发酵机制及发酵动力学

Presentation 报告题目登记,从本节课程开始到周四晚上截止，请每组选择一名代表，将本组报告的题目发送的我的邮箱（Yk_36_）中，请按照下面的内容填写，将按照邮件发送到本人邮件的时间来确定先后顺序。内容填写不完全者或汇报内容与指定的topic内容不符合者视为登记不成功，将回复邮件告知。,注*：Topics： 1、新型发酵工业原料的应用和开发（来源、应用范围、工业预处理及配套政策）； 2、计算机技术、自动化技术及传感技术在发酵工业中的应用； 3、与发酵工业相适应的菌种的开发（菌种的获取、改造和工艺初步优化）； 4、发酵工艺的优化实例。 以上每个题目限报4组，也可以在其他与本课程相关的内容中自由选题。,第七章 发酵机制及发酵动力学,发酵机制是指微生物通过其代谢活动，利用基质合成人们所需要的产物的内在规律。由于微生物的种类、遗传特性和环境条件不同，微生物所能积累的代谢产物不同，主要有微生物菌体、微生物酶和代谢产物。微生物代谢产物很多，主要有酒精、丙酮丁醇、有机酸、氨基酸、核苷酸类、蛋白质、抗生素、维生素、脂肪、多糖类等。 微生物具有极其精确的代谢控制系统，能确保细胞内所有生化反应有条不紊的进行并制止中间产物和终产物的过量积累。必须人为改变微生物的代谢调控机制，使有用中间代谢产物过量积累，同时利用环境因素对代谢方向产生影响，这就是发酵机制的研究内容。 发酵动力学是研究发酵过程中菌体生长、基质消耗、产物生成的动态平衡及其内在规律。其研究内容包括微生物生长过程中质量和能量的平衡，发酵过程中菌体生长速率、基质消耗速率和产物生成速率的相互关系。研究发酵动力学的目的在于设计和优化发酵动力学模型，并以此为依据，利用计算机来设计程序，模拟最适合的工艺流程和发酵工艺参数，从而使生产控制达到最优化。,本章主要内容,第一节 发酵工业微生物的基本代谢情况 第二节 微生物代谢调控机制 第三节 重要发酵产物的发酵机制 第四节 微生物发酵动力学,本章主要内容,第一节 发酵工业微生物的基本代谢情况 第二节 微生物代谢调控机制 第三节 重要发酵产物的发酵机制 第四节 微生物发酵动力学,第一节 发酵工业微生物的基本代谢和调控机制,一、发酵工程微生物的基本代谢及产物 （一）微生物初级代谢及产物 初级代谢是指微生物从外界吸收各种营养物质，通过分解代谢和合成代谢，生成维持生命活动所需要的物质和能量的过程。 初级代谢产物：由初级代谢过程所产生的产物，如糖、氨基酸、脂肪酸、核苷酸以及由这些化合物聚合而成的高分子化合物（如多糖、蛋白质、酯类和核酸等）。,（二）微生物的次级代谢及产物,次级代谢是指微生物在一定的生长时期，以初级代谢产物为前体物质，合成一些对微生物的生命活动无明确功能的物质的过程。这一过程的产物，即为次级代谢产物。 次级代谢产物大多是一类分子结构比较复杂的化合物，包括：抗生素、毒素、激素、色素等。 抗生素：是由微生物（包括细菌、真菌、放线菌属）或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物。抑制细菌细胞壁合成，破坏细胞质膜，作用于呼吸链以干扰氧化磷酸化，抑制蛋白质和核酸合成等方式抑制微生物生长。 毒素：细菌毒素和真菌毒素。细菌毒素又分为内毒素和外毒素。 激素：微生物能产生刺激动物生长或性器官发育的激素类物质，称激素，如赤霉素、生长素等。,二、微生物的代谢途径及途径上相关物质的前体来源,（一）自养微生物的生物氧化、产能和CO2固定（略） （二）化能异养微生物的生物氧化和产能 生物氧化就是发生在活细胞内的一系列产能性氧化反应的总称。生物氧化的形式包括某物质与氧结合、脱氢或失去电子三种；生物氧化的过程可分脱氢（或电子）、递氢（或电子）和受氢（或电子）三个阶段；生物氧化的功能则有产能（ATP）、产还原力H和产小分子中间代谢物三种。以下我们按底物（基质）脱氢的三个阶段以及各阶段的类型和细节的顺序来讨论化能异养微生物的生物氧化及其产能效应。