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第五节第五节 遗传工程遗传工程 遗传工程是指利用工程技术的方法改造和遗传工程是指利用工程技术的方法改造和修饰生物体，使其产生新的性状或更适合人类修饰生物体，使其产生新的性状或更适合人类需求的产品的遗传学手段。需求的产品的遗传学手段。广义遗传工程和狭义遗传工程广义遗传工程和狭义遗传工程 广义：包括细胞工程、基因工程、酶工程广义：包括细胞工程、基因工程、酶工程和发酵工程等。和发酵工程等。狭义：基因工程。狭义：基因工程。一、细胞工程一、细胞工程 在离体（在离体（in vitroin vitro）条件下以细胞为基本单位，）条件下以细胞为基本单位，借助人工培养基，对生物细胞进行培养、繁殖，借助人工培养基，对生物细胞进行培养、繁殖，或者使其发生变异，从而改良生物品种、创造或者使其发生变异，从而改良生物品种、创造新品种、加速繁育，或利用细胞培养生产有用新品种、加速繁育，或利用细胞培养生产有用物质的过程。物质的过程。细胞工程包括细胞培养、细胞融合、细胞器转细胞工程包括细胞培养、细胞融合、细胞器转移、生物体的克隆与规模化繁殖等。移、生物体的克隆与规模化繁殖等。第一个哺乳动物的克隆Dolly羊二、酶工程二、酶工程利用酶的催化作用，在一定的生物反应器中，利用酶的催化作用，在一定的生物反应器中，将相应的原料转化成所需要的产品。将相应的原料转化成所需要的产品。是酶学理论与化工技术相结合的新技术体系。是酶学理论与化工技术相结合的新技术体系。三、发酵工程三、发酵工程 利用微生物与现代化工程技术相结合，利用微生物与现代化工程技术相结合，工厂化生产人类需要的物质的一种技术工厂化生产人类需要的物质的一种技术体系。体系。目前医用抗生素、农用抗生素绝大部分目前医用抗生素、农用抗生素绝大部分都是发酵工程产品。都是发酵工程产品。四、基因工程四、基因工程利用人工方法在体外（利用人工方法在体外（in vitroin vitro）切割、）切割、拼接、重组生物的遗传物质，获得重组拼接、重组生物的遗传物质，获得重组DNADNA分子，然后导入宿主细胞或个体，使分子，然后导入宿主细胞或个体，使受体的遗传特性得到修饰或改良。受体的遗传特性得到修饰或改良。基因工程操作的对象是基因工程操作的对象是DNADNA分子。分子。又称为重组又称为重组DNADNA技术技术基因工程的基本步骤：基因工程的基本步骤：1.1.目的基因的分离或合成目的基因的分离或合成2.2.将目的基因与载体将目的基因与载体DNADNA连接，构建重组连接，构建重组DNADNA分分 子子-表达载体表达载体3.3.将重组将重组DNADNA分子导入受体细胞，在其中扩增分子导入受体细胞，在其中扩增和表达。和表达。重组重组DNADNA技术流程技术流程一、工具酶一、工具酶1 1、限制性内切核酸酶、限制性内切核酸酶 限制酶：作用于特定（异）核苷酸序列限制酶：作用于特定（异）核苷酸序列 的磷酸二脂酶的磷酸二脂酶型酶：仅型酶：仅EcoBEcoB和和EcoKEcoK两种，催化限制两种，催化限制 性切割和修饰核苷酸性切割和修饰核苷酸2 2种功能种功能型酶：遗传工程中应用最广泛型酶：遗传工程中应用最广泛 型酶：具有特异的识别位点，识别位型酶：具有特异的识别位点，识别位 点是非对称的点是非对称的 型限制性酶的基本特性：型限制性酶的基本特性：有特异识别和切割的序列部位有特异识别和切割的序列部位DNADNA分子上两个单链断裂的部位通常不分子上两个单链断裂的部位通常不是直接相对的是直接相对的 断裂所形成的断裂所形成的DNADNA片段常具有碱基互补片段常具有碱基互补的单链尾巴（粘性末端）的单链尾巴（粘性末端）内切酶的切割和修饰功能由两个不同的内切酶的切割和修饰功能由两个不同的酶催化所完成，即内切酶活性和甲基化作酶催化所完成，即内切酶活性和甲基化作用活性是分开的用活性是分开的 