第二章 临床生物化学实验室基本技术与管理

第二章 临床生物化学实验室基本技术与管理实验室的基本技术与管理是临床生物化学检验工作的重要基础。本章所涉及的实验室基本技术与管理主要是应用于临床生物化学检测的分析技术与质量管理，目的在于加强基础，提高生物化学检验的质量。对于实验室的其他基本知识，基本技术以及实验室的管理方法，可参阅其他相关教材。第一节 常用临床生物化学分析技术 临床生物化学分析技术很多，常用的主要有光谱分析技术、电泳技术、离心技术、层析技术、电化学分析技术等。一、光谱分析技术利用各种化学物质所具有的发射、吸收或散射光谱谱系的特征，来确定其性质、结构或含量的技术，称为光谱分析技术。根据光谱谱系的特征不同，可把光谱分析技术分为发射光谱分析、吸收光谱分析和散射光谱分析三大类。在临床生物化学检验中，光谱分析是一类十分重要的技术，应用极为广泛。分光光度法(spectrophotometry) I.光谱分析法(photometry)1.定义：根据物质吸收、发射或散射辐射能而建立起来的一类分析方法。2.光的基本性质：高速传播的电磁辐射；具有波动性(l=c/v)和微粒性(E=hv)；短波能量大，长波能量小3.物质对光吸收的基本原理：能量转移-当光辐射通过某种物质时，组成该物质的分子与光子发生“碰撞”，光子的能量就转移至分子、原子上，使它们由基态(低能态)跃迁到激发态(高能态)，这种跃迁称为激发。选择吸收-组成物质的分子仅吸收与其内能变化(基态与激发态能量差)相对应的波长或频率的光，所得到的光谱称为吸收光谱。发 e.g.,射 荧光 光谱吸 收 激光 发谱激发态(E1)能量释放-处于较高能态的分子(激发态分子)不稳定，当其返回基态时，以热或发射光谱的形式将能量释放出来。所发射出的相应光谱，称分子发射光谱。DE=E1-E2=hv基态(E0)4.分类(1) 吸收光谱分析法：根据溶液能吸收由光源发出的某些可见、紫外分光光度法(visible and ultraviolet spectrophotometry) *原子吸收光谱法(atomic absorption spectrophotometry)：微量金属元素红外分光光度法波长的光后所形成的特征光谱来鉴定该物质的性质和含量的方法。(2) 发射光谱分析法：根据物质受到热能或电能等的激发火焰发射光谱法(flame emission photometry)：碱金属/碱土金属元素荧光光谱法(fluorometry)：少量无机物、酶活力、激素等后所发射出的特征光谱来进行定性及定量分析的一种方法。(3) 比浊/散射光谱分析法：测定光线通过溶液混悬颗粒后的光吸收或光散射程度的一类定量方法。 比浊法(turbidimetry)：在光源的光路方向上测定透射光强度(透射光&散射光)与入射光强度的比值和胶体溶液中质点浓度间的关系。散射测浊法(nephelometry)：在光路的垂直方向上测量散射光强度和胶体溶液中质点间的关系。5. 特点：灵敏度高；测定简便、快速；试样不被破坏等。II. 可见、紫外分光光度法1. 定义：根据物质分子对于200nm700nm光区电磁辐射的吸收特性进行分析的方法。 可见光：400700nm,有色物质溶液 紫外光：200400nm,无色物质2. 特点：灵敏度高(10-410-7g/ml); 选择性强； 精确度和准确度高； 仪器设备简单，操作易掌握3. 吸收光谱(1) 光谱的产生：化合物分子的价电子跃迁(2) 吸收光谱曲线：电子跃迁的吸收波长和吸收强度可用仪器测定，在可见、紫外光区内绘制或扫描得到一条以波长(l)为横坐标,吸光度(A)为纵坐标的吸收曲线。4. 光吸收的基本定律(Lamber-Beers Law)(1) 定律：单色光通过吸光溶液后，吸光度与浓度或厚度之间呈正比关系。 Lamber定律：说明吸收与厚度间的关系Beer定律：说明吸收与浓度间的关系(2) 表达式： -lgIt/Io=abc *It/Io为透光率(transmittance, T) (%) A=-lgT= abc * A为吸光度(aborbance) *a为吸光系数(absorptivity),即吸光物质在单位浓度及单位厚度时的吸光度。 b为液层厚度 c为溶液浓度(concentration)5. 比色法(colorimetry)(1) 定义：用可见光作光源，比较溶液的颜色深浅度以测定所含有色物质浓度的方法(2) 所用仪器：分光光度计(spectrophotometer)(i)基本原理：溶液中的物质在光的照射激发下，产生了对光吸收的效应，物质对光的吸收是具有选择性的。各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱，故当某单色光通过溶液时，其能量就会被吸收而减弱，光能量减弱的程度和物质的浓度有一定的比例关系。(ii)结构组成(以722分光光度计为例)光源：可见光区的光源为钨灯，波长范围是3201000nm。 (紫外光区的光源为氢灯或氘灯，波长是200320nm)单色器：一种将光源产生的混合光分解为单一波长的光学系统。