《酶工程第一章绪论》PPT课件

1,酶工程,Enzyme Engineering,曹新志 E-mail: ,TEL:13890062236,2,主要参考书, 郭勇主编，酶工程。北京：中国轻工业出 版社，2002 罗贵民主编，酶工程。北京：化学工业出 版社，2002 陈石根，周润琦编著，酶学。上海：复旦 大学出版社，2001 郭勇，郑穗平编著，酶学。广州：华南理 工大学出版社，2000,3,现代生物工程：,1.基因工程（gene engineering） 2.细胞工程（cell engineering） 3.酶工程（enzyme engineering） 4.发酵工程（fermentation engineering） 5.蛋白质工程（protein engineering ）,4, 绪论 酶的工业生产 酶的分离纯化与制剂 固定化酶和固定化细胞 酶反应器 酶的非水相催化 酶制剂的应用,5,第一章 绪论(ENZYME ENGINEERING),酶工程是现代生物技术的重要组成部分。 其特点是利用酶、含酶细胞器或细胞(微生物、植物、动物)作为生物催化剂来完成某些重要的化学反应。,1,6,第一节 酶工程概述 第二节 酶的分类、组成、结构特点和作用机制 第三节 酶作为催化剂的显著特点 第四节 影响酶活力的因素 第五节 酶动力学和抑制作用,7,生物技术的四大支柱,8,基因工程：用“剪刀+糨糊”创造新物种的工程。 细胞工程：微观水平的嫁接技术。 酶工程：让工厂高效、安静、美丽如画的工程。 发酵工程：把微生物或细胞造就成无数微型工 厂，将神话变为现实的桥梁。,9,第一节 酶工程概述 一、酶与酶工程发展简史 （一）酶学研究简史 1. 不自觉的应用：酿酒、造酱、制饴糖、治病 2. 酶学的产生: 消化与发酵现象,10,（1）消化 法国著名科学家雷默（1683-1757）认为消化是一个在胃液作用的化学过程而不仅仅是一个物理过程。 1777年，意大利物理学家 Spallanzani(斯帕兰扎尼) 的山鹰实验。证明在胃液中存在一些特殊的活性成分 1822年，美国外科医生 Beaumont 研究食物 在胃里的消化。 19世纪30年代，德国科学家施旺获得胃蛋白酶。,11,（2）发酵 1684年，比利时医生Helment提出 ferment引起酿酒过程中物质变化的因素（酵素）。 1833年，法国化学家Payen (佩恩)和Person(帕索兹) 用酒精处理麦芽抽提液，得到淀粉酶（diastase）。 1878年，德国科学家Khne(库尼)提出 enzyme从活生物体中分离得到的酶，意思是“在酵母中”（希腊文）。,12,小插曲 19世纪，Pasteur和Liebig学术长期争论: 1857年，法国化学家和微生物学家Pasteur(巴斯德)认为没有生物则没有发酵。 德国化学家Liebig认为发酵是由化学物质引起的。 此争议由德国学者Buchner(巴克钠)兄弟于1896年解决。,13,Buchner兄弟的试验： 用细砂研磨酵母细胞，压取汁液，汁液不含活细胞，但仍能使糖发酵生成酒精和二氧化碳。 证明：发酵与细胞的活动无关。,14,15,酶活细胞产生的，能在细胞内外起作用的（催化）生理活性物质。 enzymeorganic chemical substance (a catalyst) formed in living cells, able to cause changes in other substance without being changed itself. 酶的化学本质？,16,3.酶学的迅速发展（理论研究） （1） 酶的化学本质 德国化学家R.Willstatter的错误观点。 1926年,美国康乃尔大学的“独臂学者” Sumner（萨姆纳）博士从刀豆中提取出脲酶结晶，并证明具有蛋白质的性质。并获得1947年的诺贝尔奖。 1930年，美国的生物化学家Northrop分离得到了胃蛋白酶（pepsin）、胰蛋白酶（trypsin）、胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）结晶，确立了酶的化学本质。,17,18,19,20,21,22,（2） 酶学理论研究 1890年，Fisher锁钥学说。 1902年，Henri中间产物学说。 1913年， Michaelis 和 Menten米氏学说。 1958年， Koshland诱导契合学说。 1960年，Jacob 和 Monod操纵子学说。,23,Characteristics of enzyme active sites Lock and key model (锁钥) 1890 picture by Emil fisher. This model assumed that only a substrate of the proper shape could fit with the enzyme. Induced fit model (诱导契合) proposed by Daniel Koshland in 1958. This model assumes continuous changes in active site structure as a substrate binds.,24,25,中间产物学说,ES,P,S,E,26,Steps in an enzymatic reaction Enzyme and substrate combine to form a Complex. Complex goes through a transition state -not quite substrate or product A complex of the enzyme and the product is produced Finally the enzyme and product separate All of these steps are equilibria. Lets review each step.,27,28,29,30,31,Michaelis-Menten equation,32,酶是一类由活性细胞产生的具有催化作用和高度专一性的特殊蛋白质。 