酶切与连接酶切与连接限制性内切酶限制性内切酶EcoRI的酶切位点及酶切产物连接的酶切位点及酶切产物连接 GCTTAA53GAATTCCTTAAG5335GAATTCCTTAAG5335AATTC G53AATTCTTAAG53GC53ab回纹序列限制性内切酶限制性内切酶SmaI的识别及酶切位点的识别及酶切位点CCCGGGGGGCCC5CCC GGGGGG CCC,3,3,5,5,5平齐末端2、DNA连接酶 DNADNA连接酶是重组连接酶是重组DNADNA分子构建必不可少分子构建必不可少的工具酶，能催化的工具酶，能催化DNADNA中相邻的中相邻的3 3 OHOH和和5 5 磷酸基末端之间形成磷酸二酯磷酸基末端之间形成磷酸二酯键并把两段键并把两段DNADNA连接起来连接起来 3、反转录酶 反转录酶是一反转录酶是一类以类以RNARNA为模为模板来指导板来指导DNADNA合成的合成的DNADNA聚聚合酶，故又称合酶，故又称依赖于依赖于RNARNA的的DNADNA聚合酶聚合酶 通常用反转通常用反转录酶构建录酶构建cDNAcDNA文库（文库（cDNAcDNA librarylibrary）4 4、聚合酶链式反应、聚合酶链式反应(PCR)(PCR)PCRPCR是体外快速扩增是体外快速扩增DNADNA的方法的方法,由美国的由美国的Mullis(1986)Mullis(1986)发明发明,1993,1993年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖 PCRPCR可对特定可对特定DNADNA片段进行扩增，且可用痕量片段进行扩增，且可用痕量DNADNA作模板，对作模板，对DNADNA纯度要求也不高纯度要求也不高,可在几可在几小时内使目的基因片段扩增到数百万个拷贝小时内使目的基因片段扩增到数百万个拷贝PCRPCR反应在一种混合液中进行，该混合液包反应在一种混合液中进行，该混合液包括四种主要成分：两个引物（一般为括四种主要成分：两个引物（一般为20 bp20 bp）、模板）、模板DNADNA、热稳定的、热稳定的DNADNA聚合酶（聚合酶（TaqTaq酶酶，在，在9595甚至更高的温度下活性稳定）和四甚至更高的温度下活性稳定）和四种脱氧核苷酸。种脱氧核苷酸。PCRPCR反应在反应在PCRPCR仪上自动进行仪上自动进行PCRPCR反应从启动到结束称为一个循环，每个反应从启动到结束称为一个循环，每个循环包括三个步骤：循环包括三个步骤：1 1）变性：）变性：9595，DNADNA双链双链分离成单链分离成单链2 2）退火）退火(复性复性)：5555左右左右，引物与单链的模板，引物与单链的模板DNADNA序列互补结合序列互补结合3 3）延伸：）延伸：7272左右左右TaqTaq ，酶通过在引物的酶通过在引物的3-OH3-OH端增加碱基的办法端增加碱基的办法使引物延伸使引物延伸表12-2 PCR循环数与PCR产物的拷贝数之间的关系循环数PCR产物拷贝数12125253210210102415215327682022010485762522533554432302301073741824二、载体二、载体 常用载体：常用载体：细菌质粒、噬菌体、病毒等。细菌质粒、噬菌体、病毒等。细菌人工染色体（细菌人工染色体（BACBAC）酵母菌人工染色体（酵母菌人工染色体（YACYAC）人类人工染色体（人类人工染色体（HACHAC）质粒载体质粒载体分子量小分子量小(2.69kb),(2.69kb),但能携带较大的外源片段；但能携带较大的外源片段；拷贝数多拷贝数多,在每个宿主细胞在每个宿主细胞可达可达500500个；个；酶切位点多，克隆方便；酶切位点多，克隆方便；具有具有-互补显色表型互补显色表型,便于检测。便于检测。噬菌体（噬菌体（30kb30kb）
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