体内药物分析方法的建立与验证体内药物分析

第四章第四章 体内药物分析方法体内药物分析方法的建立与验证的建立与验证 2012-4本章内容提要本章内容提要n分析方法的设计依据分析方法的设计依据n分析方法建立的一般步骤分析方法建立的一般步骤n分析方法验证的内容与要求分析方法验证的内容与要求n分析方法验证的相关国际规范分析方法验证的相关国际规范n体内药物分析应用示例体内药物分析应用示例n待测药物与生物介质n体内分析的目的n实验室的设备条件第一节第一节 分析方法的设计依据分析方法的设计依据待测药物与生物介质待测药物与生物介质（一）待测药物的结构与理化性质（一）待测药物的结构与理化性质 (二二)生物介质的种类与待测药物的形式生物介质的种类与待测药物的形式 （三）待测药物的预期浓度范围（三）待测药物的预期浓度范围一、一、待测药物的理化性质及体内存在状况待测药物的理化性质及体内存在状况1.待测药物的理化性质待测药物的理化性质药物的药物的pKa值、亲脂性、溶解度、分配系数等决定预处理及值、亲脂性、溶解度、分配系数等决定预处理及检测方法检测方法具有亲脂性：在适当的具有亲脂性：在适当的pH值下用溶剂萃取值下用溶剂萃取具有强极性或亲水性：沉淀蛋白、固相萃取、离子对萃具有强极性或亲水性：沉淀蛋白、固相萃取、离子对萃 取或衍生化后萃取等取或衍生化后萃取等具有挥发性：具有挥发性：GC测定法测定法具有光谱或电化学特性决定分析检测方法具有光谱或电化学特性决定分析检测方法药物的稳定性决定萃取浓缩技术药物的稳定性决定萃取浓缩技术 对酸碱不稳定，避免使用强酸或强碱性溶剂对酸碱不稳定，避免使用强酸或强碱性溶剂 对热不稳定，避免高温蒸发溶剂对热不稳定，避免高温蒸发溶剂2.2.待测药物的体内存在状态待测药物的体内存在状态与血浆蛋白结合的强弱及结合率的高低决定分离萃取方法与血浆蛋白结合的强弱及结合率的高低决定分离萃取方法蛋白结合较强蛋白结合较强：不宜直接采用溶剂萃取，因萃取率低。：不宜直接采用溶剂萃取，因萃取率低。体内浓度高低、代谢过程及其代谢产物与否决定分析检测体内浓度高低、代谢过程及其代谢产物与否决定分析检测技术技术浓度较低浓度较低（尤其有（尤其有代谢产物代谢产物共存）共存）：代谢产物的干扰或原型药物与特定代谢产物的同时测代谢产物的干扰或原型药物与特定代谢产物的同时测定定,可采用可采用LC-MSLC-MS、EIAEIA等分析检测技术等分析检测技术二、分析测定的目的与要求二、分析测定的目的与要求体内药物分析的目的影响体内药物分析的目的影响分析方法分析方法的应用的应用 药代动力学：药代动力学：研究药物在体内吸收、分布、代谢和排泄过程研究药物在体内吸收、分布、代谢和排泄过程 不必强调方法的简便、快速；不必强调方法的简便、快速；大多采用色谱及其脱线或在线联用技术，如大多采用色谱及其脱线或在线联用技术，如HPLCHPLC、LC-MSLC-MS临床治疗药物监测：临床治疗药物监测：测定有效治疗浓度范围内药物浓度测定有效治疗浓度范围内药物浓度 方法尽量简便、易行；适用于长期、批量样品的测定方法尽量简便、易行；适用于长期、批量样品的测定 大多采用大多采用UVUV、RIARIA或或EIAEIA等等三、生物样品的类型与样品制备方法三、生物样品的类型与样品制备方法生物样品的类型、样品制备方法与生物样品的类型、样品制备方法与分析方法分析方法密切相关密切相关以血浆或血清为分析样品以血浆或血清为分析样品采用蛋白沉淀采用蛋白沉淀-溶剂萃取预处理技术溶剂萃取预处理技术分析样品较为分析样品较为“干净干净”，可用，可用HPLCHPLC检测检测用用RIARIA分析分析样品的预处理方法可较为粗放样品的预处理方法可较为粗放经过简单的蛋白沉淀或不经任何预处理直接测定经过简单的蛋白沉淀或不经任何预处理直接测定四、实验室条件四、实验室条件在设计体内药物分析方法时，还应充分考虑在设计体内药物分析方法时，还应充分考虑到实验室现有的或有可能在其它实验室使用的仪到实验室现有的或有可能在其它实验室使用的仪器装备，合理选择可行的分析方法。器装备，合理选择可行的分析方法。第二节第二节 分析方法建立的一般步骤分析方法建立的一般步骤n分析方法的选择分析方法的选择n分析方法的建立分析方法的建立 1 检测条件的筛选检测条件的筛选 2 分离条件或预处理条件的筛选分离条件或预处理条件的筛选一、分析方法的选择一、分析方法的选择生物样品中的生物样品中的药物浓度药物浓度是决定分析方法的是决定分析方法的首要因素。