,底物脱氢的四条主要途径获得发酵产物的主要来源,1、EMP途径（Embdem-Meyerhof-ParnasPathway） 2、HMP途径（hexosemonophosphatepathway） 3、ED途径（Entner-Doudoroffpathway） 4三羧酸循环（tricarboxylicacidcycle）,1、EMP途径（Embdem-Meyerhof-Parnas Pathway）,又称糖酵解途径（glycolysis） 或己糖二磷酸途径（hexosedipho-sphatepathway） :,EMP途径是绝大多数生物所共有的基本代谢途径，因而也是酵母菌、真菌和多数细菌所具有的代谢途径。在有氧条件下，EMP途径与TCA途径连接，并通过后者把丙酮酸彻底氧化成CO2和H2O。,由EMP途径中丙酮酸出发的发酵,从丙酮酸出发的6条发酵途径及其相互联系总结,在无氧条件下，丙酮酸或其进一步代谢后所产生的乙醛等产物被还原，从而形成乳酸或乙醇等发酵产物。EMP途径与乙醇、乳酸、甘油、丙酮、丁醇和丁二醇等大量重要发酵产物的生产有着密切的关系。,2、HMP途径（hexosemonophosphate pathway）,即已糖一磷酸途径，有时也称戊糖磷酸途径、Warburg-Dickens途径或磷酸葡萄糖酸途径。,这是一条葡萄糖不经EMP途径和TCA途径而得到彻底氧化，并能产生大量NADPHH+形式的还原力和多种重要中间代谢物的代谢途径。 具有HMP途径的微生物的碳源利用范围更广，例如它们可以利用戊糖作碳源。 通过本途径而产生的重要发酵产物很多，例如核苷酸、若干氨基酸、辅酶和乳酸（异型乳酸发酵）等。,3、ED途径（Entner-Doudoroff pathway）,又称2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸（KDPG）裂解途径。 ED途径是少数缺乏完整EMP途径的微生物所具有的一种替代途径，在其他生物中还没有发现。其特点是葡萄糖只经过4步反应即可快速获得由EMP途径须经10步才能获得的丙酮酸。,经ED途径发酵产生乙醇的过程与传统的由酵母菌通过EMP途径生产乙醇不同，因此称作细菌酒精发酵。 利用Z.mobilis等细菌以生产酒精，是近年来正在开发的工业，它比传统的酵母酒精发酵有许多优点：（1）代谢速率高，（2）产物转化率高，（3）菌体生成少，（4）代谢副产物少，（5）发酵温度较高，以及（6）不必定期供氧等。当然，细菌酒精发酵也有其缺点，主要是其生长PH为5，较易染菌（而酵母菌为pH3），其次是细菌耐乙醇力较酵母菌为低（前者约为7.0，后者则为810）。,4三羧酸循环（tricarboxylicacidcycle）,又称TCA循环、Krebs循环或柠檬酸循环。 这是一种循环方式的反应顺序，它在绝大多数异养微生物的氧化性（呼吸）代谢中起着关键性的作用。在真核微生物中，TCA循环的反应在线粒体内进行，其中的大多数酶定位在线粒体的基质中；在原核生物例如细菌中，大多数酶都存在于细胞质内。只有琥珀酸脱氢酶属于例外，它在线粒体或细菌中都是结合在膜上的。,TCA,三羧酸循环在微生物代谢中的枢纽地位,递氢和受氢过程,在生物体中，贮存在葡萄糖等有机物中的化学能，经上述的多种途径脱氢后，经过呼吸链（或称电子传递链）等方式进行递氢，最终与受氢体（氧、无机或有机氧化物）结合，以释放其化学潜能。根据递氢特别是受氢过程中氢受体性质的不同，可以把生物氧化区分成呼吸（有氧呼吸）、无氧呼吸和发酵三种类型。,1呼吸（respiration） 呼吸是一种最普遍和最重要的生物氧化方式，其特点是底物按常规方式脱氢后，经完整的呼吸链RC， respiratory chain，又称电子传递链（ETC，electron transport chain）递氢，最终由分子氧接受氢并产生水和释放能量（ATP）。由于呼吸必须在有氧条件下进行，因此又称有氧呼吸（aerobic respiration）。,2无氧呼吸（anaerobicrespiration） 无氧呼吸又称厌氧呼吸，是一类呼吸链末端的氢受体为外源无机氧化物（个别为有机氧化物）的生物氧化。