是否所有的酶都是蛋白质？,33,（3）核酶的发现 1982年，Thomas R.Cech(切克)等人发现四膜虫细胞的26S rRNA前体具有自我剪接功能，将这种具有催化活性的天然RNA称为核酶Ribozyme。 1983年，Altman(阿尔特曼)等人发现核糖核酸酶P的RNA组分具有加工tRNA前体的催化功能。而RNase P中的蛋白组分没有催化功能，只是起稳定构象的作用。,34,核酶的发现，改变了有关酶的概念，即“酶是具有生物催化功能的生物大分子（蛋白质或RNA）。 酶分两大类： 主要由蛋白质组成蛋白类酶（P酶） 主要由核糖核酸组成核酸类酶（R酶）,35,（二) 酶工程研究简史（应用研究） 1894年，日本的高峰让吉用米曲霉制备得到淀粉酶，开创了酶技术走向商业化的先例。 1908年，德国的Rohm用动物胰脏制得胰蛋白酶，用于皮革的软化及洗涤。 1908年，法国的Boidin制备得到细菌淀粉酶，用于纺织品的褪浆。 1911年，Wallerstein从木瓜中获得木瓜蛋白酶，用于啤酒的澄清。,36,1949年，用微生物液体深层培养法进行淀粉酶的发酵生产，揭开了近代酶工业的序幕。 1960年，法国科学家Jacob和Monod提出的操纵子学说，阐明了酶生物合成的调节机制，通过酶的诱导和解除阻遏，可显著提高酶的产量。,37,在酶的应用过程中，人们注意到酶的一些不足之处，如：稳定性差，对强酸碱敏感，只能使用一次，分离纯化困难等。 解决的方法之一是固定化。,38,固定化技术的发展经历 1916年，Nelson和Griffin发现蔗糖酶吸附到骨炭上仍具催化活性。 1969年，日本千佃一郎首次在工业规模上用固定化氨基酰化酶从DL-氨基酸生产L氨基酸。 1971年，第一届国际酶工程会议在美国召开，会议的主题是固定化酶。,39,二 . 酶工程简介 由酶学与化学工程技术、基因工程技术、微生物学技术相结合而产生的一门新的技术科学。它从应用目的出发，研究酶的产生、酶的制备与改造、酶反应器以及酶的各方面应用。 分为：化学酶工程与生物酶工程。,40,化学酶工程（初级酶工程） 酶化学与化学工程技术相结合的产物。 主要研究内容：酶的制备、酶的分离纯化、酶与细胞的固定化技术、酶分子修饰、酶反应器和酶的应用。 2. 生物酶工程（高级酶工程） 在化学酶工程基础上发展起来的、酶学与现代分子生物学技术相结合的产物。,41,生物酶工程主要研究内容 （1） 用基因工程技术大量生产酶（克隆酶） 如：尿激酶原和尿激酶是治疗血栓病的有效药物。用DNA重组技术将人尿激酶原的结构基因转移到大肠杆菌中，可使大肠杆菌细胞生产人尿激酶原，从而取代从大量的人尿中提取尿激酶。 （2）用蛋白质工程技术定点改变酶结构基因（突变酶） 如：酪氨酰tRNA合成酶，用Ala5（第5位的丙氨酸）取代Thr51（第51位的丝氨酸），使该酶对底物ATP的亲和力提高了100倍。 （3）设计新的酶结构基因，生产自然界从未有过的性能稳定、活性更高的新酶。,42,43,酶工程原理和基本过程 菌种 扩大培养 发酵 发酵酶液 酶的提取 酶成品 原料 前处理 杀菌 酶反应器 反应液 产品提取 产品,酶的固定化,44,思考题： 酶工程的概念、分类及其研究内容。 Payen和Person、Buchner兄弟、Sumner、Fisher、Koshland、Henri、Michaelis和Menten、Jacob和Monod、Cech和Altmam及千佃一郎对酶学的主要贡献是什么？,45,应用范围包括:,医药、食品、化学工业，诊断分析和生物传感器等。 诸如糖化酶、淀粉酶、洗涤用酶以及与-内酰胺抗生素生产有关的青霉素酰化酶、7-ACA酰化酶等， 其市场需求、生产规模和产值均很可观，并已产生巨大的经济效益。 随着酶的大量应用，各种酶反应器和固定化技术应运而生，更进一步地推动了酶工程的发展。,46,当代酶工程发展的趋势之一,是寻找耐极端条件的酶，如耐高温、耐酸碱、耐盐等。这些酶存在于嗜高温、嗜酸碱、嗜高盐的细菌中。 近年来对这些细菌的研究进展迅速，这将为酶工业提供源源不断的新型酶类。,47,酶有多少种?,现已发现生物体内存在的酶有近8000种，而且每年都有新酶发现。迄今，数百种酶已纯化达到了均一纯度，大约有200多种酶得到了结晶。 由于蛋白质分析分离技术的飞速发展，特别是在运用x射线衍射分析等方法后，人们相继弄清了溶菌酶(129个氨基酸残基)、胰凝乳蛋白酶(245个氨基酸残基)、羧肽酶(307个氨基酸残基)、多元淀粉酶A(460个氨基酸残基)等的结构和作用机理。 现在对于细胞基本代谢过程中的各种酶，很多已有比较清楚的认识，但有关遗传过程中的酶还有待深入研究。,48,酶是生物体内进行自我复制、新陈代谢所不可缺少的生物催化剂。由于酶能在常温、常压、中性pH等温和条件下高度专一有效地催化底物发生反应，所以酶的开发和利用是当代新技术革命中的一个重要课题。酶工程主要指自然酶制剂在工业上的大规模应用， 由4个部分组成： 酶的产生； 酶的分离纯化； 酶的固定化； 生物反应器。,49,酶工程的发展历史:,一般认为，酶工程的发展历史应从第二次世界大战后算起。 从20世纪50年代开始，由微生物发酵液中分离出一些酶，制成酶制剂。 60年代后，由于固定化酶、固定化细胞崛起，使酶制剂的应用技术面貌一新。 70年代后期以来，由于微生物学、遗传工程及细胞工程的发展为酶工程进一步向纵深发展带来勃勃生机，从酶的制备方法、酶的应用范围到后处理工艺都受到巨大冲击。尽管目前业已发现和鉴定的酶约有8000多种，但大规模生产和应用的商品酶只有数十种。 