一般是根据通过棱镜的折射或光栅的衍射而获得的。试样室：由比色皿座架及光门组成。 可见光区用光学玻璃比色皿(紫外光区用石英比色皿)光电管暗盒：由光电管(可将光能转变为可以放大检测和记录的电能)和微电流放大器组成。显示器：由放大器和读数元件组成。(3) 比色法的定量方法：(i)标准曲线法：将一系列浓度不同的标准溶液按照一定操作过程显色后，分别测吸光度(A)，以A为纵坐标，浓度为横坐标制标准曲线(至少要5点)。在相同条件下处理待测物质并测定其吸光度，即可从标准曲线找出相对应的浓度。(ii) 对比法：将标准品与待测样品在相同条件下显色并测定各自的吸光度。由于测定体系温度、厚度及入射光波长一致，故标准与待测样品a&b值相等，可用下式比较计算待测样品浓度Cx=CsAs/AxIII.实验内容1.可见光分光光度计波长校正(1) 原理：镨钕玻璃是一种含有金属镨与钕的玻璃制品，在可见光波长范围内，它具有特征性的吸收光谱，吸收峰的波长固定，可作校对仪器波长正确性的依据。(2) 操作：用镨钕玻璃与空白光路作对照，作出波长从512541nm的镨钕玻璃吸收曲线，以横坐标为波长，纵坐标为吸光度，每隔2nm作一个点，查找529nm处是否有一个吸收峰的极值，若这个吸收峰的极值相对应的波长大于529nm，则反时针方向调节波长调节螺杆，使这个极值相对应地靠近529nm，一直调到波长误差在允许范围内(5292nm);反之，吸收峰极值相对应的波长小于529nm，则顺时针方向调节螺杆。2红蛋白及衍生物吸收光谱测定(见书)H分光光度计的使用1开电源开关，打开箱盖，预热10mins2将空白管、对照管、测定管分别装入比色皿(3/4vol),并用吸水纸擦干光面外壁。3选定波长4打开箱盖(光路开关自动关闭)，用空白管调 T=05盖上箱盖(光路开关自动打开)，再用空白管调 T=100%(若调不到，则可调节灵敏度开关)6将选择开关旋至A,此时显示数值应为0，否 则调节“消光零”旋钮调至0。7逐步拉出试样架拉手，读取各管吸光度值A。8全部测定结束后，取出比色皿(洗净)，关闭开关。二、电泳技术电 泳 Electrophoresis 一、定义 电泳带电粒子在直流电场中向着电性相反电极移动的现象。电泳分析技术利用电泳现象进行物质分离的技术。二、电泳分析技术发展概况1809年俄国物理学家首次发现电泳现象。他在湿粘土中插上带玻璃管的正负两个电极，加电压后发现正极玻璃管中原有的水层变混浊，即带负电荷的粘土颗粒向正极移动，这就是电泳现象。 1909年Michaelis首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳。他用不同pH的溶液在U形管中测定了转化酶和过氧化氢酶的电泳移动和等电点。 1937年瑞典Uppsala大学的Tiselius对电泳仪器作了改进，创造了Tiselius电泳仪，建立了研究蛋白质的移动界面电泳方法，并首次证明了血清是由白蛋白及、球蛋白组成的，由于Tiselius在电泳技术方面作出的开拓性贡献而获得了1948年的诺贝尔化学奖。 1948年Wieland和Fischer重新发展了以滤纸作为支持介质的电泳方法，对氨基酸的分离进行过研究。 从本世纪50年代起，特别是1950年Durrum用纸电泳进行了各种蛋白质的分离以后，开创了利用各种固体物质（如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等）作为支持介质的区带电泳方法。 1959年Raymond和Weintraub利用人工合成的凝胶作为支持介质，创建了聚丙烯酰胺凝胶电泳，极大地提高了电泳技术的分辨率，开创了近代电泳的新时代。30多年来，聚丙烯酰胺凝胶电泳仍是生物化学和分子生物学中对蛋白质、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍，分辨率最高的分析鉴定技术，是检验生化物质的最高纯度：即“电泳纯”（一维电泳一条带或二维电泳一个点）的标准分析鉴定方法，至今仍被人们称为是对生物大分子进行分析鉴定的最后、最准确的手段，即“Last Check”。 由80年代发展起来的新的毛细管电泳技术，是化学和生化分析鉴定技术的重要新发展，己受到人们的充分重视。三、电泳分析技术的分类1.根据被分离样品的量多少 分析电泳 制备电泳2.根据电泳电压的高低 常压电泳 0500 V 高压电泳 5003000V3.根据电泳中是否使用支持物 自由电泳不使用支持物，在溶液中进行。 区带电泳使用支持物(1) 按支持物的物理性状不同，可分为滤纸及其他纤维薄膜电泳，如醋酸纤维素、玻璃纤维、聚氯乙烯纤维凝胶电泳，如琼脂、琼脂糖、硅胶、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳粉末电泳，如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳丝状电泳，如尼龙丝、人造丝电泳 (2)按支持物的装置形式不同，可分为 平板式电泳垂直板式电泳 垂直柱式电泳4.