这是一类在无氧条件下进行的产能效率较低的特殊呼吸。其特点是底物按常规途径脱氢后，经部分呼吸链递氢，最终由氧化态的无机物（个别是有机物延胡索酸）受氢。,根据呼吸链末端的最终氢受体的不同，可把无氧呼吸分成以下多种类型：,3发酵（fermentation） “发酵”这一名词用得十分普遍。在发酵工业上，发酵是指任何利用好氧或厌氧微生物来生产有用代谢产物的一类生产方式；而在生物氧化或能量代谢中，发酵仅是指在无氧条件下，底物脱氢后所产生的还原力H不经过呼吸链传递而直接交给某一内源氧化性中间代谢产物的一类低效产能反应，即：,本章主要内容,第一节 发酵工业微生物的基本代谢情况 第二节 微生物代谢调控机制 第三节 重要发酵产物的发酵机制 第四节 微生物发酵动力学,微生物有着一整套可塑性极强和极精确的代谢调节系统，以保证上千种酶能正确无误、有条不紊地进行极其复杂的新陈代谢反应。 微生物细胞的代谢调节方式很多，例如可调节营养物质透过细胞膜而进入细胞的能力，通过酶的定位以限制它与相应底物的接近，以及调节代谢流等。其中以调节代谢流的方式最为重要，它包括两个方面，一是“粗调”，即调节酶的合成量，二是“细调”，即调节现成酶分子的催化活力，两者往往密切配合和协调，以达到最佳调节效果。 利用微生物代谢调控能力的自然缺损或通过人为方法获得突破代谢调控的变异菌株，可为发酵工业提供生产有关代谢产物的高产菌株。有关的实际例子将在本节后部分进行介绍。,一、酶活性的调节,酶活性的调节是指通过对已存在的酶的活性的改变，影响代谢速率。这是一种快速调节，依靠酶分子结构的改变而实现，主要方式有反馈抑制和酶的共价修饰两种，包括酶活性的激活和抑制两个方面。 1、酶活性的激活 最常见的酶活性的激活是前体激活，它常见于分解代谢途径，即代谢途径中后面的反应可以被该途径较前面的而一个产物所促进。 2、酶活性的抑制 酶活性的抑制主要是反馈抑制。反馈抑制是指合成途径的末端产物（即终产物）过量时，这个产物对该途径前段的某一个酶活性的抑制现象。通常抑制的是反应途径的第一个酶（第一步反应往往是限速步骤）。,1）直线代谢途径中的反馈抑制 这是一种最简单的反馈抑制类型，过量的终产物抑制途径的第一个酶，就能很好的控制整个反应过程。,（1）同工酶调节：其特点是在分支途径中第一个酶有几种结构不同的一组同工酶，每一分支代谢产生的终产物只对一种同工酶具有反馈抑制作用，只有当几种种产物同时过量时，才能完全阻止反应的进行。,2）分支代谢途径中的反馈抑制 在有两种或两种以上的末端产物的分支代谢途径中，为避免在一个分支上的产物过多，影响另一分支上产物的供应，微生物有下列多种调节方式：,（2）协同反馈抑制：在分支代谢途径中，几种末端产物同时都过量时，才对途径中的第一个酶具有抑制作用，若某一末端产物单独过量则对途径的第一个酶无抑制作用。,（3）累积反馈抑制：在分支代谢途径中，任何一种末端产物过量时都能对共同途径中第一个酶起抑制作用，而且各种末端产物的抑制作用互不干扰。当各种末端产物同时过量时，它们的抑制作用是累加的。,（4）顺序反馈抑制：分支代谢途径中的两个末端产物，不能直接抑制代谢途径中的第一个酶，而是分别抑制分支点后的反应步骤，造成分支点上中间产物的积累，这种高浓度的中间产物再反馈抑制第一个酶的活性，因此，只有当两个末端产物都过量时，才能对途径中的第一个酶起到抑制作用。,二、酶合成的调节,酶合成的调节是指酶在数量上和种类上的调节。这是一种缓慢调节，通过改变酶分子合成的速度实现代谢途径的变化。这种调节共有两种方式：一种是指酶生成的诱导，是指促进细胞内酶的合成；另一种是代谢产物对酶生成的阻遏，是指细胞内酶的合成停止，包括分解代谢降解物阻遏和合成代谢终产物的反馈阻遏。 1、诱导 根据酶的生成是否与环境中所存在的该酶底物或其有关物 的关系，可把酶划分成组成酶和诱导酶两类。 组成酶，如EMP途径的有关酶类。 诱导酶则是细胞为适应外来底物或其结构类似物而临时合成的一类酶，例如Ecoli在含乳糖培养基中所产生的-半乳糖苷酶和半乳糖苷渗透酶等。