。,8,50,自然酶在工业应用上受到限制的原因主要有：,大多数酶脱离其生理环境后极不稳定，而酶在生产和应用过程中的条件往往与其生理环境相去甚远； 酶的分离纯化工艺复杂； 酶制剂成本较高,51,固定化酶较自由酶具有很多优点：,稳定性高；酶可反复使用；产物纯度高，副产物少，从而有利提纯；生产可连续化、自动化；设备小型化，节约能源等。 因此固定化酶研究仍是酶工程研究的中心，其应用范围越来越广。除应用于传统的食品工业(乳糖的分解、乳酪制造、牛奶消毒、酒精生产等)外，在其他领域如有机合成反应、分析化学、医疗、废液处理、亲和层析等也获得广泛应用。,52,在固定化酶的基础上又逐渐发展固定化细胞的技术,近年来，后来居上的固定化细胞技术发展更为迅速，在实际应用方面已大大超过固定化酶。 在工业应用方面，利用固定化酵母细胞发酵生产酒精、啤酒的研究较引入注目。 日本Toshio Onaka 等用海藻酸钙凝胶包埋酵母细胞，可在一天内获得质量优良的啤酒。 法国Corriell 等将酵母细胞固定在聚氯乙烯碎片和多孔砖等载体上进行啤酒发酵中型试验，可连续运转8个月。 中国上海工业微生物研究所等单位也从20世纪70年代后期进行过类似的研究工作，用固定化酵母发酵啤酒的规模不断扩大，已正式投入大规模生产。,10,53,基因工程与酶工程相结合,1980年，Wagner等人报道，将大肠杆菌ACTT11105的青霉素酰化酶基因克隆到质粒上，获得产酶活力更高的大肠杆菌5K(PHMl2)杂交株，并将此大肠杆菌杂交株固定，用于生产青霉素酰化酶。这是基因工程与酶工程相结合的第一例。 近年来，有关藻类等各种植物细胞、原生动物等各种动物细胞固定化研究十分活跃。1980年，Lim和Sun报道，用海藻酸钙包埋胰岛细胞可用于大白鼠糖尿病的治疗研究。,54,酶分子的改造和修饰,酶制剂的应用并不一定都需要固定化，而且需要固定化的天然酶也仍有必要提高其活力，改善其某些性质，以便更好地发挥酶的催化功能。 由此而提出了酶分子的改造和修饰。 在第七届国际酶工程会议上，以酶分子改造和修饰为主要内容的提高酶稳定性的研究占较大比例，它与基因工程的应用、活细胞的固定化一起，成为1983年国际酶工程会议最为活跃的三大领域。,55,4,通常将改变酶蛋白一级结构的过程称为改造，而将酶蛋白侧链基团的共价变化称为修饰。 酶分子经加工改造后，可导致有利于应用的许多重要性质与功能的变化。如德重等利用蛋白水解酶的有限水解作用，已将L-天冬氨酸酶的活力提高36倍。 美国Davis等人还利用蛋白质侧链基团的修饰作用，研究降低或解除异体蛋白的抗原性及免疫原性。以聚乙二醇修饰治疗白血病的特效药L-天冬酰胺酶，使其抗原性完全解除。,11,56,在酶工程研究中，与酶分子本身不直接有关的有两项重要内容：,酶生物反应器的研究和酶抑制剂的研究。 酶生物反应器往往可以提高催化效率、简化工艺，从而增加经济效益。结合固定化技术，业已发展成酶电极、酶膜反应器、免疫传感器及多酶反应器等新技术。这在化学分析、临床诊断与工业生产过程的监测方面成为很有价值的应用技术。 酶抑制剂，尤其是微生物来源的菌抑制剂多是重要抗生素。酶抑制剂还可在代谢控制、生物农药、生物除草剂等方面发挥特殊作用，其低毒性备受人们欢迎。酶抑制剂的开发业已受到国际产业部门的重视。,12,57,从酶工程的进展和动态中可以预料，今后将会出现一批基因工程表达的酶制剂，亲和层析技术仍将得到广泛应用，并会出现一个应用经分子改造与修饰的酶制剂的热潮。异体酶的抗原性将得到解决。在酶活性的控制方面将会有较大突破，其中酶抑制剂与激活剂仍将受到极大重视，并在临床及工农业生产中发挥重要作用。在化学合成工业中，酶法生产将有重大贡献，模拟酶、酶的人工设计合成、抗体酶、杂交酶将成为活跃的研究领域。非水系统酶反应技术(反向胶束中的酶促反应、有机溶剂中的酶反应)也仍将是研究热点之一。,13,58,第二节 酶的分类、组成、结构特点和作用机制,14,59,一、酶的分类,2-根据酶所催化的反应性质,酶学研究早期，无系统的命名法则,1-根据酶的作用底物命名,淀粉酶,蛋白酶,脂肪酶,氧化酶,还原酶,转氨酶,60,缺点,缺乏系统性，常常会不 可避免地出现一酶数名 或一名数酶的混乱情况,61,国际生物化学联合会 International Union of Biochemistry 简称IUB,1961年提出,1965、1972、1978、 1984修改、补充,系统命名法,国际分类法,62,1961年国际生化联合会酶学委员会提出将酶分成6类。许多酶是由它们底物名称加上后缀“-ase”命名。 因此脲酶(urease)是催化尿素(urea)水解的酶。果糖-1，6-二磷酸酶(fluctose-l，6-diphosphatase)是水解果糖-l，6-二磷酸的酶。 然而，有些酶(如胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶)的命名并末表示它的底物名称。有些酶有多种不同的名称。 为了使酶的名称合理，国际上已公认一种酶的命名(enzyme nomenclature)系统，这个系统将所有的酶根据其反应催化的类型安置到6种主要类型的某一种中(表1-1)。,63,64,酶,1-氧化还 原酶类,2-转移 酶类,3-水解 酶类,6-合成 酶类,5-异构 酶类,4-裂解 酶类,1 国际系 统分类法,65,EC命名法,ECx.y.z.n,EC为酶学委员会 Enzyme Commission,亚亚类下的具体的个别酶的顺序号,各亚类下的亚亚类,酶所属大类 16,大类下的亚类,x,y,z 编号中的前三个 数字表明了该酶 的特性如反应物 的种类、反应的 性质,66,此外每种酶各有一个独自的4个数字的分类编号，例如胰蛋白酶有一由国际生化联合会团委员会公布的酶分类(用EC标示)编号为3、4、2l、4， 这里第一个数字“3”表示它是水解酶； 第二个数字“4”表示它是蛋白酶水解肽键； 第三个数字“21”表示它是丝氨酸蛋白酶，在活性部位上有一至关重要的丝氨酸残基； 第四个数字“4”表示它是这一类型中被指认的第四个酶。