首要因素。生物样品中药物或其特定代谢产物的浓度低、样品量生物样品中药物或其特定代谢产物的浓度低、样品量少，少，难以通过增加取样量难以通过增加取样量提高方法灵敏度，需通过提高方法灵敏度，需通过选择适当的分析方法适应样品分析需求选择适当的分析方法适应样品分析需求分析方法分析方法检测限度检测限度/10-9g特异性特异性/分离能力分离能力紫外分光光度法（UV）100荧光分光光度法（Fluor）1原子吸收光度法（AA）1+薄层扫描法（TLSC）紫外检测器（UV）10+荧光检测器（Fluor）1+气相色谱法（GC）氢火焰离子化检测器（FID）110+氮磷检测器（N-PD）0.10.01+电子捕获检测器（ECD）0.01+质量碎片选择离子检测器MS0.01+高效液相色谱法（HPLC）紫外检测器（UV）1+荧光检测器（Fluor）0.1+电化学检测器（ECD）0.010.001+免疫法（IA）放射免疫法（RIA）0.01+酶免疫法（EIA）0.01+荧光免役法（FIA）0.01+n生物样品分析方法的基本要求 ChP（2005）首选色谱法，如HPLC、GC以及GC-MS、LC-MS联用技术，一般采用内标法定量。必要时也可采用生物学方法或生物化学方法。二、分析方法的建立二、分析方法的建立分析方法建立之前分析方法建立之前需查阅文献资料需查阅文献资料充分了解药物在体内的动力学过程，使所拟定充分了解药物在体内的动力学过程，使所拟定的分析方法避免受到代谢产物的干扰适用于实际生物样品测定的分析方法避免受到代谢产物的干扰适用于实际生物样品测定 文献查阅：摘要文献查阅：摘要medline,CAmedline,CA；药学文摘，分析文摘。；药学文摘，分析文摘。全文全文各种杂志各种杂志 移植或改进文献方法移植或改进文献方法 建立新方法。建立新方法。二、分析方法的建立二、分析方法的建立初步拟定分析方法后初步拟定分析方法后进行一系列试验工作进行一系列试验工作选择最佳分析条件选择最佳分析条件同时验证分析方法的可行性同时验证分析方法的可行性确认是否适用于实际生物样品确认是否适用于实际生物样品F分析方法的建立和验证过程分析方法的建立和验证过程是不可截然划分的是不可截然划分的 为便于讨论而分别叙述为便于讨论而分别叙述F分析方法的建立步骤分析方法的建立步骤取被测组分（药物或代谢产物）、内标物取被测组分（药物或代谢产物）、内标物质的质的标准物质标准物质（对照品、标准品或符合标（对照品、标准品或符合标准的原料药）准的原料药）进行试验进行试验。确定最佳检测条件和检测灵敏度（响应值）确定最佳检测条件和检测灵敏度（响应值）色谱条件的确定色谱条件的确定 1 检测条件的筛选检测条件的筛选空白溶剂试验空白溶剂试验 以水代替生物基质，预处理样品以水代替生物基质，预处理样品 初步确定合适的预处理条件、考察溶剂的干扰情况、初步了解萃取回收率初步确定合适的预处理条件、考察溶剂的干扰情况、初步了解萃取回收率空白生物基质试验空白生物基质试验 采用空白生物基质试验采用空白生物基质试验 考察生物基质对测定的干扰（方法专属性考察生物基质对测定的干扰（方法专属性）模拟生物样品试验模拟生物样品试验 待测物加入到空白生物基质中试验待测物加入到空白生物基质中试验 进一步考察进一步考察生物基质对测定的干扰（方法专属性），确定最佳预处理生物基质对测定的干扰（方法专属性），确定最佳预处理条件，初步了解生物样品中可测定的最低浓度、方法的准确度、精密条件，初步了解生物样品中可测定的最低浓度、方法的准确度、精密度、准确度，药物萃取回收率等。度、准确度，药物萃取回收率等。实际生物样品的测试实际生物样品的测试 预处理方法的最终建立。预处理方法的最终建立。2 分离条件（预处理条件）的筛选分离条件（预处理条件）的筛选第三节第三节 分析方法验证的内容与要求分析方法验证的内容与要求n验证内容验证内容 1特异性特异性避免干扰避免干扰2标准曲线与线性范围标准曲线与线性范围覆盖所有浓度范围覆盖所有浓度范围3精密度与准确度精密度与准确度与实际状况相符，结果可重现与实际状况相符，结果可重现4定量下限定量下限达到峰浓度的达到峰浓度的1/101/205稳定性稳定性确保所有样品在稳定状态下准确测定确保所有样品在稳定状态下准确测定6提取回收率提取回收率确保准确度确保准确度n方法质量控制：质控样品及其应用方法质量控制：质控样品及其应用一、方法特异性一、方法特异性(专属性或选择性专属性或选择性)n系指当有内源性物质（其他组分）存在时，方系指当有内源性物质（其他组分）存在时，方法准确测定待测物质的能力。