根据电泳系统pH是否连续 连续pH电泳指电泳过程中pH保持不变，如滤纸电泳、醋纤膜电泳 不连续pH电泳指电极缓冲液和电泳支持物的不同区段也有不同的pH，如 PAGE、IFE 优点是在不同 pH区之间形成高的电位梯度区，使蛋白质移动加速压缩为一极狭的区带而达到浓缩的目的。电泳技术的特点: 凡是带电物质均可应用某一电泳技术进行分离,并可进行定性或定量分析; 样品用量极少; 设备简单; 可在常温进行; 操作简便省时; 分辨率高.电泳技术应用 基础理论研究; 临床诊断; 工业制造.双向凝胶电泳和质谱技术的建立和联用,提供了蛋白质组研究所需的技术体系,使得蛋白质组的研究成为可能.四、电泳的基本原理 一个质点，如能解离或能吸附带电质点，在电场中便会向正极或负极移动。 电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。 为了更好的了解带电分子在电泳过程中是如何被分离的，下面简单介绍一下电泳的基本原理。在两个平行电极上加一定的电压（V），就会在电极中间产生电场强度（E），L是电极间距离。 在稀溶液中，电场对带电分子的作用力（F），等于所带净电荷与电场强度的乘积。 这个作用力使得带电分子向其电荷相反的电极方向移动。在移动过程中，分子会受到介质粘滞力的阻碍。粘滞力（F）的大小与分子大小、形状、电泳介质孔径大小以及缓冲液粘度等有关，并与带电分子的移动速度成正比，对于球状分子，F的大小服从Stokes定律，即： F=6r 式中r是球状分子的半径，是缓冲液粘度，是电泳速度(= d / t，单位时间粒子运动的距离，cm / s )。当带电分子匀速移动时： F = F， qE = 6r 由此可以看出，迁移率与带电分子所带净电荷成正比，与分子的大小和缓冲液的粘度成反比。迁移率（Mobility)带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度。 V Q M=-= - E 6prh 五、影响电泳速度的因素1.电场强度（E） E电流热效应支持介质上的水分蒸发样品的热变性 E电泳速度慢延长电泳时间样品扩散区带模糊不清分辨率下降 电场强度（V/cm）是每厘米的电位降，也称电位梯度。电场强度越大，电泳速度越快。但增大电场强度会引起通过介质的电流强度增大，而造成电泳过程产生的热量增大。电流在介质中所做的功（W）为： W=I2.R.t 上式中：I为电流强度，R为电阻，t为电泳时间。 电流所作的功绝大部分都转换为热，因而引起介质温度升高，这会造成很多影响： 样品和缓冲离子扩散速度增加，引起样品分离带的加宽；产生对流，引起待分离物的混合；如果样品对热敏感，会引起蛋白变性；引起介质粘度降低、电阻下降等等。电泳中产生的热通常是由中心向外周散发的，所以介质中心温度一般要高于外周，尤其是管状电泳，由此引起中央部分介质相对于外周部分粘度下降，摩擦系数减小，电泳迁移速度增大，由于中央部分的电泳速度比边缘快，所以电泳分离带通常呈弓型。降低电流强度，可以减小生热，但会延长电泳时间，引起待分离生物大分子扩散的增加而影响分离效果。所以电泳实验中要选择适当的电场强度，同时可以适当冷却降低温度以获得较好的分离效果。2.离子强度（I）溶液的I 越高，质点的泳动速度越慢，但区带分离度却较清晰。 I缓冲能力越大缓冲液所载的分电流增加，而样品所载的电流相应减少电泳速度减慢缓冲液的浓度可用摩尔或离子强度表示.离子强度低,电泳速度快,分离区带不易清晰,如果过低,缓冲液的缓冲量小,难以维持pH值的恒定;离子强度高,电泳速度慢,但区带分离清晰,如果过高,除了使得电泳速度过慢,还会因为离子强度增加使电泳时的电流变大,增加热量的产生,引起温度改变,对电泳不利。一般0.020.2M之间。3.缓冲液的pH pH值决定了化合物解离的程度，也决定了质点所带的净电荷。 缓冲液的pH值会影响待分离生物大分子的解离程度，从而对其带电性质产生影响，溶液pH值距离其等电点愈远，其所带净电荷量就越大，电泳的速度也就越大，尤其对于蛋白质等两性分子，缓冲液pH还会影响到其电泳方向，当缓冲液pH大于蛋白质分子的等电点，蛋白质分子带负电荷，其电泳的方向是指向正极。为了保持电泳过程中待分离生物大分子的电荷以及缓冲液pH值的稳定性，缓冲液通常要保持一定的离子强度，一般在0.020.2，离子强度过低，则缓冲能力差，但如果离子强度过高，会在待分离分子周围形成较强的带相反电荷的离子扩散层（即离子氛），由于离子氛与待分离分子的移动方向相反，它们之间产生了静电引力，因而引起电泳速度降低。另外缓冲液的粘度也会对电泳速度产生影响。4.电渗（electro-osmosis）指在电场作用下液体相对于固体支持物的相对移动。由于支持介质表面可能会存在一些带电基团，如滤纸表面通常有一些羧基，琼脂可能会含有一些硫酸基，而玻璃表面通常有Si-OH基团等等。这些基团电离后会使支持介质表面带电，吸附一些带相反电荷的离子，在电场的作用下向电极方向移动，形成介质表面溶液的流动，这种现象就是电渗。