作为对照，胰凝乳蛋白酶的EC编号为3、4、2l、l，弹性蛋白酶编号为3、4、21、36。,67,值得注意的是来自不同物种或同一物种的不同组织或不同细胞器的同一种酶，虽然他们催化同一个生化反应，但它们本身的一级结构可能并不相同，命名也有所区别,CuZn-SOD Mn-SOD Fe-SOD,CuZn-SOD,牛细胞 CuZn-SOD,猪细胞 CuZn-SOD,SOD,讨论一个酶时， 需要说明来源和 名称,68,15,(1)氧化还原酶 在体内参与产能、解毒和某些生理活性物质的合成。重要的有各种脱氢酶、氧化酶、过氧化物酶、氧合酶、细胞色素氧化酶等。,(2)转移酶 在体内将某基团从一个化合物转移到另一化合物，参与核酸、蛋白质、糖及脂肪的代谢和合成。重要的有一碳基转移酶、酮醛基转移酶、酰基转移酶、糖苷基转移酶、含氮基转移酶、磷酸基转移酶、含硫基团转移酶等,(3)水解酶 在体内外起降解作用，也是人类应用最广的酶类。重要的有各种脂肪酶、糖苷酶、肽酶等。水解酶一般不需辅酶。,69,(4)裂合酶 这类酶可脱去底物上某一基团而留下双键，或可相反地在双键处加入某一基团。它们分别催化CC、C O、CN、CS、CX(F，C1，Br，I)和P-O键。,16,(6)连接酶(合成酶) 这类酶关系很多生命物质的合成，其特点是需要三磷酸腺苷等高能磷酸酯作为结合能源，有的还需金属离子辅助因子。分别形成CO键(与蛋白质合成有关)、CS键(与脂肪酸合成有关)、CC键和磷酸酯键。,(5)异构酶 此类酶为生物代谢需要而对某些物质进行分子异构化，分别进行外消旋差向异构、顺反异构、醛酮异构、分子内转移、分子内裂解等。,70,二、酶的组成和结构特点,71,酶的结构,二级结构,三级结构,一级结构,四级结构,酶的结构,72,酶的一级、二级、三级和四级结构示意图,73,酶的空间结构,四级 结构,三级结构,二级 结构,酶的空间结构,74,酶的一级结构,酶分子中氨基酸 的排列顺序。,酶的化学结构,酶的一级结构,75,酶的二级结构,多肽链主 链原子的 局部空间 排列,酶的 二级 结构,没有考虑到它的侧链的构象或与其它部分的相互关系,螺旋结构,-折叠,76,酶蛋白的-螺旋结构,77,酶蛋白的折叠结构,78,由-螺旋、折叠和随机结构 构成的溶菌酶的空间结构,79,酶的三级结构,指单一的多肽链 或共价连接的多 肽链中，所有原 子在空间上的排 列,酶的三 级结构,在二极结构的基础上，肽链通过进一步转曲折叠而成,80,酶的四级结构,各亚基在寡 聚酶中的空 间排布及其 相互作用,不考虑亚基的内部几何形状,酶的四 级结构,81,酶的四级结构,82,二、酶的组成和结构特点,虽然少数有催化活性的RNA分子已经鉴定，但几乎所有的酶都是蛋白质，因而酶必然有四级空间结构形式，其中： 一级结构是指具有一定氨基酸顺序的多肽链的共价骨架， 二级结构为在一级结构中相近的氨基酸残基间由氢键的相互作用而形成的带有螺旋、折叠、转角、卷曲等细微结构， 三级结构系在二级结构基础上进一步进行分子盘曲的形成包括主侧链的专一性三维排列， 四级结构是指低聚蛋白中各折叠多肽链在空间的专一性三维排列。具有低聚蛋白结构的酶(寡聚酶)必须具有正确的四级结构才有活性。 具有活性的酶都是球蛋白，即被广泛折叠、结构紧密的多肽链，其氨基酸亲水基团在外表，而疏水基团向内。,17,83,单体酶,酶的存在类别,寡聚酶,多酶融合体,多酶复合体,84,单体酶,一条 肽链 组成,单 体 酶,分子量通 常在35 kDa 以下,不含四 级结构,单体酶的 种类很少， 一般多是 催化水解 反应的酶， 绝大多数 单体酶只 表现一种 酶活性,85,寡聚酶,两个 或两 个以 上亚 基组 成,寡 聚 酶,分子量一般 高于30 kDa,含四 级结构,相当数量的 寡聚酶是调 节酶，其活 性可受各种 形式的灵活 调节，在调 节控制代谢 过程中起着 非常重要的 作用,构成寡聚酶的亚基可以是相同的，也可以是不同的，亚基与亚基之间一般是以非共价键、对称的形式排列,86,寡聚酶,87,多酶复合体,两个或 两个以 上的酶,多 酶 复 合 体,靠共价 键连接,一个酶催化一个 反应，所有反应 依次连接，构成 一个代谢途径或 代谢途径的一部 分，由于这一连 串反应是在一高 度有序的多酶复 合体内完成，反 应效率非常高,88,多酶复合体,酶2,酶3,酶1,酶4,酶6,酶5,89,一条多肽链上含有两种或两种以上催化活性的酶，这些酶可以是单体酶，也可以是寡聚酶或是更复杂的多酶复合体,多酶融合体,90,酶蛋白有3种组成形式,单体酶，仅有一个活性部位的多肽链构成的酶，分子质量为1335ku(1u=1Dalton )。为数不多，且都是水解酶； 寡聚酶，由若干相同或不同亚基结合而组成的酶，亚基一般无活性，必须相互结合才有活性，分子质量为35ku以上到致百万单位； 多酶复合体，指多种酶进行连续反应的体系。前一个反应产物为后一反应的底物。 仅有少部分酶是由单一蛋白部分所组成，即酶蛋白本身无活性，需要在辅因子存在下才有活性。辅因子可以是无机离子，也可以是有机化合物，它们都属于小分子化合物。有的酶仅需其中一种，有的酶则二者都需要。 约有25的酶含有紧密结合的金属离子或在催化过程中需要金属离子，包括铁、铜、锌、镁、钙、钾、钠等，它们在维持酶的活性和完成酶的催化过程中起作用。,18,91,酶的组成,一.酶的化学组成 1.单成分酶（单纯蛋白质/简单蛋白质） 2.双成分酶（结合蛋白质） (1)蛋白质部分（酶蛋白） 稳定辅因子 (2)非蛋白质部分（辅因子） 起催化作用 小分子有机化合物 金属离子 全酶=酶蛋白+辅因子,92,19,有机辅因子可依其与酶蛋白结合的程度分为辅酶和辅基。 