法准确测定待测物质的能力。专属性专属性表示所检测的表示所检测的信号信号(响应响应)系属于系属于待测药物所特有待测药物所特有的的选择性选择性系指将待测物质与其代谢物及同服的其它药物加以系指将待测物质与其代谢物及同服的其它药物加以区分区分(分离分离)的能力的能力特异性特异性函盖二者，以函盖二者，以验证验证所测定的物质与待测药物的所测定的物质与待测药物的同一性。同一性。考察一个分析方法是否具有特异性，应着重考察一个分析方法是否具有特异性，应着重考虑以下几点：考虑以下几点：1内源性物质的干扰内源性物质的干扰 2代谢产物的干扰代谢产物的干扰 3伍用药物的干扰伍用药物的干扰 4与参比方法的相关性与参比方法的相关性1 1 内源性物质的干扰内源性物质的干扰n 比较待测组分在不同情况下的检测信号比较待测组分在不同情况下的检测信号对照品（或标准品）对照品（或标准品）空白生物基质空白生物基质模拟生物样品模拟生物样品（空白生物基质中添加对照品）（空白生物基质中添加对照品）如如HPLC色谱峰的色谱峰的 tR、n 和和 T 是否一致是否一致及与内源性物质色谱峰的及与内源性物质色谱峰的 Rn 确证确证内源性物质对分析方法有无干扰内源性物质对分析方法有无干扰2 2 代谢产物的干扰代谢产物的干扰q 比较模拟生物样品和用药后的实际生物样品的检测信号比较模拟生物样品和用药后的实际生物样品的检测信号q 确证确证其它代谢产物对分析方法有无干扰其它代谢产物对分析方法有无干扰q 代谢产物峰的确定：代谢产物峰的确定：1 1 比较实际生物样品、模拟生物样品（或空白样品和对照）比较实际生物样品、模拟生物样品（或空白样品和对照）2 2 由代谢产物的极性，初步判断其出峰位置；由代谢产物的极性，初步判断其出峰位置；3 3 在实际样品中峰面积随给药后时间延长而增加；在实际样品中峰面积随给药后时间延长而增加；4 4 结构已知的特定活性代谢物的测定，通过结构已知的特定活性代谢物的测定，通过HPLC-DADHPLC-DAD和和LC-MSLC-MS确证色谱确证色谱峰的单纯性和同一性，与对照物质比较。峰的单纯性和同一性，与对照物质比较。5 5 对于结构未知的代谢产物的测定，可采用对于结构未知的代谢产物的测定，可采用LC-MSLC-MS或或LC-NMRLC-NMR进行结构的进行结构的初步推测初步推测3 3 伍用药物的干扰伍用药物的干扰TDM 时，还要考虑患者可能同时服用药物时，还要考虑患者可能同时服用药物(通通常为数有限常为数有限)的干扰的干扰 q比较待测药物、同时服用药物及二者模拟生物样比较待测药物、同时服用药物及二者模拟生物样品的检测信号（如品的检测信号（如HPLCHPLC色谱峰的色谱峰的 t tR R、n n 和和 T T）q确证同时服用药物对分析方法的干扰情况确证同时服用药物对分析方法的干扰情况4 4 与参比方法的相关性与参比方法的相关性q 参比方法要求：参比方法要求：一般选用特异性强、准确度高、线性一般选用特异性强、准确度高、线性关系良好的色谱法。关系良好的色谱法。q 方法：同时用两种方法测定不同浓度的系列含药生物方法：同时用两种方法测定不同浓度的系列含药生物样品，以样品，以参比方法测定结果为横坐标参比方法测定结果为横坐标(X X)；拟定方法结；拟定方法结果为纵坐标果为纵坐标(Y Y)，用最小二乘法计算回归方程用最小二乘法计算回归方程 YabX (坐标标度相等坐标标度相等)。q结果比较：结果比较：Y Ya ab bX X相关系数相关系数(r r)表示两种方法测得结果的表示两种方法测得结果的相关性，即呈比例变化的程度，而比例值即为相关性，即呈比例变化的程度，而比例值即为回归方程的斜率回归方程的斜率b b。在截距在截距a a很小的前提下，若斜率很小的前提下，若斜率b b越趋近于越趋近于1 1，则待考察方法越等同于参比方法。则待考察方法越等同于参比方法。二、标准曲线与线性范围二、标准曲线与线性范围q标准曲线（标准曲线（standard curve）校正曲线（校正曲线（calibration curve）工作曲线（工作曲线（working curve）生物样品中所测定药物浓度与响应的相生物样品中所测定药物浓度与响应的相关性。