在pH值高于3时，玻璃表面带负电，吸附溶液中的正电离子，引起玻璃表面附近溶液层带正电，在电场的作用下，向负极迁移，带动电极液产生向负极的电渗流。如果电渗方向与待分离分子电泳方向相同，则加快电泳速度；如果相反，则降低电泳速度。5.分子筛 在凝胶电泳中，分离蛋白质等物质除了利用所带电荷的差异的效应外，还利用了其分子量的不同及形状不同。5.温度 电泳时电流通过支持介质会产生热量，按焦耳定律，电流通过导体时的产热与电流强度的平方、导体的电阻和通电的时间成正比（Q=I2Rt）产热可促使支持介质上溶剂的蒸发，而影响缓冲溶液的离子强度。温度升高时，介质黏度下降，分子运动加剧，引起自由扩散变快，迁移增加。温度每升高1度，迁移率约增加2.4%。若温度过高可导致分离样品变性而使电泳失败。醋 酸 纤 维 薄 膜 电 泳Cellulose acetate membrane electrophoresis，CAME一、醋酸纤维素 是纤维素醋酸酯，由纤维素的羟基进行乙酰化后制得，将它溶于有机溶剂涂抹成均匀的薄膜，待有机溶剂挥发后，即为白色不透明的醋酸纤维薄膜。 厚度：0.15mm 二、特点1.吸附作用小2.电渗作用小3. 需加样量少4. 吸水性差三、影响醋纤电泳结果的因素1. 电泳图谱不齐点样时血清点加不均匀薄膜局部干燥 电泳时供给薄膜的液量不均匀或过少 缓冲液变质电泳时薄膜位置不正,与电流方向不平行 2. 电泳图谱分离不清 标本加量过多电流过低 薄膜结构过分致密，透水性差薄膜表面干燥3. 电泳速度慢电流过低供给薄膜的液量不足电泳时温度过低缓冲液离子强度过高薄膜中杂质多4. 白蛋白区带中间部分不着色，染色不足可能为染料使用过久或加血清过多5.球蛋白向反方向移动主要因为电渗现象可升高缓冲液液面或加大电流量加以改进，并注意两侧电泳槽内缓冲液液面是否在同一水平。血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳（实验）原理 CAME是以醋纤膜（CAM）作支持物的一种区带电泳技术。 将血清样品点样于醋纤膜上，在pH8.6的缓冲液中电泳时，血清蛋白质均带负电荷移向正极。由于血清中各蛋白组分等点电不同而致表面净电荷量不等，加之分子大小和形状各异，因而电泳迁移率不同，彼此得以分离。 电泳后,CAM经染色和漂洗，可清晰呈现5条区带。再经脱色，比色即可计算出血清各蛋白组分的相对百分数。器材和试剂1.器材（1）醋酸纤维薄膜（82mm）（2）点样器（3） 染色皿，漂洗器，镊子（4） 722型分光光度计（5）电泳仪：直流电源整流器，水平电泳槽2.试剂（1）巴比妥缓冲液（pH8.6 I=0.06）（2）氨基黑10B染色液（3）漂洗液：95%乙醇、冰醋酸、H2O（4）洗脱液：0.4mol/L NaOH操作1.将电泳槽置于水平平台上。将缓冲液注入电泳槽中两边的电极槽缓冲液的高度要在同一点平面上。2.在醋纤膜一端欲点样处作好标记，然后将薄膜放进缓冲液中，湿润速度按膜吸收缓冲液的快慢而定，应让其自然浸润。3将充分浸透（指膜上没有白色斑痕）的薄膜取出，用滤纸吸去膜上过多的缓冲液。4用加样器蘸取血清（约5ul）,垂直印在CAM粗糙面上，待样品全部渗入薄膜内后，移开点样器。5电泳（1）加样后，将薄膜条架于支架两端，无光泽朝下（点样面），点样侧置于阴极端，膜两侧分别塔上纱布，纱布一端垂入缓冲液中。薄膜应位正，平直无弯曲，加上槽盖平衡5分钟后通电电泳。（2）正确连接电泳槽与整流器对应的正负极。开启电源通电。电压1015V/cm膜总宽。电泳4060分钟，泳动距离约达3.54cm时即可断电。6.染色 电泳完毕后断电，用镊子取出薄膜条投入染液510分钟，染色过程中不时轻轻晃动染色皿，使染色充分。7漂洗 从染液中取出薄膜条并尽量沥去染液，投入漂洗皿中反复漂洗，直至背景漂尽为止。此时清晰可见5条色带，待干。 8.定量（1）洗脱比色：将各蛋白质区带仔细剪下，分置各试管中，另从空白背景剪块平均大小的膜条置于空白管中。各管加入0.4mol/l NaOH 4ml,于37水浴20分钟（不时振荡），待颜色脱净即用波长620nm比色，以空白管调零读取各管吸光度。（2）计算 吸光度总和（T） =A+1+2+（吸光度）血清蛋白组分的相对百分数：A%=A/T100% 1%=1/T100% 2%=2/T100%=/T100% %=/T100%琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 Agarose Gel Electrophoresis概 述凝胶电泳：由琼脂、琼脂糖、淀粉胶及聚丙烯酰胺等物质作支持体的电泳。琼脂糖是从琼脂中提纯出来的，主要是由D半乳糖和3,6脱水L半乳糖连接而成的一种线性多糖。琼脂糖凝胶的制作是将干的琼脂糖悬浮于缓冲液中，通常使用的浓度是13，加热煮沸至溶液变为澄清，注入模板后室温下冷却凝聚即成琼脂糖凝胶。琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成较为稳定的交联结构，这种交联的结构使琼脂糖凝胶有较好的抗对流性质。