止机制（二）终止机制 1、Tus蛋白的作用：蛋白的作用：可与终止序列结合，阻止复制叉继续前移可与终止序列结合，阻止复制叉继续前移 2、两个复制叉在相遇点相遇、两个复制叉在相遇点相遇 3、两个复制叉在复制快的复制叉的终止点相遇、两个复制叉在复制快的复制叉的终止点相遇（三）分离（三）分离（segregation）Topoisomerase IV：使复制叉解体，释放子链使复制叉解体，释放子链DNA第三节第三节 真核生物真核生物DNA复制复制一、概述（一）复制与细胞周期（一）复制与细胞周期 S期 早：常染色质，早：常染色质，中：异染色质，中：异染色质，晚：着丝粒和端粒晚：着丝粒和端粒（二）实验系统：（二）实验系统：SV40、酵母、非洲爪蟾的卵母细胞、酵母、非洲爪蟾的卵母细胞（三）复制频率（三）复制频率 每个细胞周期复制一次每个细胞周期复制一次成熟前起始成熟前起始（快速生长的（快速生长的原核细胞原核细胞内）内）（四）复制与核小体（四）复制与核小体 1、复制叉形成时复制叉形成时DNA从核小体解离，组蛋白从核小体解离，组蛋白八聚体解聚八聚体解聚 2、复制叉通过后新、旧组蛋白与、复制叉通过后新、旧组蛋白与DNA重新组重新组装成核小体装成核小体二、真核生物二、真核生物DNA复制的起始复制的起始（一）复制起始点（多个）（一）复制起始点（多个）酵母：自动复制序列酵母：自动复制序列（ARS）特点：特点：11bp的保守序列（富含的保守序列（富含AT）（起始位点识别复合体（起始位点识别复合体 ORC）（二）复制子簇（二）复制子簇（cluster of replicons）特点特点 1 1、由多个复制子组成、由多个复制子组成，20-50个串联排列个串联排列 2 2、同一、同一复制子簇复制子簇内的复制子基本同步起始内的复制子基本同步起始三、真核生物三、真核生物DNA复制的延伸复制的延伸（一）相关酶和蛋白质（一）相关酶和蛋白质 1、解旋酶、解旋酶（Mcm2-7，SV40 T抗原）抗原）2、单链结合蛋白（、单链结合蛋白（RP-A，replication protein A）3、连接酶连接酶 I（DNA ligase I）4、PCNA（proliferating cell nuclear antigen）-增殖细胞核抗原增殖细胞核抗原 相当于大肠杆菌相当于大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶III的的亚基，能形成亚基，能形成环状夹子，大大增加了聚合酶持续合成的能力环状夹子，大大增加了聚合酶持续合成的能力 5、聚合酶、聚合酶（二）真核生物（二）真核生物DNA聚合酶聚合酶1、DNA Pol （作用：复制的引发）（作用：复制的引发）复合体（复合体（Pol /引发酶）引发酶）（1）引发酶活性）引发酶活性 合成前导链和滞后链每个冈崎片段的合成前导链和滞后链每个冈崎片段的RNA引物引物（2）53聚合酶活性聚合酶活性 可继续延长可继续延长DNA（a few hundred nt）但很快）但很快 被被 Pol 、pol代替代替2、DNA Pol （1）53聚合酶活性：聚合酶活性：前导链合成前导链合成（2）3 5 核酸外切酶活性：核酸外切酶活性：校对功能校对功能3、DNA polymerase（1）53聚合酶活性：聚合酶活性：滞后滞后链合成链合成（2）3 5 核酸外切酶活性：核酸外切酶活性：校对功能校对功能Probable Roles of Eukaryotic DNA PolymeraseEnzymeProbable roleDNA polymeraseoriginate DNA replicationDNA polymeraseDNA replication:leading strand DNA polymerase DNA replication:lagging strandDNA polymeraseDNA repairDNA polymeraseReplication of mtDNA四、真核生物四、真核生物DNA复制的终止复制的终止 1、终止位点：、终止位点：不存在使复制叉终止和解聚的终止位点不存在使复制叉终止和解聚的终止位点 2、终止机制：、终止机制：复制终止通过复制叉的相遇而终止复制终止通过复制叉的相遇而终止真核真核DNA的复制的复制1、组蛋白的去除：、组蛋白的去除：组蛋白的修饰组蛋白的修饰 