关性。q 线性范围（线性范围（linear rang）标准曲线的最高与最低浓度的区间。标准曲线的最高与最低浓度的区间。q 采用回归方程来评价。采用回归方程来评价。自变量自变量x 为生物样品中待测药物的浓度，因变量为生物样品中待测药物的浓度，因变量y为响为响应信号的强度。应信号的强度。通常为线性模式，少数为非线性模式（通常为线性模式，少数为非线性模式（IA方法）。方法）。q 常用回归分析法：最小二乘法或加权最小二乘法。常用回归分析法：最小二乘法或加权最小二乘法。q 采用模拟生物样品建立（生物基质相同与真实样品相采用模拟生物样品建立（生物基质相同与真实样品相同）。同）。q 线性范围应能覆盖全部待测生物样品中的药物浓度，线性范围应能覆盖全部待测生物样品中的药物浓度，不能外推。不能外推。q 标准曲线的制备标准曲线的制备 将药物对照品（溶液）加入将药物对照品（溶液）加入与待测样品相同的空白生物基与待测样品相同的空白生物基质质中混匀，配成已知药浓的标准样品，然后同待测样品中混匀，配成已知药浓的标准样品，然后同待测样品一同一同按相同方法预处理按相同方法预处理后测定，将分析得到的响应值，后测定，将分析得到的响应值，对药浓建立标准曲线。对药浓建立标准曲线。1 加入空白基质的原因：加入空白基质的原因：使标准样品与待测样品均处于相同的生物基质环境中。使标准样品与待测样品均处于相同的生物基质环境中。2 按相同方法预处理的原因按相同方法预处理的原因 待测样品中的组分与标准样品中的组分以相同比例表现为待测样品中的组分与标准样品中的组分以相同比例表现为响应值响应值3 标准样品中的浓度以单位生物基质中加入对照品量计标准样品中的浓度以单位生物基质中加入对照品量计算，因此药浓为总浓度。算，因此药浓为总浓度。n标准系列溶液标准系列溶液(非生物基质溶液非生物基质溶液)的制备的制备n内标溶液的制备内标溶液的制备n标准系列模拟生物样品（标准样品）的制备标准系列模拟生物样品（标准样品）的制备n标准曲线的绘制标准曲线的绘制 回归方法：加权最小二乘法回归方法：加权最小二乘法 1.1.标准曲线的一般建立方法标准曲线的一般建立方法（1 1）标准系列溶液）标准系列溶液(非生物基质非生物基质溶液溶液)的制备的制备n方法：方法：标准贮备液：精称待测物标准物质适量，用适宜溶剂标准贮备液：精称待测物标准物质适量，用适宜溶剂溶解或定量稀释成较高浓度的溶液。溶解或定量稀释成较高浓度的溶液。标准溶液：稀释标准贮备液标准溶液：稀释标准贮备液 注意：注意：溶剂：溶剂：水或甲醇水或甲醇（或其他适当溶剂）（或其他适当溶剂）浓度：标准模拟生物样品中药物浓度的浓度：标准模拟生物样品中药物浓度的 50倍以上，倍以上，加入体积为加入体积为生物样品总体积的生物样品总体积的 2%以下，以下，避免标准模拟生物样品与实际样品避免标准模拟生物样品与实际样品存在较大差异。难溶，浓度较低：应除去溶剂后再加入生物基质。存在较大差异。难溶，浓度较低：应除去溶剂后再加入生物基质。浓度点：浓度点：68个，覆盖全部待测生物样品中的药物浓度个，覆盖全部待测生物样品中的药物浓度梯度模式：不固定。通常为等比，常数约为梯度模式：不固定。通常为等比，常数约为2。例如：例如：1、2、5、10、20、50、100ug/ml设定最高浓度为设定最高浓度为100，最低浓度为，最低浓度为1(个体差异个体差异)实际配制时实际配制时首先配制高浓度首先配制高浓度，再稀释配制低浓度。，再稀释配制低浓度。（2）内标溶液的制备内标溶液的制备n方法：先配制内标贮备液，再配制内标液方法：先配制内标贮备液，再配制内标液 浓度要求：浓度要求：内标溶液的响应值一般与内标溶液的响应值一般与“标准系列溶液标准系列溶液”的中间浓度溶液的响应值相当。的中间浓度溶液的响应值相当。加入内标的原因：加入内标的原因：避免样品预处理过程中的损失对结果的影响。避免样品预处理过程中的损失对结果的影响。（3）标准样品的制备标准样品的制备 方法：空白生物基质方法：空白生物基质(如血浆如血浆)数份，分别加入标数份，分别加入标准系列溶液适量（相同体积），涡旋混匀。准系列溶液适量（相同体积），涡旋混匀。或者：先加标准溶液，再加基质或者：先加标准溶液，再加基质或蒸干后加基质。或蒸干后加基质。