鼠伤寒沙门氏菌／回复突变试验

八、鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验Salmonella Typhimurium / Reverse Mutation Assay1 范围本规范确定了鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验的基本原则、要求和方法。本规范适用于化妆品原料及其产品的基因突变检测。2 规范性引用文件OECD Guidelines for Testing of Chemicals (No.471,Adopted:21,July 1997)。3 定义3.1 回复突变（Reverse mutation）细菌在化学致突变物作用下由营养缺陷型回变到原养型(prototroph)。3.2 基因突变 （Gene mutation）在化学致突变物作用下细胞DNA中碱基对的排列顺序发生变化。3.3 碱基置换突变 （Base substitution mutation）引起DNA链上一个或几个碱基对的置换。碱基置换有转换(transition)和颠换(transversion)两种形式。转换是DNA链上的一个嘧啶被另一嘧啶所替代，或一个嘌呤被另一嘌呤所代替。颠换是DNA链上的一个嘧啶被另一嘌呤所替代，或一个嘌呤被另一嘧啶所代替。3.4 移码突变（ Frameshift mutation）引起DNA链上增加或缺失一个或多个碱基对。3.5 鼠伤寒沙门氏菌/回复突变试验（ Salmonella typhimurium/reverse mutation assay） 利用一组鼠伤寒沙门氏组氨酸缺陷型试验菌株测定引起沙门氏菌碱基置换或移码突变的化学物质所诱发的组氨酸缺陷型(his-)原养型(his+)回复突变的试验方法。3.6 S9 经多氯联苯(PCB混合物)或苯巴比妥钠和-萘黄酮结合诱导的大鼠制备肝匀浆，在9000g下离心10min后的肝匀浆上清液。4 原理鼠伤寒沙门氏组氨酸营养缺陷型菌株不能合成组氨酸，故在缺乏组氨酸的培养基上，仅少数自发回复突变的细菌生长。假如有致突变物存在，则营养缺陷型的细菌回复突变成原养型，因而能生长形成菌落，据此判断受试物是否为致突变物。某些致突变物需要代谢活化后才能引起回复突变， 故需加入经诱导剂诱导的大鼠肝制备的S9混合液。5 仪器和设备 培养箱、恒温水浴、振荡水浴摇床、压力蒸汽消毒器、干热烤箱、低温冰箱(-80) 或液氮生物容器、普通冰箱、天平(精密度0.1g和0.0001g)、混匀振荡器、匀浆器、菌落计数器、低温高速离心机，玻璃器皿等。6 培养基和试剂6.1 0.5mmol/L组氨酸-0.5mmol/L生物素溶液 成分： L-组氨酸(MW 155) 78mg D-生物素(MW 244) 122mg 加蒸馏水至1000mL 配制：将上述成分加热，以溶解生物素，然后在0.068MPa下高压灭菌20min。贮于4冰箱。6.2 顶层琼脂培养基 成分： 琼脂粉1.2g 氯化钠1.0g 加蒸馏水至200mL 配制：上述成分混合后，于0.103MPa下高压灭菌30min。实验时，加入0.5mmol/L组氨酸0.5mmol/L生物素溶液20mL。6.3 Vogel-Bonner (V-B) 培养基E 成分：枸椽酸(C6H8O7H2O)100g 磷酸氢二钾(K2HPO4)500g 磷酸氢铵钠(NaNH4HPO44H2O)175g 硫酸镁(MgSO47H2O)10g 加蒸馏水至1000mL 配制：先将前三种成分加热溶解后，再将溶解的硫酸镁缓缓倒入容量瓶中，加蒸馏水至1000mL。于0.103MPa下高压灭菌30min。储于4冰箱。6.4 20%葡萄糖溶液 成分：葡萄糖200g 加蒸馏水至1000mL 配制：加少量蒸馏水加温溶解葡萄糖，再加蒸馏水至1000mL。