琼脂糖凝胶的孔径可以通过琼脂糖的最初浓度来控制，低浓度的琼脂糖形成较大的孔径，而高浓度的琼脂糖形成较小的孔径。特点：1.可以制成非常均匀的凝胶，带电质点在凝胶的孔中泳动。2. 电泳操作方法简便，电泳速度快3. 分辨率高，重复性好，电泳图谱清晰。4. 适用于生化，免疫等定性定量测定琼脂糖凝胶的特点（一）优点1.因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗2.对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。3.凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合物、核酸、病毒 等大分子物质。4.透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定6.有热可逆性（二）缺点1.机械强度差，易破碎，浓度不能太低。2.易被细菌污染，不易保存，临用前配制。3.琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色。4.与PAGE相比，分子筛作用小，区带少。 应 用1. 适用于大分子的核酸、核蛋白等的分离、鉴定及纯化2. 临床生化检验中常用于LDH、CK等同工酶的分离与检测3. 为不同类型的高脂蛋白血症、冠心病等提供生化指标脂 蛋 白血清脂蛋白(lipoprotein)的组成 ApoA ApoB蛋白质：即载脂蛋白 ApoC ApoD ApoE 甘油三酯 （TG）脂类 磷脂 （PL） 游离胆固醇 （FC） 胆固醇酯 （CE）少量糖（二）分类1. 按电泳法分 乳糜微粒（chylomicron,CM） b-脂蛋白 （b-位） 前b-脂蛋白（a2-位） a-脂蛋白 （a1-位） 2. 按超速离心法分 乳糜微粒(chylomicron,CM) ( pI ，各种脂蛋白均带负电，电泳时由负极到正极；VLDL为圆形，受阻力小，LDL形态不规则，受阻力大，所以VLDL跑在前。血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳（实验）原理 血清脂蛋白经饱和乙酰苏丹黑B染色后，以琼脂糖凝胶为载体，在pH8.6巴比妥缓冲液中电泳分离，各种脂蛋白将分成不同区带。器材1.玻片2.水平式电泳仪试剂 1.0.5%琼脂糖（Agarose）溶液：称取0.5g琼脂糖，加巴比妥缓冲液100ml，盛于三角烧杯中，置沸水浴中煮沸溶解，备用。2.新鲜血清（无溶血）3.pH8.6、I=0.075 巴比妥缓冲液:称取15.4g巴比妥钠，2.76g巴比妥，0.292gEDTA，以水溶解后加至100ml，调pH至8.6，4保存。4.苏丹黑B染色液：苏丹黑B 100mg，异丙醇10ml，混合。置37水浴使之充分溶解后，离心取上清液置室温备用。操作1. 制板 配制0.5%的琼脂糖或预先配好置4冰箱，用时置沸水溶解，再冷却到5060，取约4ml琼脂糖迅速铺在玻璃片上，然后放上开槽器（注意：开槽放在中央，距一侧1.5cm处；避免产生气泡），静置室温待凝固，把开槽器小心取下，样品槽即制成。2. 加样 取预染血清20ml加入样品槽 （预染血清：血清0.2ml + 苏丹黑B染色液0.02ml）3. 电泳 将载有琼脂糖凝胶玻片（已加血清样品）放在电泳槽中，槽内倒入巴比妥缓冲液，用四层纱布搭板，加样端接负极，电压120V，待最前端区带泳动至玻片2/3处时可终止电泳，观察实验结果。参考值 正常人血清脂蛋白可分出三条区带： b脂蛋白（占55%，着色最深） 前b脂蛋白（占15%，着色最浅） a脂蛋白（占3040%，着色居中） 在原点处应无乳糜微粒可见聚丙烯酰胺凝胶电泳Polyacrylamide Gel Electrophoresis ，PAGE一、PAG 的 组成PAG是由丙烯酰胺（acrylamide，Acr）单体和N，N-亚甲双丙烯酰胺（N，N，N，N-methylene bixacrylamide，Bis）交联剂通过自由基聚合而成的一种多孔三维网状结构。Acr + Bis- 多孔三维网状结构 l （1）丙烯酰胺结构式（2）亚甲双丙烯酰胺二、PAG 的 聚 合需要催化剂氧化还原系统作用，使Acr单体带有游离基，从而与Bis进行聚合。 （一）化学聚合：AP-TEMED系统 过硫酸胺(NH4)2S2O8（Ammonium persulfate，AP）作为催化剂，四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。 AP在水溶液中能产生游离基SO42-，使丙烯酰胺单体的双键打开，活化形成自由基丙烯酰胺，然后游离Acr和Bis作用就能聚合形成凝胶。TEMED的游离碱基能促进AP的形成SO42- 。