前者为松散结合； 后者为紧密结合， 但有时把它们统称为辅酶。 大多数辅酶为核苷酸和维生素或它们的衍生物(表l-2)。它经常是生物体食物的必需成分，因此当供应不足时，即引起缺乏性疾病。上述6类酶中，除水解酶和连接酶外，其他酶在反应时都需要特定的辅酶。,93,辅基/辅酶和维生素,1.维生素的概念 脂溶性维生素： A(视黄醇) D E(生育酚) K 维生素 硫辛酸（氧化型） 水溶性维生素：Vc（抗坏血酸） VB: B1(硫胺素) B2(核黄素) B3(泛酸) B5(PP) B12（钴胺素） B6 (吡哆醇/醛/胺） B7 (生物素 ） 硫辛酸（还原型）,94,95,2.辅基辅酶在酶促反应中的作用传递电子 、原子或某些基团,96,传递氢的辅基/辅酶 1. 辅酶I/辅酶II及维生素PP 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（ NAD/ CoI ） 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 （ NADP/CoII） NAD+（ NADP+ ） NAD(P )H + H+,+2H+ , 2e,-2H+ ,2e,97,2. 黄素核苷酸和维生素B2 (1) 黄素单核苷酸（FMN) (2) 黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD) FMN （FAD) FMNH2（FADH2) 3. 维生素C（抗坏血酸） 4. 泛醌（辅酶Q) 5. 谷胱甘肽 2GSH GSSG,+2H+ , +2e,-2H+ ,-2e,-2H,+2H+ +2H+,+2H,98,二.传递电子的辅基铁卟啉 Fe 3+ Fe 2+ 三.转移基团的辅基/辅酶 1.传递磷酸根的辅酶腺苷磷酸酯 (ATP/ADP/AMP) 转移磷酰基 ATP + S ADP + P-S 转移糖基 ATP + 糖-P ADP-糖 + PPi 转移AMP ATP + FMN FAD + PPi 转移腺苷 ATP + Met + H2O 腺苷- Met + PPi + Pi 能量的载体 ATP + H2O ADP + Pi,+e,-e,99,三.转移基团的辅基/辅酶 2.脱羧的辅酶硫胺素焦磷酸（TPP) 硫胺素+ATP TPP + AMP 3.转移酰基的辅酶 （1）辅酶A和泛酸 CoA-SH + RCOOH CoA-S-COR + H2O CoA-S-COR +底物 底物- COR + CoA-SH （2）硫辛酸和VB1,硫胺素激酶,100,4.转移氨基的辅酶和VB6 磷酸吡哆醛（PLP)/磷酸吡哆胺(PMP) AA 酮酸 PCHO PCH2NH2 5.固定CO2的辅酶生物素(VB7 、 VH） 6.转移一碳基团的辅酶 (1)四氢叶酸（FH4) (2)钴铵素(VB12),酮酸,AA,101,三、酶的作用机制,酶一般是通过其活性中心，通常是其氨基酸侧链基团先与底物形成一个中间复合物，随后再分解成产物，并放出酶。 酶的活性部位(active site)是它结合底物和将底物转化为产物的区域，通常是整个酶分子相当小的一部分，它是由在线性多肽链中可能相隔很远的氨基酸残基形成的三维实体。 活性部位通常在酶的表面空隙或裂缝处，形成促进底物结合的优越的非极性环境。,20,102,酶 的 活 性 中 心,酶分子中的 氨基酸残基,辅酶或辅助因子 或它们的部分 结构,酶的活性中心构成,103,酶活性中心示意图,104,在活性部位，底物被多重的、弱的作用力结合(静电相互作用、氢键、范德华键、疏水相互作用)，在某些情况下被可逆的共价键结合。酶结合底物分子，形成酶-底物复合物(enzyme-substrate-complex)。 酶活性部位的活性残基与底物分子结合，首先将它转变为过渡态，然后生成产物，释放到溶液中。这时游离的酶与另一分子底物结合，开始它的又一次循环。,105,酶与底物结合的两种模型,1894年Emil Fischer提出锁和钥匙模型(Lock-and-key Model)，底物的形状和酶的活性部位被认为彼此相适合，像钥匙插入它的锁中图1-1(a)，两种形状被认为是刚性的(rigid)和固定的(fixed)，当正确组合在一起时，正好互相补充。 诱导契合模型(induced-fit model)是1958年由Daniel EKoshland Jr提出的，底物的结合在酶的活性部位诱导出构象变化图l-l(b)。,106,此外，酶可以使底物变形，迫使其构象近似于它的过渡态。例如，葡萄糖与己糖激酶的结合，当葡萄糖刚刚与酶结合后，即诱导酶的结构产生一种构象变化，使活化部位与底物葡萄糖形成互补关系。不同的酶表现出两种不同的模型特征，某些是互补性的，某些是构象变化。,107,锁 钥 学 说,108,诱导契合学说,109,第三节 酶作为催化剂的显著特点,酶与化学催化剂比较具有显著的特性。最重要的有三方面： 高催化效率、 强专一性及 酶活性可以调控。,22,110,酶催 化作 用的 特点,加快反应速度,降低反应 的活化能,不改变 反应性质,反应前后其数 量和性质不变,催化效率高,专一性强,反应条件温和,酶的催化活性 受到调节 和控制,共性,特性,酶催化作用的特点,111,一、催化能力,酶加快反应速度可高达1017倍(如OMP脱羧酶)。 但酶催化反应速度和在相同pH及温度条件下非酶催化反应速度的可直接比较的例子很少，这是因为非酶催化的反应速度太低，不易观察。对那些可比较的反应，可发现反应速度大大加速(见下例)。,23,112,极高的催化效率,2H2O2 2H2O+O2,Fe2+作为催化剂 催化效率为 610-4 mol/(mol.s),过氧化氢酶，催化效率 为6106 mol/(mol.s),过氧化氢酶比Fe2+的催化效率要高出1010倍,酶的催化效率相对其他无机 或有机催化剂要高1061013倍,例子,113,例如:,如乙酰胆碱酯酶接近l013倍， 丙糖磷酸异构酶为109倍， 分支酸变位酶为1.9X106倍， 四膜虫核酶接近1011倍(表1-6)。 