基因定点突变方法及其应用

.基因定点突变方法及其应用摘要：本文综述了基因定点突变的三种方法，在此基础上的一些改进方法及其应用，并对这三种方法进行了比较。关键词：定点突变；寡核苷酸引物；PCR；盒式突变Methods of Site-directed Mutagenesis and Their ApplicationAbstract: In the paper，methods of site-directed mutagenesis，some advanced methods on the basic methods and their application are present. At the same time，the comparison are made .Key words: site-directed mutagenesis；oligonucleotide；PCR；cassette mutagenesis定点突变技术可以随心所欲地在已知DNA序列中取代、插入或缺失一定长度的核苷酸片段。该方法比使用化学因素、自然因素导致突变的方法具有突变牢高、简单易行、重复性好的特点；除用于改变核苷酸序列获得突变基因、研究基因的结构与功能的关系之外，还能够通过改变特定的氨基酸获得突变蛋白质，研究蛋白质的结构与功能，从微观水平上阐明正常状态下基因的调控机理、疾病的病因和机理。随着分子生物学研究的突飞猛进，基因定点突变技术成为一项重要的分子生物学实验技术手段，在生物和医学领域中的应用非常广泛。目前常用的定点突变方法有寡核苷酸引物介导的定点突变、PCR介导的定点突变及盒式突变等1。1常用定点突变方法1.1核苷酸引物介导的定点突变其原理是用含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物，在聚合酶的作用下启动DNA分子进行复制。主要的过程(见图1)：将待突变基因克隆到突变载体上；制备含突变基因的单链模板；引物与模板退火5端磷酸化的突变寡核苷酸引物，与待突变的核苷酸形成一小段碱基错配的异源双链的DNA，合成突变链：在DNA聚合酶的催化下，引物以单链DNA为模板合成全长的互补链，而后由连接酶封闭缺口，产牛闭环的异源双链的DNA分子；精品.转化和初步筛选异源双链DNA分子转化大肠杆菌后，产生野生型、突变型的同源双链DNA分子。可以用限制性酶切法、斑点杂交法和生物学法来初步筛选突变的基因；对突变体基因进行序列分析。1.2 PCR介导的定点突变经典PCR介导的定点突变法，需要4种扩增引物，进行3次PCR反应(见图2)。头两次PCR反应中，应用两个互补的并在相同部位具有相同碱基突变的内侧引物，扩增形成两条有一端可彼此重叠的双链DNA片段，去除未参入的多余引物之后，这两条双链DNA片段经变性和退火可以形成具有3凹末端的异源双链分子，在TaqDNA聚合酶的作用下，产生含重叠序列的双链DNA分子。这种DNA分子再用两个外侧寡核苷酸引物进行第三次PCR扩增，便产生突变体DNA。1.3盒式突变盒式突变是利用一段人工合成的含基因突变序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相应序列。这种突变的寡核苷酸是由两条寡核苷酸组成的，当它们退火时，按设计要求产生克隆需要的粘性末端，由于不存在异源双链的中间体，因此重组质粒全部是突变体。如果将简并的突变寡核苷酸插入到质粒载体分子上，在一次的实验中便可以获得数量众多的突变体，大大减少了突变需要的次数。这对于确定蛋白质分子中不同位点氨基酸的作用是非常有用的方法。2 定点突变方法的改进2.1 寡核苷酸引物介导的定点突变的改进该方法常产生突变效率低的现象，其主要原因是大肠杆菌中存在甲基介导的碱基错配修复系统所致。针对这一问题，KUNKEL2进行了改进，用尿嘧啶取代DNA的选择作用提高了突变效率。近几年来，多家生物公司又进行了进一步的完善，并相继推出了本公司的产品。据不完全统计：Promega公司研制了Alter sitesin vitro Mutagenesis system，安法玛西亚公司研制了Unique Site Elimination Mutagenesis Kit，Stratagene公司研制了Quik change SiteDirectedMutagenesis Kit，伯乐公司研制了Muta-Gene in vitro Mutagenesis Kit，这些试剂盒各有特色，它们的共同之处有：采用甲基修复酶缺乏的菌株作为受菌体，大大降低了突变修复频牢。精品.采用改进后的质粒，省去了制备单链模板的烦琐步骤，节省了时间。增加了多个抗生素筛选标志和相对应的多对敲除/修复引物，使得在该质粒上可以连续进行不止一次的突变反应，使突变反应更加快速、简便。这里简单介绍一些Stratagene公司的Quik Change Site-directed Mutagenesis kit，由于巧妙设计，质粒定点突变技术变得简单有效。准备突变的质粒必须是从常规E.coli中经纯化试剂盒(Miniprep)或者氯化铯纯化抽提的质粒。设计一对包含突变位点的引物（正、反向），和模版质粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循环延伸”，(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5端终止，再经过反复加热退火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝。)正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。DpnI酶切延伸产物，由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对DpnI敏感而被切碎（DpnI识别序列为甲基化的GATC，GATC在几乎各种质粒中都会出现，而且不止一次），而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。