能促进诱导酶产生的物质称为诱导物。又可分为同时诱导和顺序诱导。,蓝白斑筛选原理,野生型大肠杆菌产生的-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。有色物质可以使整个培养菌落产生颜色变化，而颜色变化是鉴定和筛选的最直观有效的方法。 蓝白斑筛选的宿主菌：为-半乳糖苷酶缺陷型菌株。这种宿主菌的染色体基因组中编码-半乳糖苷酶的基因突变，造成其编码的-半乳糖苷酶失去正常N段一个146个氨基酸的短肽（即肽链），从而不具有生物活性，即无法作用于X-gal产生蓝色物质。,蓝白斑筛选的载体：具有一段称为lacz的基因，lacz中包括：一段-半乳糖苷酶的启动子；编码肽链的区段；一个多克隆位点(MCS)。MCS位于编码肽链的区段中，是外源DNA的选择性插入位点，但其本身不影响载体编码肽链的功能活性。,虽然上述缺陷株基因组无法单独编码有活性的-半乳糖苷酶，但当菌体中含有带lacz的质粒后，质粒lacz基因编码的肽链和菌株基因组表达的端缺陷的-半乳糖苷酶突变体互补，具有与完整-半乳糖苷酶相同的作用X-gal生成蓝色物质的能力，这种现象即-互补。操作中，添加IPTG(异丙基硫代-半乳糖苷)以激活lacz中的-半乳糖苷酶的启动子，在含有X-gal的固体平板培养基中菌落呈现蓝色。,插入失活：当外源DNA（即目的片断）与含lacz的载体连接时，会插入进MCS，使肽链读码框破坏，这种重组质粒不再表达肽链，将它导入宿主缺陷菌株则无互补作用，不产生活性-半乳糖苷酶，即不可分解培养基中的X-gal产生蓝色，培养表型即呈现白色菌落。,2、阻遏 在微生物的代谢过程中，当代谢途径中某末端产物过量时，除可用前述的反馈抑制的方式，还可通过阻遏作用来阻碍代谢途径中包括关键酶在内的一系列酶的生物合成，从而更彻底地控制代谢和减少末端产物的合成。阻遏的类型主要有末端代谢产物阻遏和分解代谢产物阻遏两种。 （1）末端产物阻遏（end-productrepression） 指由某代谢途径末端产物的过量累积而引起的阻遏。 直线式反应途径：即产物作用于代谢途径中的各种酶，使之合成受阻遏，例如精氨酸的生物合成途径（图6-59）。 分支代谢途径：每种末端产物仅专一地阻遏合成它的那条分支途径的酶。代谢途径分支点以前的“公共酶”仅受所有分支途径末端产物的阻遏，此即称多价阻遏作用。也就是说，任何单独一种末端产物的存在，都没有影响，只有当所有末端产物都同时存在时，才能发挥出阻遏功能。,（2）分解代谢物阻遏 指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。现在知道，分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的结果，而是通过甲碳源（或氮源等）在其分解过程中所产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。因此，分解代谢物的阻遏作用，就是指代谢反应链中，某些中间代谢物或末端代谢物的过量累积而阻遏代谢途径中一些酶合成的现象。 例如，有人将Ecoli培养在含乳糖和葡萄糖的培养基上，发现该菌可优先利用葡萄糖，并于葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，这就产生了在两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的“二次生长现象”。,大肠杆菌的“二次生长”现象,三、代谢调控在发酵工业中的应用,这里将讨论如何控制微生物的正常代谢调节机制，使其累积更多为人们所需要的有用代谢产物。 包括三个方面： （一）应用营养缺陷型菌株以解除正常的反馈调节 （二）应用抗反馈调节的突变株解除反馈调节 （三）控制细胞膜的渗透性,（一）应用营养缺陷型菌株以解除正常的反馈调节,在分支代谢途径中，通过解除某种反馈调节，就可以使某一分支途径的末端产物得到累积。 