在其他可比较的反应中，酶促反应速度相当高，而反应温度可能很低。 酶催化的最适条件几乎都为温和的温度和非极端pH。以固氮酶为例，NH3的合成在植物中通常是25和中性pH下由固氮酶催化完成，酶是由两个解离的蛋白质组分组成的一个复杂的系统，其中一个含金属铁，另一个含铁和钼，反应需消耗一些ATP分子，精确的计量关系还未知。但工业上由氮和氢合成氨时，需在温度700900 K，压力1090 MPa下，还要有铁及其他微量金属氧化物作催化剂才能完全反应。,114,+,24,返回,115,二、专一性,116,高度专一性,酶对它所作用的底物有严格的选择性，一种酶只能 催化某一类，甚至是某一种物质起化学反应,酶的专一性,底物专一性,反应专一性,立体异构专一性 (手性、区域),从根本上保证了生物体内为数众多的各种各样的化学反应能有条不紊地协同进行,117,大多数酶对所作用的底物和催化的反应都是高度专一的。不同的酶专一性程度不同，有些酶专一性很低(键专一性)，如肽酶、磷酸(酯)酶、酯酶，可以作用很多底物，只要求化学键相同。 例如它们可分别作用肽、磷酸酯、羧酸酯。 生物分子降解中常见到低专一性的酶，而在合成中则很少见到，这是因为前者是起降解作用，低专一性可能更为经济。,25,118,具有中等程度专一性的为基团专一性，如己糖激酶可以催化很多己醛糖的磷酸化。 大多数酶呈绝对或几乎绝对的专一性，它们只催化一种底物进行快速反应，如脲酶只催化尿素的反应或以很低的速度催化结构非常相似的类似物。,119,基团专一性和绝对专一性对低分子量的底物来说容易理解。对大分子底物而言，由于酶的活性中心只与大分子的一部分相互作用，因此情形有点不同，限制性核酸内切酶一般可识别DNA上46对碱基，然后切除双链间的磷酸二酯键，一般切成粘性末端。 现已知道有400多种不同专一性的这类酶，虽然酶对含有合适序列的任何DNA分子或片段都能作用，但每一个酶的活性中心接触底物的特定区域具有绝对的专一性。,120,立体专一性,酶的另一个显著特点就是催化反应的立体专一性。以NAD+和NADP+为辅因子的脱氢酶为例，用适当标记的底物做实验，发现脱氢酶催化底物上的氢转移到尼克酰胺环特异的一面，称为A型脱氢酶和B型脱氢酶(图1-5)。 几乎所有的脱氢酶作用时都需要NAD+或NADP+。 对那些已知立体结构的脱氢酶，如肝乙醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶，其专一性机制已经搞清。,121,122,潜手性,在酶催化反应中，还存在潜手性例子，虽然底物本身不具有手性，但反应却是立体专一性的。以延胡索酸水合酶催化延胡索酸生成苹果酸为例，在3H20溶液中，3H以立体专一性方式加入到底物上(图1-6)。,123,潜手性专一性？,大多数脱氢酶对尼克酰胺核苷酸辅酶NAI(P)+或者NAD(P)H中的尼克酰胺环第四位碳原子(C-4)上的两个氢表现特殊的立体专一性，称为潜手性(prochirality)专一性。 虽然尼克酰胺环上的C-4既非不对称碳，也非顺反异构特征，但脱氢酶却都能专一地识别并作用这个碳原子上两个氢中的一个。正因为这个原故，以尼克酰胺核苷酸为辅酶的脱氢酶可以此分为A，B两型，如图1-5(A)；潜手性专一性也可在脱氢酶以外的其他酶反应中观察到。,124,高度专一性,酶催化 专一性 作用机 制假说,锁钥假说,诱导契合假说,125,三、调节性,生命现象表现了它内部反应历程的有序性。这种有序性是受多方面因素调节和控制的而酶活性的控制又是代谢调节作用的主要方式。酶活性的调节控制主要有下列7种方式。,27,1酶浓度的调节,酶浓度的调节主要有两种方式：一种是诱导或抑制酶的合成；一种是调节酶的降解。例如，在分解代谢中，-半乳糖苷酶的合成，平时是处于被阻遏状态，当乳糖存在时，抵消了阻遏作用，于是酶受乳糖的诱导而合成。,126,2.激素调节,激素调节也和生物合成有关，但调节方式有所不同。如乳糖合成酶有两个亚基，催化亚基和修饰亚基。 催化亚基本身不能合成乳糖，但可以催化半乳糖以共价键的方式连接到蛋白上形成糖蛋白。修饰亚基和催化亚基结合后，改变了催化亚基的专一性，可以催化半乳糖和葡萄糖反应生成乳糖。修饰亚基的水平是由激素控制的。妊娠时，修饰亚基在乳腺生成，分娩时，由于激素水平急剧的变化，修饰亚基大量合成，它和催化亚基结合，大量合成乳糖。,127,3共价修饰调节,共价修饰这种调节方式本身又是通过酶催化进行的。在一种酶分子上，共价地引入一个基团从而改变它的活性。引入的基团又可以被第三种酶催化除去。 例如，磷酸化酶的磷酸化和去磷酸化；大肠杆菌谷氨酰胺合成酶的腺苷酸化和去腺苷酸化就是以这种方式调节它们的活性。,28,128,4限制性蛋白水解作用与酶活力调控,限制性蛋白酶水解是一种高特异性的共价修饰调节系统。细胞内合成的新生肽大都以无活性的前体形式存在，一旦生理需要，才通过限制性水解作用使前体转变为具有生物活性的蛋白质或酶，从而启动和激活以下各种生理功能，如酶原激活、血液凝固、补体激活等。 除了参与酶活性调控外，还起着切除、修饰、加工等作用，因而具有重要的生物学意义。,129,酶原激活,酶原激活是指体内合成的非活化的酶前体，在适当条件下，受到H+或特异的蛋白酶限制性水解，切去某段肽或断开酶原分子上某个肽键而转变为活性的酶。 如胰蛋白酶原在小肠里被其他蛋白水解酶限制性地切去一个六肽，活化成为胰蛋白酶。,130,血液凝固,血液凝固是由体内十几种蛋白质因子参加的级联式酶促激活反应，其中大部分为限制性蛋白水解酶。 在凝血过程中首先由蛋白质因子(称为因子xa的蛋白酶)激活凝血酶原，生成活性凝血酶；并由它再催化可溶性的纤维蛋白原，转变成不稳定的可溶性纤维蛋白，聚集成网状细丝，以网住血液的各种成分。