2、复制前复合物的、复制前复合物的形成形成3、复制许可、复制许可 Mcm2-7是复制许可是复制许可因子，因子，CDK可使可使之磷酸化之磷酸化4、DNA的解旋：的解旋：解旋酶解旋酶（Mcm2-7，SV40 T抗原）抗原）；拓扑异构酶拓扑异构酶和和可在复制叉前松弛正超螺旋可在复制叉前松弛正超螺旋5、前导链和滞后链的、前导链和滞后链的RNA引发：引发：pol 6、聚合酶的切换、聚合酶的切换7、前导链和滞后链的前导链和滞后链的延伸延伸8、引物的去除：、引物的去除：FEN-1（RNase H1）9、缺口填充，冈崎片段、缺口填充，冈崎片段 连接连接10、组蛋白沉积、组蛋白沉积第四节第四节 端粒端粒DNA的复制的复制一、线状一、线状DNA末端复制问题末端复制问题53535353555线状线状DNA末端复制问题末端复制问题1、复制后产生粘性末端（复制后产生粘性末端（sticky end）：滞后滞后 链的链的5端引物切除后，因没有端引物切除后，因没有3-OH存在存在 DNA聚合酶无法将缺少的部分补齐聚合酶无法将缺少的部分补齐2、染色体不稳定染色体不稳定3、染色体末端隐缩：、染色体末端隐缩：DNA每复制一次，每复制一次，DNA 就缩短一次就缩短一次讨论：环状讨论：环状DNA是否存在末端复制问题？是否存在末端复制问题？二、真核生物染色体二、真核生物染色体 DNA末端复制末端复制（一）（一）端粒（端粒（Telomere）1、概念：、概念：是真核生物染色体末端的是真核生物染色体末端的一种特殊结构一种特殊结构 2、组成：端粒、组成：端粒DNA/端粒蛋白端粒蛋白 （1）端粒蛋白）端粒蛋白：非组蛋白：非组蛋白 （2）端粒）端粒DNA：a、含数百个短的正向重复序列，富含含数百个短的正向重复序列，富含GC b、形成特殊的二级结构、形成特殊的二级结构人的端粒人的端粒DNA序列：序列：（TTAGGG）n3、作用作用 （1）稳定染色体结构稳定染色体结构 （2）防止染色体末端融合）防止染色体末端融合 （3）保护染色体结构基因）保护染色体结构基因 （4）避免遗传信息在复制过程中丢失避免遗传信息在复制过程中丢失附：附：端粒长度端粒长度-分子钟分子钟(molecularclock)的作用的作用 随着细胞不断分裂，端粒的长度越来越短，当随着细胞不断分裂，端粒的长度越来越短，当 达到一个临界长度，细胞染色体即失去稳定性，达到一个临界长度，细胞染色体即失去稳定性，阻止细胞进一步分裂的信号便发出。细胞将发阻止细胞进一步分裂的信号便发出。细胞将发 生凋亡（生凋亡（apoptosis）（二）端粒酶（二）端粒酶 1、组成组成 （1 1）蛋白质：逆转录酶）蛋白质：逆转录酶 （2 2）RNA：约：约150150nt，部分序列与端粒，部分序列与端粒DNA互补，互补，可作为合成端粒可作为合成端粒DNA的模板的模板 （端粒酶是自身携带（端粒酶是自身携带RNA模板的逆转录酶）模板的逆转录酶）2、功能：负责端粒功能：负责端粒DNADNA的延长，维持端粒的长度的延长，维持端粒的长度3 3、存在部位：、存在部位：在在生殖细胞生殖细胞和和肿瘤细胞肿瘤细胞，才可以检测到具有，才可以检测到具有活性的端粒酶活性的端粒酶4 4、端粒酶、端粒酶和衰老、肿瘤有关和衰老、肿瘤有关（三）端粒（三）端粒DNA的复制的复制 1、已存在的端粒、已存在的端粒DNA的复制：的复制：与其它部分与其它部分DNA复制一起完成复制一起完成 2、端粒、端粒DNA的延长的延长 主要由端粒酶完成主要由端粒酶完成 （1）G链（链（G-rich strand）的合成）的合成 （2）C链（链（C-rich strand）的合成）的合成.TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG.AACCCCAACCCC AACCCCAAC5335dGTP.TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTT.AACCCCAACCCC AACCCCAAC5335dGTP.TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG.AACCCCAACCCC AACCCCAAC53353RNA template（1）G链的合成链的合成G链的合成链的合成 1 端粒酶与端粒端粒酶与端粒DNA结合，端粒中的结合，端粒中的RNA与凸出的与凸出的 G链链3端的端的TTG配对配对 2 以端粒酶的以端粒酶的RNA为模板，在为模板，在G链链3从头合成从头合成DNA 3 延伸延伸6个核苷酸个核苷酸 合成一个重复单位后，端粒酶向新合成的合成一个重复单位后，端粒酶向新合成的DNA 3端移动，端粒酶中的端移动，端粒酶中的RNA再与再与3端的端的TTG配对。