（4）标准曲线的绘制标准曲线的绘制方法：取标准样品预处理后，以待测药物的检测响应方法：取标准样品预处理后，以待测药物的检测响应(如色谱峰面积如色谱峰面积或峰高或峰高)或与内标物质的检测响应的比值或与内标物质的检测响应的比值(内标法内标法)()(因变量因变量,y y)对模对模拟血药浓度拟血药浓度 (自变量自变量,x x)，求得回归方程，求得回归方程(y ya ab bx x)及其相关系数及其相关系数()，并绘制标准曲线。，并绘制标准曲线。至少至少6-86-8个浓度点个浓度点(不包括零点不包括零点)构成构成 数据剔除应有确切原因，如：数据剔除应有确切原因，如：样品处理有损失、色谱图有问题，样品处理有损失、色谱图有问题，显著偏离标准曲线该数据参与标准曲线回归后，计算显著偏离标准曲线该数据参与标准曲线回归后，计算QCQC样品或返算该点浓度时显著偏离其标准浓度样品或返算该点浓度时显著偏离其标准浓度(配制浓度配制浓度)n标准曲线药物浓度表示标准曲线药物浓度表示 以单位体积（质量）生物基质中加入标准物质的量以单位体积（质量）生物基质中加入标准物质的量表示。表示。如：空白血浆如：空白血浆0.5ml，加入标准溶液（，加入标准溶液（100ug/ml）10ul（或还有其他溶液）（或还有其他溶液），浓度为：浓度为：2ug/ml。组织可用组织可用ug/g，根据所取匀浆体积所相当的组织，根据所取匀浆体积所相当的组织重量中加入标准物质的量计算。重量中加入标准物质的量计算。（4）标准曲线的绘制标准曲线的绘制（5）加权最小二乘法加权最小二乘法普通最小二乘法：每个浓度点绝对误差普通最小二乘法：每个浓度点绝对误差(yiyi)赋予同等的重要性赋予同等的重要性 特点：标准曲线上的高低浓度相差悬殊特点：标准曲线上的高低浓度相差悬殊(范围达范围达102)低浓度区的计算值相对误差过大，难以满足规定要求低浓度区的计算值相对误差过大，难以满足规定要求加权最小二乘法加权最小二乘法：回归计算时增加一个：回归计算时增加一个权重因子权重因子(w)各浓度的响应值与回归值的相对离差平方和达到最小各浓度的响应值与回归值的相对离差平方和达到最小式中，式中，wi为标准曲线上第为标准曲线上第i个浓度点的权重因子个浓度点的权重因子2)(iiyy2)(iiiyyw2iiiyyy（5）加权最小二乘法加权最小二乘法n回归方程回归方程(y=a+b x)参数的计算参数的计算22biiiiiiiiiiiiixwxwwywxwyxww222aiiiiiiiiiiiiiixwxwwyxwxwywxwiiiiiwxwywba或，22/riiiiiiiiiiwywywwywbxaw（5）加权最小二乘法加权最小二乘法 权重因子的选择权重因子的选择 加权：加权：赋予低浓度点以更大的权重赋予低浓度点以更大的权重 在实际工作中的一般方法在实际工作中的一般方法通常取通常取wi=1/C2 当高浓度点测量值的准确度下降过大，低浓度点权重当高浓度点测量值的准确度下降过大，低浓度点权重过大，降低低浓度点的权重，过大，降低低浓度点的权重，wi=1/C2.标准曲线的限度要求标准曲线的限度要求 药代动力学或生物利用度研究药代动力学或生物利用度研究 1 标准曲线至少包括标准曲线至少包括6个浓度个浓度(通常为通常为68个浓度个浓度,不包括零点不包括零点)2 线性范围应能覆盖全部待测生物样品中的药物浓度，最高浓度应高于达线性范围应能覆盖全部待测生物样品中的药物浓度，最高浓度应高于达峰浓度峰浓度(Cmax)；最低浓度应低于最低浓度应低于Cmax的的1/101/20，常为方法的，常为方法的LLOQ(非非LOD)3 标准曲线各浓度点的计算值（依据回归方程推算的浓度）与标示值之间标准曲线各浓度点的计算值（依据回归方程推算的浓度）与标示值之间的偏差在可接受的范围之内时，标准曲线合格。的偏差在可接受的范围之内时，标准曲线合格。4 回归方程的截距应接近于零回归方程的截距应接近于零 5 斜率应接近或大于斜率应接近或大于1（与坐标的标度选择有关），使具（与坐标的标度选择有关），使具有较高的灵敏度有较高的灵敏度6 相关系数要求相关系数要求 0.99(色谱法色谱法)或或0.98(生物学方法生物学方法)7 若非线性，可分为高低两个浓度区间若非线性，可分为高低两个浓度区间(每个区间不少于每个区间不少于5个浓度个浓度)，分别加权回归，分别加权回归如如1、2、5、10、20和和10、20、50、100、200 标准曲线标准曲线 样品测定样品测定 空白生物基质空白生物基质 真实样品真实样品+系列浓度对照溶液系列浓度对照溶液 +同体积空白溶剂同体积空白溶剂+内标溶液内标溶液 +同体积内标溶液同体积内标溶液 预处理预处理 相同预处理相同预处理 测定测定 测定测定 n能否用对照法？