这个试剂盒非常巧妙的利用甲基化的模版质粒对DpnI敏感而合成的突变质粒对DpnI酶切不敏感，利用酶切除去模版质粒，得到突变质粒，使得操作简单有效。另外由于Pfu聚合酶是公认的最好的高保真聚合酶之一，堪称高保真聚合酶的“黄金标准”，是Stratagene的看家之宝，能够有效避免延伸过程中不需要的错配。试剂盒采用的是低次数的循环延伸而非PCR，有助于减少无意错配。只需要一次酶切和转化，实验可以在一天完成。这个试剂盒适用于质粒大小不超过8Kb的质粒。后来推出的Quik精品. Change XL site-directed mutagenesis kit则是针对大于8Kb的质粒的定点突变的，通过优化试剂特别是其感受态细胞（XL10-Gold），使得较大的质粒的定点突变也一样简单。2.2 PCR介导的定点突变的改进大引物PCR是以第1轮PCR中产生的含点突变的产物做引物进行第2轮PCR反应，三种引物包括目的基因两侧上下游引物和中间含突变点引物，含突变点引物可与另两种引物之一进行第1轮PCR，所得产物作为大引物加上剩余的另一种引物进行第2轮PCR。3 三种方法的比较3.1 寡核苷酸引物介导的定点突变法其优点是保真度比PCR突变法高，经过改进后使该方法突变成功率大大提高，缺点是操作过程环节复杂、周期长，而且在克隆待突变基因时会受到限制性酶切位点的限制。3.2 PCR介导的定点突变法其优点是操作较简单，突变的成功率可达100。但它亦有两个缺点：后续工作较复杂，PCR扩增产物通常需要连接到载体分子上，然后才能对突变的基因进行转录、转译等方面的研究6；TaqDNA聚合酶的保真性偏低；因此，PCR方法产生的DNA片段要经过核苷酸序列测定，方可确证有无发生其它突变。3.3盒式突变 盒式突变法具有比前两者简单易行、突变效率高等优点，还可以在一对限制酶切位点内一次突变多个位点。缺点是合成多条引物的成本较高。另外，在一般情况下，在靶DNA片段的两侧往往难以满足存在一对限制性酶切位点的要求，限制了该方法的广泛应用。然而一旦具备了这样的条件，该方法则为首选。精品.4 基因定点突变的应用周赞虎等人7采用快速PCR定点突变方法成功地对hCu，Zn-SOD进行了基因改良，即将hCu，Zn-SOD基因中非活性中心的Cys111密码子突变为Ala密码子，以提高其稳定性。朱大兴等人8对该试剂盒试验规程进行了改良，利用实验室的常规试剂进行定点突变，并指出PCR突变反应产物能被琼脂糖电泳检测到是非常重要的，因为这样有利于分析试验成败的原因。 刘欣毅等人9介绍一种新型的基因定点突变方法，该方法巧妙利用了基因序列中广泛存在的不完整的平端酶切位点。与传统方法相比，可以迅速地在全基因的任何部位替换核苷酸，并可以在突变实验过程中直接将目的基因克隆到T载体上，便于测序及进一步克隆。利用该方法成功地获得了DdsA(decaprenyl diphosphate synthase，十聚异戊二烯焦磷酸合成酶)在4个氨基酸位点上的19个变体酶。周兴等人10以定点突变方法对325RLDRD32基序的带电荷氨基酸进行突变，共构建R325D、R328A、R328D、R328Q和D329N 5个突变体。孙卫国等人11通过重叠PCR方法进行定点突变，从人胎肝cDNA文库中获得编码人角质细胞生长因子-2突变体的核酸序列并克隆至原核表达载体pBV220进行诱导、表达和纯化。分别检测重组人角质细胞生长因子-2及其突变体重组蛋白的生物活性和室温条件下的稳定性。参考文献：1 师平，冷希岗基于PCR的体外诱变技术J国外医学生物医学工程分册2005，28(3)：188-1922 KUNKEL TA. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selectionJ.Proc Natl Acad. Sci. USA，1985，82（2）：488-492.3 李和刚，傅田，靳二辉，等. 猪IKBa基因定点突变中两种方法的应用J. 中国畜牧兽医，2009,36（1）：38-40.4 Yingfeng A，Jianfei J，Wendang W，et alA rapid and efficient methodfor multiple-site mutagenesis with a modified overlap extension PCR精品.JAppl Microbiol Biotechnol，2005，68：774-7785 Heckman K L，Pease L R.Gene splicing and mutagenesis by PCR driven overlap extensionJ.Nat Protoc，2007，2（4）：924-932.6J萨姆布鲁克，D W拉塞尔.分子克隆实验指南（3版）M.黄培堂译.北京，科学出版社，2002，51-72.7 周赞虎，张永祥，陈枝华，等. 基因改造中快速PCR定点突变方法应用J.中国公共卫生，2007，23（1）：102-103.8朱大兴，周清华，王艳萍。等利用Pyrobest DNA聚合酶一步法进行大片段基因的定点突变J生物技术通讯，2007，18(4)：590-5939 刘欣毅， 张惠展，袁勤生. 一种新型的基因定点突变方法及其在DdsA突变研究中的应用J.中国生物化学与分子生物学报，2007，23（5）：415-418.10周兴，韦星明，杨祥开，等. 大黄欧文氏菌蔗糖异构酶控制产物特异性基序的定点突变J. 基因组学与应用生物学，2011，30（5）：556-563.11 孙卫国，刘农乐，王芳，等. 一种热稳定人成纤维细胞生长因子突变体原核表达及活性鉴定J.军事医学，2011，（4）：268-271.如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合！精品