注意： TEMED量多少都会影响催化作用，须在碱性条件下聚合 分子氧存在，聚合不完全，须去除分子氧，隔绝氧 升高温度能提高聚合，降低温度能延迟聚合（二）光聚合：核黄素-TEMED系统核黄素（riboflavin）在光照下（可见光或紫外光）分解，其黄素部分被还原成无色型，但在有氧条件下无色型又被氧化成带有游离基的黄素，其也能使Acr和Bis聚合形成凝胶。注意：分离胶的合成一般采用化学聚合。因为若用光聚合，凝胶的孔径受光照强度与时间的影响，导致孔径大小不同，从而影响蛋白质的分离。三、PAG的浓度与孔径的关系PAG孔径的大小主要由Acr和Bis这两种单体的浓度决定。可以根据要分离物质分子的大小，选择合适的单体浓度。Acr/Bis：2040 完全透明且有弹性； 10 很脆，易碎，不透明； 100 糊状不成形，易破碎。凝胶总浓度T100ml凝胶溶液中含有Acr和 Bis的总克数。T=（a+b）/m100% T越大，凝胶孔径越小，适用于分离分子量较小的物质。 T越小，凝胶孔径越大，适用于分离分子量较大的物质。 常用的标准凝胶是指浓度为7.5%的凝胶，大多数生物体内的蛋白质在此凝胶中电泳，能获得满意的结果。CBis占单体与交联剂总量的百分比。C=b/（a+b）100%当T固定时，Bis浓度在5%时孔径最小。为了在使用凝胶做实验时有较高的重现性，制备凝胶所用的Acr浓度，Bis和Acr的比例、催化剂的浓度、聚合反应的溶液pH值、聚胶所需时间等能影响泳动率的因子都必须保持恒定。四、不 连 续 PAGE 按具体操作分 垂直板形电泳 圆盘电泳按凝胶系统的均匀性分 连续PAGE 不连续PAGE 电极槽缓冲液通常为pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液样品胶为T=3% C=20%单体欲分离的样品溶液pH6.7 Tris-HCl缓冲液混在一起，用光聚合方法聚合而成的大孔凝胶浓缩胶：除不加样品外，其余组成成分同样品胶相同分离胶：T=7%C=2.5%单体溶液pH8.9 Tris-HCl缓冲液化学聚合法聚合成小孔胶分 离 原 理1. 浓缩效应1）凝胶层的不连续性 两层凝胶T与C不同孔径不同 浓缩胶孔径大，分离胶孔径小，蛋白质在大孔径浓缩胶中移动，受阻力小，移动速度快。2）缓冲液离子成分的不连续性甘氨酸（pI=6.0）在pH8.3带负电，朝正极移动，进入浓缩胶（pH6.7），甘氨酸解离度（a）很小，有效迁移率（M a）很低，移动速度较慢，称为慢离子。HCl 是强电解质，a=1，Cl-有效迁移率大，移动速度快，称快离子。蛋白质（pI6.0）带负电荷，有效迁移率介于两者之间。 快离子很快移动到最前面，原来它停留在那部分地区则形成了低离子浓度区，即低电导区。低电导区有较高的电位梯度，就引起了电位梯度的突变。这种高电位梯度又使蛋白质阴离子和甘氨酸阴离子在此区域加速前进，追赶快离子。当快离子和慢离子的移动速度相等的稳定状态建立以后，快离子和慢离子之间造成一个不断向正极移动的界面。夹在快、慢离子间的样品蛋白质阴离子的移动界面就在这个追赶中逐渐被压缩，聚集成一条狭窄的区带。浓缩效应可使蛋白质浓缩数百倍。3）pH值的不连续性 为了控制慢离子的解离度，从而控制其有效迁移率，必须使浓缩胶与分离胶之间pH值有所区别。3.分子筛效应与电荷效应 进入分离胶后，Gly-成为快离子 分离胶只有电荷效应和分子筛效应，根据各蛋白质所带电荷不同、分子大小不同而分离凝胶的pH值明显增加,并导致甘氨酸的大量解离,有效泳动率增加.甘氨酸的分子量远小于蛋白质,它将赶上并超过各种蛋白质分子直接在氯离子后移动.这时,由于凝胶孔径变小,使蛋白质分子的迁移率减小,于是蛋白质分子在均一的电压梯度和pH环境中泳动,分子迁移速度与分子量大小和形状与其迁移率密切相关,分子量小且为球形的蛋白质分子所受阻力小,移动快,走在前面.五、PAGE 的 特 点1.具有分子筛效应，分辨率高2.样品不易扩散，用量少，灵敏度可达10-6g3.化学性质稳定，分子结构中富含酰胺基具有稳定的亲水基团4.凝胶不带电荷，消除了电渗现象5.机械强度好，有弹性，在一定浓度范围内无色透明6.网孔可调节 血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳（实验）原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）有连续和不连续电泳之分。不连续电泳系统由两种以上的缓冲液、pH值及不同的浓缩胶和分离胶组成，而连续电泳系统则仅由均一孔径的、同一浓度的凝胶所组成。不连续电泳系统电泳分离过程中包括三种物理效应，即样品的浓缩效应、电泳分离的电荷效应和凝胶的分子筛效应，而连续电泳系统电泳分离过程中则不具备浓缩效应。本次实验采用连续电泳系统PAGE，通过分子筛效应和电荷效应，将血清中各蛋白质组分按其分子大小、电荷多少不同进行分离。器材1.电泳仪2.凝胶玻管3.三角烧杯4.长针头试剂1.分离胶缓冲液：Tris 6.057g， EDTA 1.17g，加蒸馏水至100ml，调节pH至8.82.单体交联剂：Acr 30.0g，Bis 0.8g，加蒸馏水至100ml，4冰箱保存。3.加速剂：四甲基乙二胺（TEMED）4.