在凝血酶作用下，收缩成血块，使破损的血管封闭而修复。,131,补体,补体是一类血浆蛋白，和免疫球蛋白一样发挥防御功能。 免疫球蛋白对外来异物有“识别”结合作用和激活补体作用。 补体是一组蛋白酶(由11种蛋白组分组成)，通常非活性前体形式存在于血清中，一旦接受到Ig(免疫球蛋白)传来的抗原入侵信号，被限制性蛋白酶水解而激活补体组分，最终形成“攻膜复合物”执行其功能。,132,5抑制剂的调节,酶的活性受到大分子抑制剂或小分子抑制剂抑制，从而影响活力。 前者如胰脏的胰蛋白酶抑制剂(抑制酶)； 后者如2,3-二磷酸甘油酸，是磷酸变位酶的抑制剂。,30,。,133,6反馈调节,许多小分子物质的合成是由一连串的反应组成的。催化此物质生成的第一步反应的酶，往往可以被它的终端产物所抑制，这种对自我合成的抑制叫反馈抑制。这在生物合成中是常见的现象。 例如，异亮氨酸可抑制其合成代谢通路中的第一个酶苏氨酸脱氨酶。当异亮氨酸的浓度降低到一定水平时，抑制作用解除，合成反应又重新开始。 再如合成嘧啶核苷酸时终端产物UTP(尿苷三磷酸)和CTP(胞苷三磷酸)可以控制合成过程一连串反应中的第一个酶。 反馈抑制就是通过这种调节控制方式，调节代谢物流向，从而调节生物合成,134,7金属离子和其他小分子化合物的调节,有一些酶需要K+活化，NH4+往往可以代替K+，但Na+不能活化这些酶，有时还有抑制作用，这一类酶有L-高丝氨酸脱氢酶、丙酮酸激酶、天冬氨酸激酶和酵母丙酮酸羧化酶。 另一些酶需要Na+活化，K+起抑制作用，如肠中的蔗糖酶可受Na+激活，二价金属离子如Ca2+、Zn2+ 、Mn2+ 、Mg2+ 往往也为一些酶表现活力所必需，它们的调节作用还不很清楚，可能和维持酶分子一定的三级、四级结构有关，有的则和底物的结合和催化反应有关。这些离子的浓度变化都会影响有关的酶活力。,31,135,能荷的数值是01，当腺苷酸全部以AMP的形式存在时，能荷数值等于0；全部以ATP形式存在，能荷数值等于1。细胞内的能荷数值一般在0.80.9之间，在这个范围内，能荷数值的增加可使和ATP再生有关的酶(如糖磷酸激酶、丙酮酸激酶、丙酮酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶和柠檬酸合成酶等)的反应速度降低；而使另一类和利用ATP有关的酶(天冬氨酸激酶、磷酸核糖焦磷酸合成酶等)的反应速度增加。 此外，酶的区室化(compartmentationn)和多酶复合体等都和酶活力的调节控制有密切关系。,32,136,第四节 影响酶活力的因素,一.酶的测定,33,酶蛋白的存在量可以根据它催化所产生的效应即把底物转化为产物来进行测定。 为了测定酶(检测酶的活性)必须了解催化反应总的反应式，而且分析程序必须能够测定底物的消失或产物的生成。此外，还必须考虑酶是否需要某种辅助因子(cofactor)，酶的最适pH、最适温度。对哺乳动物的酶，最适温度通常在2537。最后，测定的反应速率是酶的活性，它必须不受底物供应不充分的限制。因此，一般要求非常高的底物浓度以使实验测定的起始反应速率与酶浓度成正比。,137,酶最方便的测定是测量产物出现的速率或底物的消失速率。,如果底物(或产物)在特殊波长下吸收光，根据它们在此波长下吸收光的变化即可测得这些分子的浓度变化。这可用分光光度计(spectrophotometer)来完成。因为光吸收与浓度成正比例，光吸收改变的速率与酶活力，即每单位时间底物用去的物质的量(或产物形成的物质的量)成正比。,138,最常用的分子：,在酶测定中利用吸收光测量的两个最常用的分子是还原型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NDPH)。 它们在紫外光(UV)区的吸收波长为340 nm，因此，如果NADH或NADPH在反应过程中产生，那么在340 nm的光吸收将相应地增加。如果，当反应是NADH或NADPH分别氧化为NAD+或NADP+时，吸收将会相应地降低，因为它们的氧化型在波长340 nm处不吸收光。 一个实例是乳酸脱氢酶，以乳酸作为底物的活力可依据下示方程，用随之增加的340 nm的光吸收进行测定。,34,139,二、酶联测定法,许多反应，它们吸收光的适合波长不包括底物和产物。在这种情况下测定催化此反应的酶，将其与第二个具有特殊吸收光变化的酶反应相连接(linking)(或偶联coupling)，通常是可行的。例如，利用葡萄糖氧化酶(glucose oxidase)的作用，可经常用于测量糖尿病人血液中葡萄糖的浓度，由底物转化为产物不造成吸收光的变化。但是，在此反应中产生的过氧化氢能被第二种酶过氧化物酶作用，并把一个无色化合物转化为有色化合物色素原(chromogen)，它的光吸收能容易地进行测量。,35,如要对第一个酶(葡萄糖氧化酶)的活力作精确的测量，第二个酶(过氧化物酶)和它的共底物或辅酶必须过量，使酶联测定不属限速步骤。这可保证有色色素原的产生速率与H2O2的产生速率成正比，它的产生又与葡萄糖氧化酶的活力成正比。,140,三、酶速度,酶催化反应的速率通常称作酶速度(velocity)。酶速度通常记录为时间为零时的值(V。，单位为molmin)，因为产物尚未出现，在这点上速率是最快的。这是因为在任何底物转化为产物之前底物浓度是最大的。还因为酶可能受到它本身产物的反馈抑制(feedbackinhibition)和/或包括逆反应，而且反应产物将刺激逆反应。,36,，,141,酶促反应形成的产物对时间的典型的图表明：,产物迅速形成的起始期，构成图形的线性部分(图1-7)，随后，酶速度缓慢下降，因为底物已用尽和/或酶失去活力；Vo的获得是以零时点(time-point)为起点作一与曲线的线性部分相切的直线，这一直线的斜率即等于Vo。