n为何一次提取未提取完全也能准确测定？（三）定量下限（LLOQ）n是标准曲线上的最低浓度点，表示方法的灵敏度，即测定样品中符合准确度和精密度要求的最低药物浓度。n测定法：取同一生物基质，制备至少5个独立的标准样品，其浓度应使信噪比大于5，依法进行精密度和准确度的验证。n限度要求：其准确度应在标示浓度的80%120%范围内，相对标准偏差应小于20%。在药代动力学与生物利用度研究中，LLOQ应能满足测定35个消除半衰期是生物样品中的药物浓度或能检测出Cmax的1/101/20。（四）精密度与准确度精密度含义精密度含义：在确定的分析条件下相同生物介质中相同浓度样品的在确定的分析条件下相同生物介质中相同浓度样品的一系列测定值得分散程度。通常用一系列测定值得分散程度。通常用QC样品的相对标准差表示。样品的相对标准差表示。准确度含义：用该方法准确度含义：用该方法测得的生物样品中待测药物的浓度与其真实测得的生物样品中待测药物的浓度与其真实浓度的接近程度。浓度的接近程度。采用样品：模拟生物样品（采用样品：模拟生物样品（QC样品）样品）表示方法：表示方法：相对回收率相对回收率(relative recovery，RR)相对误差相对误差(relative error，RE)批内批内(within-run(within-run或或intra-assay)intra-assay)RSDRSD日内日内(within-day)(within-day)RSD RSD在同一分析批（同一日）内的测定结果之间的在同一分析批（同一日）内的测定结果之间的RSDRSD批间批间(between-run(between-run或或inter-assay)inter-assay)RSDRSD日间日间(between-day(between-day，day-to-day)day-to-day)RSDRSD不同分析批的测定结果之间的不同分析批的测定结果之间的RSDRSD分析批：包括测定样品、适当数目的标准样品和质控样品的分析批：包括测定样品、适当数目的标准样品和质控样品的完整系列，相同实验条件和时间区段。完整系列，相同实验条件和时间区段。一天内可完成几个分析批，一个分析批也可持续几天完成。一天内可完成几个分析批，一个分析批也可持续几天完成。通常一天完成一个分析批。通常一天完成一个分析批。精密度（精密度（precision）精密度（精密度（precision）测定法：照准确度项下方法，取空白生物基质测定法：照准确度项下方法，取空白生物基质(如血浆如血浆)数份，数份，分别在同一批内和不同批间制备高、中、低分别在同一批内和不同批间制备高、中、低 3个浓度的个浓度的QC样品，样品，分析测定。分析测定。批内批内RSD：每一浓度每一浓度56个样品，每个样品测定个样品，每个样品测定1次，用随行标次，用随行标准曲线分别计算三个浓度的准曲线分别计算三个浓度的RSD。批间批间RSD：每一分析批内每一浓度制备一个样品，每个样品测每一分析批内每一浓度制备一个样品，每个样品测定定1次；用随行标准曲线计算三个浓度次；用随行标准曲线计算三个浓度(每一浓度每一浓度56个分析批个分析批数据数据)的的RSD。若实际样品测定所用的分析批次少于若实际样品测定所用的分析批次少于5批，也可进行批，也可进行3个批次的个批次的连续分析连续分析(每每1浓度的每浓度的每1批次为批次为56个样本个样本)方差分析法方差分析法 n测定方法：测定方法：取空白生物取空白生物基质（如血浆）数份，照标准曲线项下方基质（如血浆）数份，照标准曲线项下方法操作，在标准曲线范围内制备至少高法操作，在标准曲线范围内制备至少高(接近上限接近上限)、中、低中、低(接近接近LOQ)3个浓度的质控个浓度的质控(quality control，QC)样品，每一浓度至少样品，每一浓度至少5个样品。与随行的标准曲线个样品。与随行的标准曲线同法测定（每个样品分析测定同法测定（每个样品分析测定1次次）计算。）计算。