于0.068MPa下高压灭菌20min。储于4冰箱。6.5 底层琼脂培养基 成分：琼脂粉7.5g 蒸馏水480mL V-B培养基E10mL 20%葡萄糖溶液10mL 配制：首先将前两种成分于0.103MPa下高压灭菌30min后，再加入后两种成分，充分混匀倒底层平板。按每皿25mL制备平板，冷凝固化后倒置于37培养箱中24h，备用。6.6 营养肉汤培养基 成分：牛肉膏2.5g 胰 胨5.0g 磷酸氢二钾(K2HPO4)1.0g 加蒸馏水至500mL 配制：将上述成分混合后，于0.103MPa下高压灭菌30min。储于4冰箱。6.7 盐溶液(1.65mol/L KCl+0.4mol/L MgCl2) 成分：氯化钾(KCl)61.5g 氯化镁(MgCl26H2O)40.7g 加蒸馏水至500mL 配制：在水中溶解上述成分后，于0.103MPa下高压灭菌30min。储于4冰箱。6.8 0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4) 成分：磷酸二氢钠(NaH2PO42H2O)2.965g 磷酸氢二钠(Na2HPO412H2O)29.015g 加蒸馏水至500mL 配制：溶解上述成分后，于0.103MPa下高压灭菌30min。储于4冰箱。6.9 S9混合液 成分每毫升S9混合液 肝S9100ml 盐溶液20ml 灭菌蒸馏水380ml 0.2mol/L磷酸盐缓冲液500ml 辅酶II(NADP)4mmol 6-磷酸葡萄糖(G-6-P)5mmol 配制：将辅酶II和6-磷酸葡萄糖置于灭菌三角瓶内称重，然后按上述相反的次序加入各种成分， 使肝S9加到已有缓冲液的溶液中。该混合液必须临用现配，并保存于冰水浴中。实验结束，剩余S9混合液应该丢弃。6.10 菌株鉴定用和特殊用途试剂6.10.1 组氨酸生物素平板 成分：琼脂粉15g 蒸馏水944mL (V-B)培养基E20mL 20%葡萄糖20mL 灭菌盐酸组氨酸水溶液(0.5g/100mL)10mL 灭菌0.5mmol/L生物素溶液6mL 配制：高压灭菌琼脂和水后，将灭菌20%葡萄糖，V-B培养基和组氨酸溶液加进热的琼脂溶液中。待溶液稍为冷却后，加入灭菌生物素，混匀，浇制平板。6.10.2 氨苄青霉素平板和氨苄青霉素/四环素平板 成分：琼脂粉15g 蒸馏水940mL (V-B)盐溶液20mL 20%葡萄糖20mL 灭菌盐酸组氨酸溶液（0.5g/100mL）10mL 灭菌0.5mmol/L生物素溶液6mL 氨苄青霉素溶液(8mg/mL于0.02mol/LNaOH中)3.15mL 四环素溶液(8mg/mL于0.02mol/L HCl中) 0.25mL配制：琼脂和水高压灭菌20min，将无菌的葡萄糖、VB盐溶液和组氨酸生物素溶液加进热的溶液中去，混匀。冷却至大约50，无菌条件下加入四环素溶液和/或氨苄青霉素溶液。应该在倾注琼脂平板后几天内，制备主平板。6.10.3 营养琼脂平板 成份：琼脂粉7.5g 营养肉汤培养基500mL 配制：于0.103MPa下高压灭菌30min后倾注平板。7 试验菌株及其生物学特性鉴定7.1 试验菌株 采用TA97、TA98、TA100和TA102一组标准测试菌株。7.2 生物学特性鉴定新获得的或长期保存的菌种，在试验前必须进行菌株的生物特性鉴定。菌株鉴定的判断标准，如表1所示。表1 试验菌株鉴定的判断标准菌株组氨酸缺陷脂多糖屏障缺损氨苄青霉素抗性切除修复缺损四环素抗性自发回变菌落数*TA97TA98TA100TA102+-+90-18030-50100-200240-320注“+”表示需要组氨酸“+”表示具有rfa突变“+”表示具有R因子“+”表示具有uvrB突变“+”表示具有pAQ1质粒*在体外代谢活化条件下自发回变菌落数略增7.2.1 组氨酸缺陷原理：组氨酸缺陷型试验菌株本身不能合成组氨酸，只能在补充组氨酸的培养基上生长，而在缺乏组氨酸的培养基上，则不能生长。