举例1：赖氨酸发酵,工业上选育了Corynebacterium glutamicum（谷氨酸棒杆菌）的高丝氨酸缺陷型菌株作为赖氨酸的发酵菌种。这个菌种由于不能合成高丝氨酸脱氢酶（HSDH）。,举例2：肌苷酸（IMP）的生产,（二）应用抗反馈调节的突变株解除反馈调节,抗反馈调节突变菌株，就是指一种对反馈抑制不敏感或对阻遏有抗性的组成型菌株，或兼而有之的菌株。在这类菌株中，因其反馈抑制或阻遏已解除，或是反馈抑制和阻遏已同时解除，所以能分泌大量的末端代谢产物。,（三）控制细胞膜的渗透性,细胞内的代谢产物常常以很高的浓度累积着，并自然地通过反馈阻遏限制了它们的进一步合成。采取生理学或遗传学方法，可以改变细胞膜的透性，使细胞内的代谢产物迅速渗漏到细胞外。 1通过生理学手段控制细胞膜的渗透性,2通过细胞膜缺损突变而控制其渗透性 应用谷氨酸产生菌的油酸缺陷型菌株，在限量添加油酸的培养基中，也能因细胞膜发生渗漏而提高谷氨酸的产量。 利用石油发酵产生谷氨酸的解烃棒杆菌的甘油缺陷型突变株，由于缺乏a-磷酸甘油脱氢酶，故无法合成甘油和磷脂。,本章主要内容,第一节 发酵工业微生物的基本代谢情况 第二节 微生物代谢调控机制 第三节 重要发酵产物的发酵机制 （一）糖代谢产物的发酵机制 （二）氨基酸和核酸发酵机制 （三）抗生素发酵机制 第四节 微生物发酵动力学,一、糖代谢产物的发酵机制,（一）乙醇发酵 1、以EMP途径为基础的酵母乙醇发酵 酵母的乙醇发酵和酒精、白酒、葡萄酒、啤酒等各种酒类生产关系密切。 丙酮酸脱羧酶是酵母菌乙醇发酵的关键酶。,总反应式为：葡萄糖+2ADP+2Pi2乙醇+2CO2+2ATP,酵母乙醇发酵过程的三种形式,型发酵：正常的乙醇发酵在弱酸性条件下进行，产生2分子的乙醇和2分子CO2。这又称为酵母的“同型酒精发酵”。,型发酵：在发酵培养基中添加适量NaHSO3，则乙醇发酵转变为甘油发酵，形成大量甘油和少量乙醇。其机理： NaHSO3与乙醛形成复合物，封闭了乙醛，由磷酸二羟丙酮代替乙醛作为受氢体，形成-磷酸甘油，在-磷酸甘油酯酶的催化下脱去磷酸，形成甘油。,型发酵：将发酵液pH值控制在弱碱性（pH7.6），酵母的乙醇发酵转向甘油发酵，主产物为甘油，伴随产生少量乙醇、乙酸和CO2 。,2、细菌的“同型酒精发酵”：由Zymomonas mobilis（运动发酵单胞菌）等通过ED途径进行。 葡萄糖+ADP+Pi2乙醇+2CO2+ATP 3、细菌的“异型酒精发酵”：由Leuconostoc mesenteroides（肠膜状明串珠菌 ）等通过HMP途径进行。 葡萄糖+ADP+Pi乳酸+乙醇+CO2+ATP 此外，由于这三类酒精发酵所经过的途径是不同的，所以在发酵产物乙醇分子上的碳原子来源也是不同的。如果将葡萄糖分子的不同碳原子进行14C标记，并测定14C在产物中的分布，则上述三条途径的差别可从图6-27中看到。,（二）乳酸发酵,乳酸发酵指某些细菌在厌氧条件下利用葡萄糖生产乳酸及少量其他产物的过程。能进行乳酸发酵的细菌被称为乳酸菌。乳酸菌虽多是一些兼性厌氧菌，但乳酸发酵却是在严格厌氧条件下完成的。 1、同型乳酸发酵 同型乳酸发酵的过程是：葡萄糖经EMP途径降解为丙酮酸，丙酮酸在乳酸脱氢酶的作用下被NADH还原为乳酸。由于终产物只有乳酸一种，故称为同型乳酸发酵。 C6H12O62ADP2CH3CHOHCOOH2ATP 德氏乳杆菌属（Lac.delbriickii）、乳酸链球菌属（Streptococcus Lactis）、酪乳杆菌属（Lactobacillus Casei）、保加利亚乳杆菌（Lac.bulgaricus）等。 2、异型乳酸发酵 在肠膜明串珠菌(Leuconostoc Mesenteroides)中，利用HMP途径分解葡萄糖，产生甘油醛-3-磷酸和乙酰磷酸，其中甘油醛-3-磷酸进一步转化为乳酸，乙酰磷酸经两次还原变为乙醇；双歧杆菌经PK途径发酵葡萄糖形成的产物除乳酸外还有乙醇和乙酸。,（二）氨基酸和核酸的发酵机制,