准确度准确度n结果计算与限度要求结果计算与限度要求计算计算测定值测定值M M(measured)(measured)平均值与理论值平均值与理论值(加入值加入值)A A(added)(added)的比值的比值相对回收率相对回收率相对误差相对误差 限度要求限度要求RRRR应在应在85%-115%85%-115%范围范围(LOQLOQ附近：附近：80%80%120%)120%)RERE在在15%15%的范围的范围(LOQLOQ附近：附近：20%)20%)）（%100AMRR）（）（%100%100RRAAMRE精密度（精密度（precision）n表示方法：表示方法：标准偏差标准偏差(standard deviation，SD)相对标准偏差相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)SD=RSD=112nXXniii）（%100XSD）（%100112XnXXniiin限度要求精密度（精密度（precision）在药代动力学和生物利用度研究中在药代动力学和生物利用度研究中RSD一般应一般应15%在在LOQ附近附近RSD应应20%。含义：包括方法稳定性和样品稳定性含义：包括方法稳定性和样品稳定性考察内容：考察内容：含药生物样品冷冻贮存条件下的稳定性（短期、长期）含药生物样品冷冻贮存条件下的稳定性（短期、长期）含药生物样品在室温、冻融条件下的稳定性含药生物样品在室温、冻融条件下的稳定性样品处理过程中的稳定性样品处理过程中的稳定性样品处理后在溶液中的稳定性样品处理后在溶液中的稳定性标准储备液的稳定性。标准储备液的稳定性。方法与要求：采用高、中、低浓度的方法与要求：采用高、中、低浓度的QCQC样品（模拟生物样品）或样品（模拟生物样品）或不同条件下预处理后的待测溶液进行考察。每条件下至少重复测定不同条件下预处理后的待测溶液进行考察。每条件下至少重复测定次，准确度次，准确度85%85%115%(115%(RERE在在15%15%范围内范围内)，RSDRSD15%15%。（五）样品稳定性（五）样品稳定性（六）提取回收率（六）提取回收率n含义：含义：将生物样品中分析物提取出来供分析的比例。又称绝将生物样品中分析物提取出来供分析的比例。又称绝对回收率（对回收率（absolute recovery)，即从生物样品基质中回收得，即从生物样品基质中回收得到的分析物质的响应值除以标准物质产生的响应值。到的分析物质的响应值除以标准物质产生的响应值。与相对回收率的意义不同与相对回收率的意义不同提取回收率：考察生物样品预处理过程造成的药物的程度损提取回收率：考察生物样品预处理过程造成的药物的程度损失，表示有多少比例的药物自样品中提取供分析。对于样品失，表示有多少比例的药物自样品中提取供分析。对于样品处理方法的评价重点在于结果的精密与重现，而非待测物提处理方法的评价重点在于结果的精密与重现，而非待测物提取的完全与否。取的完全与否。相对回收率：考察采用标准曲线可否准确计算生物样品中药相对回收率：考察采用标准曲线可否准确计算生物样品中药物浓度，物浓度，表示方法的准确度。表示方法的准确度。提取回收率提取回收率n测定方法测定方法取空白生物基质取空白生物基质(如血浆如血浆)，照准确度项下方法，制备高、中、低，照准确度项下方法，制备高、中、低3个浓度的个浓度的QC样品样品(每一浓度至少每一浓度至少5个样品个样品)，每个样品分析测定，每个样品分析测定1次。次。另取等量的相同另取等量的相同3个浓度的标准溶液，用溶解模拟生物样品经提个浓度的标准溶液，用溶解模拟生物样品经提取处理后的残渣的溶剂稀释至同体积，同法测定。取处理后的残渣的溶剂稀释至同体积，同法测定。AT经萃取后的经萃取后的QC样品的检测信号样品的检测信号 AS未经萃取的标准溶液的检测信号未经萃取的标准溶液的检测信号要求：高、中浓度的要求：高、中浓度的RSD应应15%，低浓度的，低浓度的RSD应应20%。）（%100STAARn在提取回收率的测定过程中，若采用内标法校正，则内标物质应在提取之后，溶剂蒸发之前加入，以校正由于提取溶剂的蒸发，残渣的复溶以及非提取过程造成的待测药物的损失。n并且采用内标法测定生物样品时，应同时测定内标物质的提取回收率。其测定法同待测药物提取回收率的测定，但仅需制备1个浓度（即生物样品分析时加入的浓度）至少5个QC样品，同法测定，计算。（七）分析方法的质量控制n质控（质控（quality control,QC）样品：）样品：将已知量的待测药物加入到空白生物基质中配制的模拟生将已知量的待测药物加入到空白生物基质中配制的模拟生物样品。