,142,酶活力单位(enzyme units)可以用许多方式表示。最普通的是被催化的反应的起始速度(Vo)(如每分钟底物转换的物质的量，单位为molmin)。也有两种酶活力的标准单位，即：酶单位(U)和“开特”(kat)。 酶的1个活力单位是在该酶的最适条件下，在25，1 min内催化1mol的底物转化为产物的酶量。 “开特”是酶活力的国际单位(s)，它规定在特定体系下，反应速度为每秒转化1mol底物所需的酶量。在两种不同的酶活力单位之间可用l molminl U16.67 nkat换算。,37,143,酶活力(或总活力)涉及在样品中酶的总单位。 比活力是每毫克蛋白质中酶单位的数量(Umg)。比活力是酶纯度的量度， 在酶的纯化过程中它的比活力增高，当酶提纯时，其比活力值成为极大和恒定。,144,四、底物浓度,酶速度对底物浓度(S)的依赖关系的正常模式是，在低的底物浓度下，S增加1倍，将导致起始速度(Vo)也增加1倍。然而，在较高底物浓度下，酶被饱和(saturated),进一步增高S，只导致V。的微小变化。这是因为在有效的饱和底物浓度下，所有酶分子已有效地与底物结合，这时，总的酶速度依赖于产物自酶解离下的速率，若进一步加入底物对酶速度也将不发生影响。V。对S的关系图形称为双曲线(hyperbolic curve) (图l-8)。,38,145,五、酶浓度,在底物浓度饱和的情况下(即所有酶分子都与底物结合)，酶浓度的加倍将导致V。的加倍。 Vo与酶浓度的关系图为直线图形。,39,146,六、温度,温度从两方面影响酶促反应的速率。 首先，升高温度增加底物分子的热能(thermal energy)，增高反应的速率。 然而较高温度会带来第二种效应，增加构成酶本身蛋白质结构的分子热能，也就增加了多重弱的非共价键相互作用(氢键、范德华引力等)破裂的机会。 这些相互作用维系着整个酶的三维结构，最终将导致酶的变性(伸展unfolding)。 酶的三维构象甚至微小的变化都会改变活性部位的结构，导致催化活性的降低。,40,147,升高温度以提高反应速率的总效应是这两个相反效应之间的平衡。因此温度对Vo关系的图形将为一条曲线，它可清楚地表示出最适温度图1-9(a)。 多数哺乳动物的酶，其最适温度为37左右，但也有些生物机体的两适应在相当高或相当低温度下工作。例如，用于聚合酶链式反应的Taq聚合酶(Taq polymerase)是在温泉中、生活在高温下的细菌中发现的，因此适于在高温下工作。,148,七、pH,每个酶都有最适pH，在此pH下催化反应的速率是它的最高值。最适pH的微小偏离，由于使酶活性部位的基团离子化发生变化而降低酶的活力。pH发生较大偏离时，维护酶三维结构的许多非共价键受到干扰，导致酶蛋白自身的变性。Vo对pH的关系图形通常将得到钟形曲线图1-9(b)。,41,返回,149,许多酶的最适pH在6.8左右，但是各种酶的最适pH是多种多样的，因为它们要适应不同环境进行工作。例如，消化酶胃蛋白酶(pepsin)要适应在胃的酸性pH下工作(大约pH2.0)。,150,第五节 酶动力学和抑制作用,一、米-曼氏模式,42,米曼氏模式(Mchaelis-Mentonton model)使用如下的酶催化概念：,这里速率常数(rate constants)k1、k2和k3是描述与催化过程的每一步相联系的反应速度。,151,酶-底物复合物,酶(E)与它的底物(S)结合形成酶-底物复合物(ES)。ES复合物能重新解离形成E+S，或能继续进行化学反应形成E和产物P。 假设：酶与产物(E+P)的逆向反应形成ES复合物的速率并不明显。对许多酶的性质的观察得知，在低的底物浓度S下，起始速度(Vo)直接与S成正比， 而在高底物浓度S下，速度趋向于最大值，此时反应速率与S无关图l-10(a)。此最大速度(maximum velocity)称为Vmax(单位为molmin)。,152,43,返回42,米-曼氏推导的公式描述出实验观察的结果。米-曼氏公式如下：,此公式描述的双曲线形式，由实验数据在图l-10(a)中表明。Michaelis 和Menton在推导此公式时，规定一新的常数即Km，称为米氏常数(其单位与物质的量浓度相同，用mol/L)：,返回45,153,Km？,Km是ES复合酶的稳定性的量度，等于复合物的分解速率的总和，它大于生成速率。 对许多酶而言，k2比k3大得多。在这些情况下Km变为酶对它的底物的亲和力(affinity)的量度。因为它的值分别依赖于ES生成和解离即k1和k2的相关值。 高的Km表示弱的底物结合(k2大大超过k1)，低的Km表示强底物结合(k1大大超过k2)。Km值可由实验取得，根据这一事实，即Km值等于当反应速度达到最大值Vmax一半时的底物浓度。,44,154,二、Lineweaver-Burk作图,因为Vmax是在极大的底物浓度下获得的，它不可能从双曲线图测得(Km也是如此，见图l-10(a)，但是Vmax和Km可用实验求得，即在不同底物浓度下测定Vo值，然后即可根据1Vo对lS的双对数(double reciprocal)或Lineweave-Burk制图图l-10(b)，此种作图是从米-曼氏公式衍生得出的：,45,由此公式得出一条直线，在y轴上截距等于1Vmax，x轴上截距等于-1Km直线的斜率等于KmVmax图1-10(b)。Lineweaver-Burk图也是测定抑制剂如何与酶结合的有用方法(见下文)。,155,例外！,虽然米-曼氏模式对许多酶提供了很好的实验数据模式，但有少数酶与米-曼氏的动力学不相符合，如天冬氨酸转氨甲酰酶(ATCase)，这些酶称为变构酶(allosteric enzyme)。,156,三、酶的抑制作用,许多类型的分子有可能干扰个别酶的活性。任何分子直接作用于酶使它的催化速率降低即称为抑制剂(inhibitor)。 某些酶的抑制剂是