进配对。进行多个循环，行多个循环，G链链3端形成多个短的重复序列端形成多个短的重复序列（2）C链的合成链的合成 两个模型两个模型a、G链末端回折，形成发夹结构；链末端回折，形成发夹结构；DNA聚合酶延伸聚合酶延伸b、Pol a/引发酶引发酶合成合成RNA引物引物;pol 延伸延伸;primaseprimase.TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG.AACCCCAACCCC CCCCAAC53.TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG.AACCCCAACCCC CAACCCCAAC53.TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG.AACCCCAACCCC CCAACCC CAACCCCAAC53.TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG.AACCCCAACCCC AACCCCAACCC53DNA polymerase引物合成引物合成延伸延伸引物切除引物切除35C链的合成链的合成 1 引发酶以引发酶以G链链3端为模板合成一段引物端为模板合成一段引物 2 DNA聚合酶以聚合酶以G链为模板，补齐链为模板，补齐C链缺口链缺口 3 去除引物，在去除引物，在G链链3端留下一个端留下一个1216个核苷个核苷 酸的酸的overhang（突出端）（突出端）3.端粒长度的控制：端粒长度的控制：POT1,TRF1 和 TRF2(1)POT1(protection of telomeres)结合结合 3 端单链端单链 DNA(2)TRF(TTAGGG repeat-binding factors)TRF1 和和 TRF2 结合双链结合双链 DNA端粒长度控制模型端粒长度控制模型A、端粒足够长时，结合在、端粒足够长时，结合在3的的POT1多，阻碍了多，阻碍了端粒酶的活动端粒酶的活动B、端粒短时，结合在、端粒短时，结合在3的的POT1少或没有，端粒少或没有，端粒酶的活动不受抑制酶的活动不受抑制（四）端粒的形成（四）端粒的形成1、端粒、端粒DNA在与端粒蛋白共同作用下自身回折，在染色在与端粒蛋白共同作用下自身回折，在染色体的末端形成一个大的体的末端形成一个大的DNA套索结构，即套索结构，即T-环环(telomere loop)。2、端粒、端粒G链链3单链末端取代了端粒上游区域的相同序列，单链末端取代了端粒上游区域的相同序列，形成形成D-环环TRF1：使：使DNA发生弯曲发生弯曲并回折并回折TRF2：稳定：稳定D-环环3、端粒、端粒DNA与端粒蛋白（非组蛋白）结合与端粒蛋白（非组蛋白）结合附：真核生物附：真核生物DNA复制的特点复制的特点1、复制速度慢：复制速度慢：50nt秒，为原核生物的秒，为原核生物的1102、多个复制起始点，可同时进行复制（并非所有复制子多个复制起始点，可同时进行复制（并非所有复制子 都同时复制）都同时复制）3 3、一个细胞周期只复制一次；而原核生物可不停复制，、一个细胞周期只复制一次；而原核生物可不停复制，复制可以成熟前起始复制可以成熟前起始4 4、引物及冈崎片段的长度均小于原核生物。真核长约、引物及冈崎片段的长度均小于原核生物。真核长约 100-200ntnt，原核长约，原核长约1000-2000ntnt第五节第五节 其他其他 DNA复制方式复制方式一、滚环形（一、滚环形（rolling circle）复制复制 噬菌体（例噬菌体（例 X174）、）、真核真核rDNA 、细菌细菌F因子因子1、概念：、概念：环状环状DNADNA的一种的一种复复制制模模式，式，复复制制叉叉沿沿环环形形模模板板复复制制一定一定次次数，数，每个每个反应反应中中新新合成的合成的链链将将前前一一反应反应中合成的中合成的链链抛抛出，形成出，形成与与环环状状模模板链互补板链互补的一的一系列系列线线性性序列序列。