鉴定方法：将测试菌株增菌液分别于含组氨酸培养基平板和无组氨酸平板上划线，于37下培养24h后观察结果。结果判断：组氨酸缺陷型菌株在含组氨酸平板上生长，而在无组氨酸平板上则不能生长。7.2.2 脂多糖屏障缺损原理：具有深粗糙（rfa）的菌株，其表面一层脂多糖屏障缺损，因此一些大分子物质如结晶紫能穿透菌膜进入菌体，从而抑制其生长，而野生型菌株则不受其影响。鉴定方法：吸取待测菌株增菌液0.1mL于营养琼脂平板上划线，然后将浸湿的0.1%结晶紫溶液滤纸条与划线处交叉放置。37下培养24h后观察结果。结果判断：假若待测菌在滤纸条与划线交叉处出现一透明菌带，说明该待测菌株具有rfa突变。7.2.3 氨苄青霉素抗性原理：含R因子的试验菌株对氨苄青霉素有抗性。因为R因子不太稳定，容易丢失，故用氨苄青霉素确定该质粒存在与否。鉴定方法：吸取待测菌株增菌液0.1mL，在氨苄青霉素平板上划线，37下培养24h后观察结果。结果判断；假若测试菌在氨苄青霉素平板上生长，说明该测试菌具有抗氨苄青霉素作用，表示含R因子，否则，表示测试菌不含R因子或R因子丢失。7.2.4 紫外线敏感性原理：具有uvrB突变的菌株对紫外线敏感，当受到紫外线照射后，不能生长，而具有野生型切除修复酶的菌株，则能照常生长。鉴定方法：吸取待测菌株增菌液0.1mL于营养琼脂平板上划线，用黑纸盖住平板的一半，置紫外灯下照射（15W，距离33cm）8秒钟。置37下孵育24h后观察结果。结果判断：具有uvrB突变的菌株对紫外线敏感，经辐射后细菌不生长，而具有完整的切除修复系统的菌株，则照常生长。7.2.5 四环素抗性原理：具有pAQI的菌株对四环素有抗性。鉴定方法：吸取待测菌株增菌液0.1mL于氨苄青霉素/四环素平板上划线，置37下孵育24h后观察结果。结果判断：假若测试菌照常在氨苄青霉素/四环素平板上生长，表明该测试菌株对氨苄青霉素和四环素两者有抗性，具有pAQI质粒，否则，说明测试菌株不含pAQI质粒。7.2.6 自发回变原理：每种试验菌株都以一定的频率自发地产生回变，称为自发回变。这种自发回变是每种试验菌株的一项特性。鉴定方法：将待测菌株增菌液0.1mL加到2mL含组氨酸生物素的顶层琼脂培养基的试管内，混匀后铺到于底层琼脂平板上，待琼脂固化后，置37培养箱中孵育48h后记数每皿回变菌落数。结果判断：每种标准测试菌株的自发回变菌落数应符合表1要求。经体外代谢活化后的自发回变菌落数，要比直接作用下的略高。7.2.7 回变特性诊断性试验原理：每种试验菌株对诊断性诱变剂回变作用的性质以及S9混合液的效应不一。鉴定方法：按照平板掺入试验的操作步骤进行。将受试物换成诊断性诱变剂。结果判断：标准菌株对某些诊断性诱变剂特有的回变结果参见表2。表2 测试菌株的回变性诱变剂剂量(mg)S9TA97TA98TA100TA102柔毛霉素叠氮化钠ICR191链霉黑素丝裂霉素C2,4,7-三硝基-9-芴酮4-硝基-O-次苯二胺4-硝基喹啉-N-氧化物甲基磺酸甲酯2-氨基芴苯并（a）芘6.0 1.5 1.0 0.25 0.5 0.20 20 0.5 1.0 10 1.0 -+124761640inhinh8377216052817417423373123363inhinh82441599292236194143473000185inhinh4007984220273030269375921880223027721602876586261255 注：inh表示抑菌。表中数值均已扣除溶剂对照回变菌落数。