催化剂：10%过硫酸铵（AP）5.电极缓冲液：0.4M硼砂缓冲液6.样品稀释液：分离胶缓冲液25ml+蔗糖10g+0.05%溴酚兰5ml，加蒸馏水至100ml。7.样品液：样品稀释液1.9ml+血清0.1ml8.固定液：12.5%三氯醋酸9.染色液：考马斯亮蓝 R-250 0.5g加90%乙醇90ml，冰乙酸 10ml， 用时稀释4倍。10.洗脱液： 冰乙酸38ml加甲醇125ml，加蒸馏水至500ml。11.保存液：7%冰乙酸操作1. 凝胶的制备（1）取玻管一支插入橡皮垫，垂直置于桌面上（2）配制分离胶，取三角烧杯，按下列程序加入各液，摇匀。总体积10ml，凝胶浓度为7.5%。 分离胶缓冲液 1.0ml 单体交联剂 2.1ml 蒸馏水 6.8ml AP 0.1ml TEMED 0.01ml（3）用滴管吸取分离胶沿壁加入凝胶至距玻管上端2.5cm处，小心在凝胶液上盖一层蒸馏水，加水时尽量避免冲击凝胶表面，待凝胶聚合后，倾去覆盖的水。2. 电泳（1）将凝胶玻管安装在电泳槽上槽圆孔中，使凝胶顶部恰好可见；（2）将电极缓冲液分别注入上、下槽中，并赶去凝胶玻管中的气泡。上槽应浸没凝胶玻管，下槽液面应超过凝胶管下端。（3）用微量注射器取样品1015ml，沿玻管壁加在凝胶面上，注意加样速度要慢，以不激起电极缓冲液为佳。（4）上下槽分别接负、正极，通电，开始用12mA/管，2分钟后增至35mA/管，示踪染料进入分离胶时，调节电流为2mA/管。直到示踪染料达到距管下口约0.5cm，断电。3.剥胶： 取下凝胶管，不要将玻管内的电泳液弃去，将长针头插入凝胶柱与管壁之间，旋转胶管，直到胶柱与管壁分开，用洗耳球在胶管一端轻轻加压，凝胶柱便徐徐从胶管中滑出。4.固定、染色将凝胶柱浸泡于12.5%三氯醋酸中0.51小时，然后转入染液中染色12小时，或90水浴中染色10 分钟。5.脱色、保存将已染色的凝胶柱置于7%醋酸溶液中浸洗，直到浸洗到染液无色为止。 6.观察结果等 电 聚 焦 电 泳Isoelectric Focusing Electrophoresis，IEFE一、定义60年代中期问世的一种利用pH梯度的介质分离等点电不同的蛋白质的电泳技术。IEFE对象只限于蛋白质和两性分子。二、特点（一）优点1.分辨率高（精密度可达0.01pH单位），灵敏度高（最低检出量达0.1ng），特别适用于分子量相同而电荷不同的两性大分子的分离。2.电泳区带相当狭窄3.重复性好（二）缺点1.要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋白质可能发生沉淀2.样品中的成分必须停留在其pI，不适用在pI不溶或发生变性的蛋白质三、基本原理在IEFE中，具有pH梯度的介质在通以直流电时，从阳极到阴极pH值逐渐增大。蛋白质分子具有两性解离及等点电的特性。这样在碱性区域蛋白质分子带负电荷向阳极移动，直至某一pH位点失去电荷而停止移动，此处介质pH恰好等于聚焦蛋白质的pI。同理，位于酸性区域的蛋白质分子带正电荷向阴极移动，直到在它们的pI上聚焦为止。 可见此种方法中，pI是蛋白质组分的特性量度，将pI不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场中经过一定时间后，各组分将分别聚焦在各自pI相应的位置上，形成分离的蛋白质区带。进行IEFE必须具备3个条件：有一个在电泳条件下基本稳定、重复性良好的pH梯度有一个抗对流的电泳材料，使已经分离的样品不再重新混合电泳后有适当的方法来鉴定分离的区带（一）pH梯度的建立是用多种两性电解质混合物来建立的 1.一个理想的载体两性电解质（Carrier ampholytes）应具备以下特点：分子量要小，以便与被分离大分子物质分离；化学性质稳定；各成分的pI彼此接近，并在其pI值附近有良好的缓冲能力；在pI处具有足够的电导，导电性均匀；两性电解质载体的数目要足够多可溶性好对280nm的紫外光没有或仅有很低的吸光度，不干扰样品的测定2.载体两性电解质的合成R1和R2为H或带有氨基的烷基合成产物是众多异构体和同系物的混合物，具有很多既不相同又相互连接的pI值。3.pH梯度的形成天然pH梯度的建立是在水平板或电泳管正负极间引入pI彼此接近的一系列两性电解质的混合物，在通电后，它们各自迁移到适当位置形成一个连续的pH梯度。正极端反应：6H2OO2+4H3O+4e-负极端反应：4H2O+4e-2H2+4OH-因此在负极会引起pH值的升高，在正极pH下降，另外在电极槽的正极端放的是酸性溶液，负极端放的是碱性溶液造成了在电极附近pH的急剧变化。（图a）由于载体两性电解质是一系列不同分子的两性电解质的混合物所组成的，设其中某一成分为A，它的pI=pH，当环境中的pHpH时，它带负电荷，朝正极移动。(图b) 当环境pI95%6.93HbA2222-3%7.38HbF222%6.98HbA36.87思考题1. PAGE与IEFE有何区别？2. 本实验的关键步骤是什么？SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE一、什么是SDS？十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate,SDS)是一种阴离子去污剂。它在水溶液中以单体（monomer）和分子团（micellae）的混合形式存在。SDS的作用破坏蛋白质分子之间以及其他物质分子之间的非共价键，使蛋白质变性而改变原有的构象，保证蛋白质分子与SDS充分结合而形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。一、SDS-PAGE的基本原理（一）蛋白质分子的解聚 样品介质和聚丙烯酰胺中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。1、SDS 阴离子去污剂 变性剂 助溶性试剂 断裂分子内和分子间的氢键 分子去折叠 破坏蛋白质分子的二级和三级结构2、强还原剂 巯基乙醇（-mercaptoethanal） 二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT） 使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。 SDS和还原剂的作用：（1）分子被解聚或组成它们的多肽键（2）氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负 电荷的蛋白质-SDS胶束。（3）蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超 过了蛋白质分子原有的电荷量，消除 了不同分子之间原有的电荷差异。蛋白质-SDS胶束的特点（1）形状像一个长椭圆棒（2）短轴对不同的蛋白质亚基-SDS胶束基本上是相同的。（3）长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比。胶束在SDS-PAGE系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于椭圆棒的长轴长度，即蛋白质或亚基分子量的大小。 当蛋白质的分子量在15KD200KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系3、影响SDS电泳的关键因素（1） 溶液中SDS单体浓度 大多数蛋白质与SDS结合的重量比为1：1.4（2） 样品缓冲液的离子强度 低离子强度的溶液中，SDS单体才具有较高的平衡浓度。（3） 二硫键是否完全被还原 当二硫键被彻底还原后，蛋白质分子才能被解聚，SDS才能定量地结合到亚基上而给出相对迁移率和分子量对数的线性关系。（二）缓冲系统的选择 一般情况下，在被分析的蛋白质稳定的pH范围，凡不与SDS发生相互作用的缓冲液都可以使用，但缓冲液的选择对蛋白质的分离和电泳的速度是非常关键的。电泳缓冲液的种类：1、磷酸缓冲液2、Tris-醋酸钠缓冲系统3、咪唑缓冲液系统： 比磷酸缓冲系统的导电性低，电泳速 度要比后者快一倍。4、尿素系统： 适用分子量低于15KD的蛋白样品。5、Tris-甘氨酸系统： 使用最多的缓冲液6、Tris-硼酸盐缓冲液： 测定糖蛋白的分子量（三）凝胶浓度的选择 由于SDS电泳分离并不取决于蛋白质的电荷密度，只取决于分子解聚后SDS-蛋白质胶束的大小，因此凝胶浓度的选择会直接影响分辨率。 不同分子量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度.（四）分子量测定1、相对迁移率（Rf） Rf即用每个带的迁移距离除以溴酚蓝前沿的迁移距离得到的。 测量位置应在蛋白带的中央。 蛋白带迁移距离Rf= 溴酚蓝迁移距离蛋白带迁移距离 固定前的凝胶长度 Rf= X 干燥后的凝胶长度 溴酚蓝迁移距离2、作图 以已知蛋白质分子量的常用对数值为纵坐标，Rf为横坐标绘图3、通过测定未知蛋白质的Rf值，便可在标 准曲线上读出他的分子量二、去污剂的选择无离子去污剂：Lubro W；Brij35， Tween Triton阳离子去污剂：cetyltrimethyl ammonium bromide （CTAB） cetylpyyridinium （CPC）阴离子去污剂：SDS deoxycholate三、方法1、分类根据对样品的处理方式的不同 还原SDS电泳 非还原SDS电泳 带有烷基化作用的还原SDS电泳2、操作（1） 制备分离胶（2） 制备积层胶(堆积胶）（3） 加样品样品的处理 在蛋白溶液中加入过量的SDS后，可引起以下的反应： 蛋白质本身的电荷被屏蔽 氢键断裂 疏水相互作用被取消 多肽被去折叠(二级结构破坏),并形成椭球形还原SDS处理 当加入还原试剂DTT或-二巯基乙醇后，蛋白质被完全去折叠，只根据分子量分离。带有烷基化作用的还原SDS处理 烷基化作用可以很好地并经久牢固地保护SH基团，而得到窄的电泳带。非还原的SDS处理 许多样品