3-OH5-P552、复制过程：、复制过程：1、复制起始于某一条、复制起始于某一条DNA链上链上 2、新生、新生DNA链延伸，不断取代母链链延伸，不断取代母链 3、复制一圈，产生单位长度的线性、复制一圈，产生单位长度的线性DNA链链 4、若复制继续进行，、若复制继续进行，5不断甩出，可产生不断甩出，可产生 多单元线性多单元线性DNA链链3、复制方向：、复制方向：单向复制单向复制4 4、被取代链的命运：、被取代链的命运：（1 1）按）按单位长单位长度度切割切割则产则产生生单单体，体，单单体体可继续可继续转转化化为为环环形形双链双链形形式式；（2 2）按按多多聚聚体体长长度度切割切割则则产生一系列由基产生一系列由基本本复制复制单位单位串串联联而而成成的的各各种形种形式式(线形线形、双链双链环环状状等等)二、二、D-环型（环型（displacement loop）动物线粒体动物线粒体/植物叶绿体基因组植物叶绿体基因组DNA 1、特点：、特点：（1）双链复制不同步（）双链复制不同步（2）起始点异位（）起始点异位（H链、链、L链各一）链各一）HL哺乳类哺乳类 D-loop：500-600bp线粒体：一个线粒体：一个-多个多个D-环环叶绿体：叶绿体：2个个D-环环2、复制过程、复制过程（1）L链首先合成：链首先合成：在在H链上的复制起点处开始合成，链上的复制起点处开始合成，以以D-环的形式取代原来的环的形式取代原来的L链链（2）L链片段的继续合成：链片段的继续合成：D-环扩展环扩展（3）H链合成开始：链合成开始：当取代环达当取代环达mtDNA的的2/3时，时，L链上链上 的复制起点暴露，的复制起点暴露，H链开始合成链开始合成（4）复制的完成：复制的完成：L链的合成提前完成，链的合成提前完成，H链的合成随链的合成随 后结束后结束三、末端型（三、末端型（strand displacement）复制）复制 线性基因组线性基因组：腺病毒：腺病毒/噬菌体噬菌体 29 1、特点：、特点：（1）末端起始，不需要合成）末端起始，不需要合成RNA引物引物；（2）两条链不同步复制）两条链不同步复制2、末端蛋白（、末端蛋白（TP）的作用）的作用（1）与与DNA 聚聚合合酶酶结结合合（2）携带一个）携带一个C作为引物作为引物3、复制过程、复制过程PolC3 -OHC3 -OH353、复制过程：、复制过程：（1）起始）起始 末端蛋白末端蛋白(TP)与与DNA 聚聚合合酶酶结结合合,并并携带一个携带一个C 作为引物作为引物（2）复制叉移动）复制叉移动（3）复制达到末端时一条单链被置换出来）复制达到末端时一条单链被置换出来（4）末端反向重复序列配对，形成双螺旋）末端反向重复序列配对，形成双螺旋（5）以被置换的单链为模板合成）以被置换的单链为模板合成DNAQuestion作业：作业：名词解释：名词解释：半保留复制、半不连续复制、半保留复制、半不连续复制、冈崎片段、前导链、滞后链、冈崎片段、前导链、滞后链、复制子、复制叉、复制泡、端粒酶复制子、复制叉、复制泡、端粒酶、型复制、滚环复制、型复制、滚环复制、Klenow 片段片段简答题简答题1、简述原核生物简述原核生物DNA复制起始的过程复制起始的过程2、简述、简述DNA聚合酶聚合酶及其功能及其功能3、保证、保证DNA复制真实性的机制有哪些复制真实性的机制有哪些4、简述端粒、端粒酶的作用以及端粒、简述端粒、端粒酶的作用以及端粒DNA延长的机制延长的机制思考题：1.真核生物与原核生物复制有哪些不同？真核生物与原核生物复制有哪些不同？2.“”型复制和滚环复制有哪些不同点？型复制和滚环复制有哪些不同点？3.PCR与与DNA复制有哪些相同点和不同点？复制有哪些相同点和不同点？4.说出说出DNA复制起始有关的五种重要的酶或蛋白复制起始有关的五种重要的酶或蛋白并简述它们的功能。并简述它们的功能。5.DNA复制过程中，后随链的复制过程复制过程中，后随链的复制过程6.简述真核生物简述真核生物 DNA复制中，端粒复制与染色复制中，端粒复制与染色体其他部分体其他部分DNA复制的异同和生物学意义复制的异同和生物学意义7.简述染色体端粒复制的问题，人正常细胞和癌简述染色体端粒复制的问题，人正常细胞和癌细胞的端粒复制有何不同？细胞的端粒复制有何不同？