8 大鼠肝微粒体酶的诱导和S9的制备8.1 诱导最广泛应用的大鼠肝微粒体酶的诱导剂是多氯联苯（PCB混合物），选择健康雄性大鼠体重200g左右，一次腹腔注射诱导剂，剂量为500mg/kg体重。诱导剂溶于玉米油中，浓度为200mg/mL。苯巴比妥钠和-萘黄酮结合也可做为诱导剂。8.2 S9制备动物诱导后第五日断头处死。处死前12h停止饮食，但可自由饮水。首先，用75%酒精消毒动物皮毛，剖开腹部。在无菌条件下，取出肝脏，去除肝脏的结缔组织，用冰浴的0.15mol/L氯化钾溶液淋洗肝脏，放入盛有0.15mol/L氯化钾溶液的烧杯里。按每克肝脏加入0.15mol/L氯化钾溶液3mL。用电动匀浆器制成肝匀浆，再在低温高速离心机上，在4条件下，以9000g离心10min，取其上清液（S9）分装于塑料管中。每管装2 mL 3 mL。储存于液氮生物容器中或-80冰箱中备用。上述全部操作均在冰水浴中和无菌条件下进行。制备肝S9所用一切手术器械、器皿等，均经灭菌消毒。S9制备后，其活力需经诊断性诱变剂进行鉴定。9 溶剂的选择如果受试物为水溶性，可用灭菌蒸馏水作为溶剂；如为脂溶性，应选择对试验菌株毒性低且无致突变性的有机溶剂，常用的有二甲基亚砜（DMSO）、丙酮、95%乙醇。一般操作中，为了减少误差和溶剂的影响，常按每皿使用剂量用同一溶剂配成不同的浓度，固定加入量为100ml。10 剂量的设计决定受试物最高剂量的标准是对细菌的毒性及其溶解度。自发回变数的减少，背景菌变得清晰或被处理的培养物细菌存活数减少，都是毒性的标志。对原料而言，一般最高剂量组可为5mg/皿。对产品而言，有杀菌作用的受试物，最高剂量可为最低抑菌浓度，无杀菌作用的受试物，最高剂量可为原液。受试物至少应设四个剂量组。每个剂量均做三个平行平板。11 试验操作步骤11.1 增菌培养取营养肉汤培养基5mL，加入无菌试管中，将主平板或冷冻保存的菌株培养物接种于营养肉汤培养基内，37振荡（100次/min）培养10h。该菌株培养物应每毫升不少于12109活菌数。11.2 平板掺入法 实验时，将含0.5mmol/L组氨酸-0.5mmol/L生物素溶液的顶层琼脂培养基2.0mL分装于试管中，45水浴中保温，然后每管依次加入试验菌株增菌液0.1mL，受试物溶液0.1mL和S9混合液0.5mL（需代谢活化时），充分混匀，迅速倾入底层琼脂平板上，转动平板，使之分布均匀。水平放置待冷凝固化后，倒置于37培养箱里孵育48h。记数每皿回变菌落数。实验中，除设受试物各剂量组外，还应同时设空白对照、溶剂对照、阳性诱变剂对照和无菌对照。12 数据处理和结果判断记录受试物各剂量组、空白对照（自发回变）、溶剂对照以及阳性诱变剂对照的每皿回变菌落数，并求平均值和标准差。如果受试物的回变菌落数是溶剂对照回变菌落数的两倍或两倍以上，并呈剂量-反应关系者，则该受试物判定为致突变阳性。受试物经上述四个试验菌株测定后，只要有一个试验菌株，无论在加S9或未加S9条件下为阳性，均可报告该受试物对鼠伤寒沙门氏菌为致突变阳性。如果受试物经四个试验菌株检测后，无论加S9和未加S9均为阴性，则可报告该受试物为致突变阴性。13 试验报告试验报告应包括以下内容：（1）受试物名称、理化性状、配制方法、使用溶剂；（2）试验菌株：所用试验菌株；（3）代谢活化系统：所用诱导剂；（4）试验方法：简述操作步骤，除受试物剂量分组外，还应说明空白对照、溶剂对照和阳性对照， 阳性结果判定标准；（5）结果：以列表方式报告受试物的Ames实验结果（表1）；（6）结论。表1 Ames试验菌株的回变结果（平均值标准差）组别剂量(mg/皿)TA97-( S9) +( S9)TA98-( S9) +( S9)TA100-( S9) +( S9)TA102-( S9) +( S9) 受试物自发回变溶剂对照阳性物对照113