用于整个分析过程的质量控制。物样品。用于整个分析过程的质量控制。（标准样品：用于建立标准曲线、计算（标准样品：用于建立标准曲线、计算QC 样品和未知样品样品和未知样品中分析物的浓度）中分析物的浓度）质量控制质量控制 QC样品与生物样品同时测定，用随行标准曲线计算，样品与生物样品同时测定，用随行标准曲线计算，种浓度，每浓度至少个样品，种浓度，每浓度至少个样品，RSD应应20%，RE在在20%，允许有，允许有2 2个超出正常浓度的个超出正常浓度的 20%。（八）未知生物样品浓度超出定量范围的处理（八）未知生物样品浓度超出定量范围的处理n1.浓度高于ULOQ 应分取部分样品用相应的空白生物介质稀释至方法规定体积后重新测定，并同时制备浓度高于ULOQ的QC样品，同法稀释测定，以确保稀释的有效性。n2.浓度低于LLOQ 对于浓度低于LLOQ的样品，可增加未知样品的体积，使制备样品的浓度高于LLOQ。同时也得制备像样QC样品进行验证。第四节分析方法验证的相关国际规范第四节分析方法验证的相关国际规范n一、FDA分析方法验证指南n二、分析方法验证指南实施细则一、FDA分析方法验证指南n（一）验证的类型及其适用范围n1.全面验证n2.部分验证n3.交互验证n（二）生物分析方法建立与验证1.全面验证n首次建立或增补的分析方法n用于新药研究的分析方法n新增代谢物的定量分析方法2.部分验证n生物分析方法在实验室或分析者之间转移n分析方法学的变化n生物体液中抗凝剂的变化n同一物种内生物介质的改变n样品处理方法改变n浓度范围改变n仪器设备和/或工作软件的改变n有限的样品量与稀少介质n配伍用药中待测物的专属性评价n特定代谢物存在时待测物专属性评价（二）生物分析方法建立与验证n参比标准的制备n生物分析方法的建立和操作步骤的验证n经验证的生物分析方法应用于常规分析和分析批的接受标准1.标准物质n法定的标准物质n来自于有信誉的商业渠道的市售标准物质；n由分析实验室或其他非商业机构自行合成的具有纯度分析资料的其他标准物质。2.化学分析方法的建立与验证n（1）专属性：专属性验证，至少获得6个不同来源的生物介质的空白样品，检查每个每个空白样品的干扰情况并确保在LLOQ的专属性。n（2）准备度、精密度与回收率 回收率用于说明分析方法在有限的变动范围内的提取效率。待测物的回收率不要求100%，但待测物及内标物的回收程度应恒定、精密和可重现。（3）标准曲线二、分析方法验证指南实施细则n（三）残留与污染的评价（三）残留与污染的评价方法方法：在验证期间，应在高浓度或标准样品后注射1个或数个空白样品来评价残留。解决方法解决方法：在方法中应给出特别的步骤以消除已知的残留，如在几个样品后注射空白。（七）基于（七）基于MS方法的基质效应方法的基质效应（matrix factor）n含义含义：生物样品中由于介质的存在，待测物离子化作用受到抑制或增强的效应。n计算方法计算方法：在介质离子存在时待测物的峰响应与介质离子不存在时待测物的峰响应比值。高、中、低三个浓度每个6个。n判断方法判断方法：当MF等于1时，标志没有基质效应；小于1时，说明存在离子化抑制的作用；大于1时，可能由于离子化增强作用第五节生物样品分析方法的建立与验证实第五节生物样品分析方法的建立与验证实例例阿奇霉素血浆样品测定方法的建立与验证阿奇霉素血浆样品测定方法的建立与验证一、文献调研一、文献调研理化性质、药动学参数、体内分析方法。理化性质、药动学参数、体内分析方法。二、分析方法设计二、分析方法设计分析方法、检测方法、生物样品预处理方分析方法、检测方法、生物样品预处理方法。法。三、分析方法建立与验证三、分析方法建立与验证（一）分析方法建立（一）分析方法建立 （二）分析方法验证（二）分析方法验证第五节应用实例第五节应用实例（一）分析方法的建立（一）分析方法的建立1.仪器仪器2.色谱条件色谱条件3.质谱条件质谱条件4.血浆样品预处理与分析血浆样品预处理与分析（二）分析方法验证1.方法的特异性2.标准曲线与定量下限3.精密度与准确度4.提取回收率与基质效应5.样品的稳定性本章内容：n分析方法的设计依据分析方法的设计依据n分析方法建立的一般步骤分析方法建立的一般步骤n分析方法验证的内容与要求分析方法验证的内容与要求n体内药物分析应用示例体内药物分析应用示例要求n理解并掌握体内药物分析方法如何建立，如何验证和进行质量控制。